면역조절 대사물질은 종양 미세환경(TME)의 핵심적인 특징이지만, 몇 가지 예외를 제외하고는 그 정체가 대부분 알려지지 않았습니다. 본 연구에서는 고등급 장액성 암종(HGSC) 환자의 종양 세포와 복수에서 분리한 T 세포를 분석하여 이러한 서로 다른 TME 구획의 대사체를 규명하고자 했습니다. 복수와 종양 세포는 대사물질 구성에서 상당한 차이를 보였습니다. 복수와 비교했을 때, 종양 침윤 T 세포에서는 1-메틸니코틴아미드(MNA)가 유의하게 풍부하게 존재했습니다. T 세포에서 MNA 수준이 증가했음에도 불구하고, 니코틴아미드 N-메틸트랜스퍼라제(S-아데노실메티오닌에서 니코틴아미드로 메틸기를 전달하는 반응을 촉매하는 효소)의 발현은 섬유아세포와 종양 세포에만 국한되었습니다. 기능적으로, MNA는 T 세포가 종양 촉진 사이토카인인 종양괴사 인자 알파(TNF-α)를 분비하도록 유도합니다. 따라서 TME 유래 MNA는 T 세포의 면역 조절에 기여하며 인간 암 치료를 위한 잠재적인 면역 치료 표적이 될 수 있다.
종양 유래 대사산물은 항종양 면역에 심각한 억제 효과를 미칠 수 있으며, 질병 진행의 주요 원동력이 될 수 있다는 증거가 점점 더 많아지고 있습니다(1). 바르부르크 효과 외에도, 최근 연구에서는 종양 세포의 대사 상태와 종양 미세환경(TME)의 면역 상태와의 관계를 규명하기 시작했습니다. 마우스 모델과 인간 T 세포에 대한 연구에서 글루타민 대사(2), 산화 대사(3), 포도당 대사(4)가 다양한 면역 세포 하위 그룹에 독립적으로 작용할 수 있음이 밝혀졌습니다. 이러한 경로의 여러 대사산물은 T 세포의 항종양 기능을 억제합니다. 보조효소인 테트라하이드로비오프테린(BH4)의 차단은 T 세포 증식을 저해할 수 있으며, 체내 BH4 증가는 CD4 및 CD8 매개 항종양 면역 반응을 강화할 수 있음이 입증되었습니다. 또한, 키누레닌의 면역억제 효과는 BH4 투여로 회복될 수 있습니다(5). 이소시트르산탈수소효소(IDH) 돌연변이 교모세포종에서, 이성질체 대사산물인 (R)-2-하이드록시글루타레이트(R-2-HG)의 분비는 T세포 활성화, 증식 및 세포 용해 활성을 억제합니다(6). 최근에는 해당 과정의 부산물인 메틸글리옥살이 골수 유래 억제 세포에서 생성되며, T세포에 메틸글리옥살이 전달되면 효과 T세포 기능이 억제될 수 있음이 밝혀졌습니다. 치료에서 메틸글리옥살을 중화시키면 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 활성을 억제하고 마우스 모델에서 면역관문 억제제 치료의 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있습니다(7). 이러한 연구들은 종합적으로 종양 미세환경(TME) 유래 대사산물이 T세포 기능 및 활성 조절에 중요한 역할을 한다는 점을 강조합니다.
난소암에서 T세포 기능 장애가 널리 보고되고 있다(8). 이는 부분적으로 저산소증과 비정상적인 종양 혈관 구조에 내재된 대사적 특성 때문인데(9), 이로 인해 포도당과 트립토판이 젖산과 키누레닌과 같은 부산물로 전환된다. 과도한 세포외 젖산은 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 감소시키고 골수 억제성 하위 그룹의 분화를 유도한다(10, 11). 트립토판의 소모는 T세포 증식을 직접적으로 억제하고 T세포 수용체 신호 전달을 저해한다(12-14). 이러한 관찰에도 불구하고, 면역 대사에 관한 많은 연구는 최적화된 배지를 사용한 시험관 내 T세포 배양에서 수행되었거나, 생체 내에서 동종 마우스 모델에 국한되어 진행되었는데, 이는 인간 암의 이질성과 생리적 거시 및 미시 환경을 충분히 반영하지 못한다.
난소암의 일반적인 특징 중 하나는 복막 전이와 복수 발생입니다. 복수에 세포액이 축적되는 것은 진행된 질병 및 불량한 예후와 관련이 있습니다(15). 보고에 따르면, 이 특수한 공간은 저산소 상태이며, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 수치가 높고, 조절 T 세포와 골수 억제 세포가 침윤되어 있습니다(15-18). 복수의 대사 환경은 종양 자체의 대사 환경과 다를 수 있으므로, 복강 내 T 세포의 재프로그래밍 기전은 아직 명확하지 않습니다. 또한, 복수와 종양 환경에 존재하는 대사물질 간의 주요 차이점과 이질성은 면역 세포의 침윤 및 종양에 대한 기능에 영향을 미칠 수 있으므로, 이에 대한 추가 연구가 필요합니다.
이러한 문제들을 해결하기 위해, 우리는 다양한 세포 유형(CD4+ 및 CD8+ T 세포 포함)과 종양 내외의 대사물질을 연구할 수 있는 민감한 세포 분리 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 개발했습니다. 이 방법은 환자의 동일한 복수 및 종양 환경 내 세포들에서 대사물질의 변화를 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 이 방법을 고차원 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 함께 사용하여 이러한 주요 세포 집단의 대사 상태를 고해상도로 분석했습니다. 이 방법을 통해 종양 T 세포에서 1-메틸니코틴아미드(MNA) 수치가 유의하게 증가함을 확인했으며, 시험관 내 실험을 통해 MNA가 T 세포 기능에 미치는 면역 조절 효과가 이전에는 알려지지 않았음을 보여주었습니다. 종합적으로, 이 방법은 종양과 면역 세포 간의 상호 대사적 상호작용을 밝히고, 면역 조절 대사물질에 대한 독창적인 통찰력을 제공하여 T 세포 기반 난소암 면역 치료의 가능성을 제시합니다.
우리는 고차원 유세포 분석법을 사용하여 포도당 흡수량[2-(N-(7-니트로페닐-2-옥사-1,3-디아자-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스(2-NBDG)]과 미토콘드리아 활성[MitoTracker Deep Red(MTDR)]을 동시에 정량화했습니다. 이들은 면역 세포와 종양 세포 집단을 구별하는 대표적인 마커입니다(7, 19, 20)(표 S2 및 그림 S1A). 이 분석 결과, T 세포와 비교했을 때 복수액과 종양 세포는 포도당 흡수량이 더 높았지만 미토콘드리아 활성에는 큰 차이가 없었습니다. 종양 세포[CD45-EpCAM(EpCAM)+]의 평균 포도당 흡수량은 T 세포의 3~4배였고, CD4+ T 세포의 평균 포도당 흡수량은 CD8+ T 세포의 1.2배였습니다. 이는 종양 침윤 림프구(TIL)가 동일한 종양 미세환경(TME) 내에서도 서로 다른 대사 요구를 가지고 있음을 나타냅니다(그림 1A). 반면, 종양 세포의 미토콘드리아 활성은 CD4+ T 세포와 유사하며, 두 세포 유형 모두 CD8+ T 세포보다 미토콘드리아 활성이 높다(그림 1B). 일반적으로 이러한 결과는 대사 수준을 나타낸다. 종양 세포의 대사 활성은 CD4+ T 세포보다 높고, CD4+ T 세포의 대사 활성은 CD8+ T 세포보다 높다. 이러한 세포 유형 간의 차이에도 불구하고, 복수와 종양에서 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 대사 상태 또는 상대적 비율에는 일관된 차이가 없다(그림 1C). 대조적으로, CD45- 세포 분획에서는 종양에서 EpCAM+ 세포의 비율이 복수에 비해 증가했다(그림 1D). 또한 EpCAM+ 세포와 EpCAM- 세포 구성 요소 간에 명확한 대사적 차이가 관찰되었다. EpCAM+ (종양) 세포는 EpCAM- 세포보다 포도당 흡수 및 미토콘드리아 활성이 더 높으며, 이는 TME 내 종양 세포의 섬유아세포 대사 활성보다 훨씬 높습니다(그림 1, E 및 F).
(A 및 B) CD4+ T 세포의 포도당 흡수(2-NBDG)의 중간 형광 강도(MFI) (A) 및 미토콘드리아 활성(MitoTracker 진홍색) (B) 대표 그래프(왼쪽) 및 표 데이터(오른쪽), 복수 및 종양에서 분리한 CD8+ T 세포 및 EpCAM+ CD45- 종양 세포. (C) 복수 및 종양에서 CD3+ T 세포 대비 CD4+ 및 CD8+ 세포의 비율. (D) 복수 및 종양에서 EpCAM+ 종양 세포(CD45−)의 비율. (E 및 F) EpCAM+ CD45- 종양 세포 및 EpCAM-CD45-기질 세포의 포도당 흡수(2-NBDG) (E) 및 미토콘드리아 활성(MitoTracker 진홍색) (F) 대표 그래프(왼쪽) 및 표 데이터(오른쪽) 복수 및 종양 세포. (G) 유세포 분석을 통한 CD25, CD137 및 PD1 발현의 대표 그래프. (H 및 I) CD4+ T 세포(H)와 CD8+ T 세포(I)에서의 CD25, CD137 및 PD1 발현. (J 및 K) CCR7 및 CD45RO 발현에 기반한 미분화(Naive), 중심 기억(Tcm), 효과기(Teff) 및 효과기 기억(Tem) 표현형. 복수 및 종양 내 CD4+ T 세포(J)와 CD8+ T 세포(K)의 대표 이미지(왼쪽) 및 표 데이터(오른쪽). P 값은 대응표본 t-검정으로 결정하였다(*P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001). 선은 매칭된 환자(n=6)를 나타낸다. FMO: 형광 마이너스 1; MFI: 중간 형광 강도.
추가 분석 결과, 고해상도 T 세포 표현형 상태 간에 다른 중요한 차이점들이 밝혀졌습니다. 종양 내 활성화된 T 세포(그림 1, G~I)와 효과기 기억 T 세포(그림 1, J 및 K)는 복수 내 CD3+ T 세포 비율보다 훨씬 더 빈번하게 나타났습니다. 마찬가지로, 활성화 마커(CD25 및 CD137)와 소멸 마커[프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD1)]의 발현을 통해 표현형을 분석한 결과, 이러한 세포 집단의 대사적 특성은 다르지만(그림 S1, B~E), 미분화, 효과기 또는 기억 T 세포 하위 집단 간에는 유의미한 대사적 차이가 일관되게 관찰되지 않았습니다(그림 S1, F~I). 이러한 결과는 세포 표현형을 자동으로 할당하는 기계 학습 방법을 사용하여 확인되었으며(21), 환자의 복수에서 다수의 골수 세포(CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+)가 존재함을 추가로 밝혀냈습니다(그림 S2A). 확인된 모든 세포 유형 중에서 이 골수 세포 집단은 가장 높은 포도당 흡수율과 미토콘드리아 활성을 보였다(그림 S2, B~G). 이러한 결과는 HGSC 환자의 복수와 종양에서 발견되는 다양한 세포 유형 간의 강력한 대사적 차이를 강조한다.
종양침윤림프구(TIL)의 대사체학적 특성을 이해하는 데 있어 가장 큰 어려움은 종양에서 충분한 순도, 품질 및 양의 T 세포 샘플을 분리하는 것입니다. 최근 연구에 따르면 유세포 분석기를 기반으로 한 세포 분류 및 비드 농축 방법이 세포 대사체 프로파일에 변화를 초래할 수 있음이 밝혀졌습니다(22-24). 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 LC-MS/MS 분석 전에 수술로 절제된 인간 난소암 조직에서 TIL을 분리하고 농축하는 비드 농축 방법을 최적화했습니다(재료 및 방법 참조, 그림 2A). 이 프로토콜이 대사체 변화에 미치는 전반적인 영향을 평가하기 위해, 비드 분리 단계를 거친 후 건강한 공여자로부터 활성화된 T 세포의 대사체 프로파일을 비드 분리를 하지 않고 얼음에 보관한 세포의 대사체 프로파일과 비교했습니다. 이 품질 관리 분석 결과, 두 조건 간에 높은 상관관계(r = 0.77)가 있었고, 86개 대사체 그룹의 기술적 재현성 또한 매우 높았습니다(그림 2B). 따라서 이러한 방법들은 세포 유형 농축 과정을 거치는 세포에서 정확한 대사물질 분석을 수행할 수 있으며, 이를 통해 HGSC에서 특정 대사물질을 식별하는 최초의 고해상도 플랫폼을 제공하여 세포 특이성 성 대사 프로그램에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다.
(A) 자기 비드 농축 과정의 개략도. LC-MS/MS 분석 전에 세포는 3회 연속 자기 비드 농축 과정을 거치거나 얼음 위에 보관됩니다. (B) 농축 방식이 대사물질 함량에 미치는 영향. 각 농축 방식에 대한 3회 측정값의 평균 ± 표준 오차(SE). 회색 선은 1:1 관계를 나타냅니다. 축 레이블에는 반복 측정의 급내 상관계수(ICC)가 표시되어 있습니다. NAD는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드입니다. (C) 환자 대사물질 분석 워크플로의 개략도. 환자로부터 복수 또는 종양을 채취하여 냉동 보존합니다. 각 샘플의 일부는 유세포 분석기로 분석하고, 나머지 샘플은 CD4+, CD8+, CD45- 세포를 3회 농축합니다. 이러한 세포 분획을 LC-MS/MS를 사용하여 분석합니다. (D) 표준화된 대사물질 함량의 히트맵. 덴드로그램은 샘플 간 유클리드 거리에 대한 Ward 클러스터링을 나타냅니다. (E) 샘플 대사체 지도의 주성분 분석(PCA) 결과. 각 샘플의 세 가지 반복 측정값을 보여주며, 동일 환자의 샘플은 선으로 연결되어 있다. (F) 환자를 조건으로 한 샘플의 대사체 프로파일에 대한 PCA 결과(부분 중복 사용). 샘플 유형은 볼록 껍질에 의해 제한된다. PC1은 주성분 1, PC2는 주성분 2이다.
다음으로, 이 농축 방법을 적용하여 HGSC 환자 6명의 원발성 복수 및 종양에서 CD4+, CD8+, CD45- 세포 분획에 존재하는 99가지 대사산물을 분석했습니다(그림 2C, 그림 S3A 및 표 S3, S4). 관심 대상 세포 집단은 원래의 대규모 생세포 샘플에서 2%에서 70%를 차지하며, 환자마다 세포 비율이 크게 다릅니다. 비드를 분리한 후, 농축된 관심 분획(CD4+, CD8+ 또는 CD45-)은 샘플 내 모든 생세포의 평균 85% 이상을 차지합니다. 이 농축 방법을 통해 대규모 샘플에서는 불가능했던 인간 종양 조직 대사의 세포 집단을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 잘 알려진 면역억제 대사산물인 l-키누레닌과 아데노신이 종양 T 세포 또는 종양 세포에서 증가되어 있음을 확인했습니다(그림 S3, B 및 C). 따라서 이러한 결과는 환자 조직에서 생물학적으로 중요한 대사 물질을 찾아내는 데 있어 당사의 세포 분리 및 질량 분석 기술의 정확성과 능력을 입증합니다.
본 분석 결과, 환자 내 및 환자 간 세포 유형별로 뚜렷한 대사적 분리가 관찰되었습니다(그림 2D 및 그림 S4A). 특히, 다른 환자들과 비교했을 때 70번 환자는 뚜렷한 대사적 특성을 보이지 않았으며(그림 2E 및 그림 S4B), 이는 환자 간 상당한 대사적 이질성이 존재함을 시사합니다. 주목할 만한 점은 다른 환자들의 복수량(1.2~2리터, 표 S1)에 비해 70번 환자의 복수량(80ml)이 적었다는 것입니다. 주성분 분석(예: 부분 중복 분석)을 통해 환자 간 이질성을 보정한 결과, 세포 유형 간에 일관된 변화가 나타났으며, 세포 유형 및/또는 미세환경이 대사체 프로파일에 따라 명확하게 집합되어 있음을 확인할 수 있었습니다(그림 2F). 개별 대사체 분석은 이러한 효과를 더욱 강조하며, 세포 유형과 미세환경 간의 유의미한 차이를 보여주었습니다. 관찰된 가장 극적인 차이는 MNA에서 나타나는데, 이는 일반적으로 CD45- 세포와 종양에 침윤하는 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 풍부하게 존재한다(그림 3A). CD4+ 세포에서 이러한 효과가 가장 뚜렷하게 나타나며, CD8+ 세포의 MNA 또한 주변 환경의 영향을 크게 받는 것으로 보인다. 그러나 6명의 환자 중 3명만이 종양 CD8+ 점수를 평가할 수 있었기 때문에 이는 중요한 결과는 아니다. MNA 외에도 복수와 종양 내 다양한 ​​유형의 세포에서 TIL에서 특성이 제대로 규명되지 않은 다른 대사물질들도 차등적으로 풍부하게 존재한다(그림 S3 및 S4). 따라서 이러한 데이터는 향후 연구에 유용한 면역 조절 대사물질들을 제시한다.
(A) 복수 및 종양의 CD4+, CD8+ 및 CD45- 세포에서 MNA의 정규화된 함량. 상자 그림은 중앙값(선), 사분위 범위(프레임 경첩) 및 사분위 범위의 1.5배까지의 데이터 범위(프레임 수염)를 보여줍니다. 환자 재료 및 방법에서 설명한 대로 환자의 limma 값을 사용하여 P 값을 결정합니다(*P<0.05 및 **P<0.01). (B) MNA 대사의 개략도(60). 대사산물: S-아데노실-1-메티오닌; SAH, S-아데노신-1-호모시스테인; NA, 니코틴아미드; MNA, 1-메틸니코틴아미드; 2-PY, 1-메틸-2-피리돈-5-카르복사미드; 4-PY, 1-메틸-4-피리돈-5-카르복사미드; NR, 니코틴아미드 리보스; NMN, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드. 효소(녹색): NNMT, 니코틴아미드 N-메틸트랜스퍼라제; SIRT, 시르투인; NAMPT, 니코틴아미드 포스포리보실 트랜스퍼라제; AOX1, 알데히드 산화효소 1; NRK, 니코틴아미드 리보사이드 키나제; NMNAT, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐레이트 트랜스퍼라제; Pnp1, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제. (C) 복수(회색) 및 종양(빨간색; 환자 3명)의 scRNA-seq에 대한 t-SNE 분석. (D) scRNA-seq를 이용하여 확인된 다양한 세포 집단에서의 NNMT 발현. (E) SK-OV-3, 인간 배아 신장(HEK) 293T, T 세포 및 MNA 처리 T 세포에서 NNMT 및 AOX1의 발현. SK-OV-3에 대한 상대적 발현 배율을 나타냈다. 발현 패턴과 표준오차(SEM)를 함께 나타냈다(건강한 공여자 6명). (F) Ct 값이 35보다 크면 검출 불가(UD)로 간주됩니다. SK-OV-3, HEK293T, T 세포 및 8mM MNA로 처리한 T 세포에서 SLC22A1 및 SLC22A2의 발현. SK-OV-3에 대한 상대적인 발현 배율을 나타냈습니다. 표준오차(SEM)를 포함한 발현 패턴을 보여줍니다(n = 6명의 건강한 공여자). Ct 값이 35보다 크면 검출 불가(UD)로 간주됩니다. (G) MNA와 함께 72시간 배양 후 활성화된 건강한 공여자 T 세포의 MNA 함량. 표준오차(SEM)를 포함한 발현 패턴을 보여줍니다(n = 4명의 건강한 공여자).
MNA는 니코틴아미드 N-메틸전달효소(NNMT)에 의해 S-아데노실-1-메티오닌(SAM)에서 니코틴아미드(NA)로 메틸기가 전달되어 생성됩니다(그림 3B). NNMT는 다양한 인간 암에서 과발현되며 증식, 침윤 및 전이와 관련이 있습니다(25-27). 종양 미세환경(TME) 내 T 세포에서 MNA의 근원을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 사용하여 고등급 장액성 난소암(HGSC) 환자 3명의 복수와 종양에서 세포 유형별 NNMT 발현을 분석했습니다(표 S5). 약 6,500개의 세포를 분석한 결과, 복수와 종양 환경에서 NNMT 발현은 섬유아세포와 종양 세포 집단에 국한되어 있음을 확인했습니다(그림 3, C 및 D). PTPRC(CD45+)를 발현하는 어떤 집단에서도 NNMT 발현이 명확하게 나타나지 않는다는 점에 주목할 필요가 있습니다(그림 3D 및 그림 S5A). 이는 대사체 스펙트럼에서 검출된 MNA가 T 세포로 유입되었음을 나타냅니다. MNA를 1-메틸-2-피리돈-5-카르복사미드(2-PYR) 또는 1-메틸-4-피리돈-5-카르복사미드(4-PYR)로 전환하는 알데히드 산화효소 1(AOX1)의 발현(그림 3B) 또한 COL1A1을 발현하는 섬유아세포 집단에만 국한되어 있습니다(그림 S5A). 이는 종합적으로 T 세포가 일반적인 MNA 대사 능력이 부족함을 시사합니다. 이러한 MNA 관련 유전자의 발현 패턴은 HGSC 환자의 복수에서 얻은 두 번째 독립적인 세포 데이터 세트를 사용하여 검증되었습니다(그림 S5B; n = 6)(16). 또한, MNA로 처리한 건강한 공여자 T 세포에 대한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석 결과, 대조군인 SK-OV-3 난소 종양 세포와 비교했을 때 NNMT 또는 AOX1이 거의 발현되지 않는 것으로 나타났습니다(그림 3E). 이러한 예상치 못한 결과는 MNA가 섬유아세포 또는 종양에서 종양 미세환경(TME) 내 인접한 T 세포로 분비될 수 있음을 시사합니다.
후보 물질에는 가용성 운반체 22(SLC22) 계열(SLC22A1, SLC22A2 및 SLC22A3)에 의해 암호화되는 유기 양이온 수송체 1~3(OCT1, OCT2 및 OCT3) 계열이 포함되지만, MNA의 잠재적 수송체는 아직 정의되지 않았습니다(28). 건강한 공여자 T 세포의 mRNA에서 QPCR을 수행한 결과 SLC22A1은 낮은 발현 수준을 보였지만 SLC22A2는 검출되지 않았으며, 이는 이전에 문헌에 보고된 내용과 일치함을 확인시켜 줍니다(그림 3F)(29). 이와 대조적으로 SK-OV-3 난소 종양 세포주는 두 수송체 모두 높은 수준으로 발현했습니다(그림 3F).
T 세포가 외래 MNA를 흡수할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 건강한 공여자의 T 세포를 다양한 농도의 MNA 존재 하에 72시간 동안 배양했습니다. 외인성 MNA가 없는 경우, 세포 내 MNA 함량은 검출되지 않았습니다(그림 3G). 그러나 외인성 MNA로 처리한 활성화된 T 세포에서는 세포 내 MNA 함량이 6 mM MNA까지 농도 의존적으로 증가했습니다(그림 3G). 이 결과는 수송체 발현 수준이 낮고 세포 내 MNA 대사에 관여하는 주요 효소가 부족함에도 불구하고 종양침윤림프구(TIL)가 MNA를 흡수할 수 있음을 시사합니다.
환자 T 세포의 대사산물 스펙트럼과 시험관 내 MNA 흡수 실험 결과는 암 관련 섬유아세포(CAF)가 MNA를 분비하고 종양 세포가 종양침윤림프구(TIL)의 표현형과 기능을 조절할 가능성을 시사합니다. MNA가 T 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 건강한 공여자의 T 세포를 MNA 존재 또는 부재 하에 시험관 내에서 활성화시키고 증식 및 사이토카인 생성을 평가했습니다. 최고 용량의 MNA를 7일 동안 첨가한 후, 세포 분열 횟수는 다소 감소했지만 활력은 모든 용량에서 유지되었습니다(그림 4A). 또한, 외인성 MNA 처리는 종양괴사 인자-α(TNFα)를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 증가시켰습니다(그림 4B). 대조적으로, 세포 내 IFN-γ 생성은 CD4+ T 세포에서는 유의하게 감소했지만 CD8+ T 세포에서는 변화가 없었으며, 인터루킨-2(IL-2)는 유의한 변화가 없었습니다(그림 4, C 및 D). 따라서, MNA로 처리한 T 세포 배양액 상층액에 대한 효소결합면역흡착법(ELISA) 분석 결과, TNFα는 유의하게 증가하고 IFN-γ는 감소했으며, IL-2는 변화가 없었다(그림 4, E~G). IFN-γ의 감소는 MNA가 T 세포의 항종양 활성을 억제하는 역할을 할 수 있음을 시사한다. MNA가 T 세포 매개 세포독성에 미치는 영향을 모사하기 위해, 건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 엽산 수용체 α를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포(FRα-CAR-T)와 녹색 형광 단백질(GFP)에 의해 조절되는 CAR-T 세포(GFP-CAR-T)를 생산하였다. CAR-T 세포를 MNA 존재 하에 24시간 배양한 후, 엽산 수용체 α를 발현하는 인간 SK-OV-3 난소암 세포와 10:1의 이펙터 대 타겟 비율로 공동 배양하였다. MNA 처리는 FRα-CAR-T 세포의 살상 활성을 유의미하게 감소시켰으며, 이는 아데노신으로 처리한 FRα-CAR-T 세포와 유사했습니다(그림 4H).
(A) 배양 7일째에 측정한 총 생존 세포 수 및 세포 분열 속도(PD). 막대 그래프는 건강한 공여자 6명의 평균값 ± 표준오차(SEM)를 나타냅니다. 최소 3회 이상의 독립적인 실험 결과를 나타냅니다. (B~D) CD3/CD28 및 IL-2를 각각의 MNA 농도로 7일 동안 T 세포를 활성화시켰습니다. 분석 전, 세포를 PMA/이오노마이신과 GolgiStop으로 4시간 동안 자극했습니다. (B) T 세포에서 TNFα 발현. 생세포에서 TNFα 발현의 예시 이미지(왼쪽)와 표 데이터(오른쪽). (C) T 세포에서 IFN-γ 및 (D) 발현. 사이토카인 발현은 유세포 분석법으로 측정했습니다. 막대 그래프는 평균값(n=6 건강한 공여자) ± 표준오차(SEM)를 나타냅니다. 일원 분산 분석 및 반복 측정(*P<0.05 및 **P<0.01)을 사용하여 P값을 결정했습니다. 최소 n=3회 독립 실험 결과를 나타냅니다. (E~G) CD3/CD28 및 IL-2를 사용하여 각각의 MNA 농도에서 7일 동안 T 세포를 활성화시켰습니다. 배양액은 PMA/이오노마이신 자극 전후 4시간 후에 수집했습니다. TNFα(E), IFN-γ(F) 및 IL-2(G)의 농도는 ELISA로 측정했습니다. 막대 그래프는 평균값(n=5 건강한 공여자) ± 표준오차(SEM)를 나타냅니다. P값은 일원 분산 분석 및 반복 측정을 사용하여 결정했습니다(*P<0.05). 점선은 검출 한계를 나타냅니다. (H) 세포 용해 분석. FRα-CAR-T 또는 GFP-CAR-T 세포를 아데노신(250μM) 또는 MNA(10mM)로 24시간 처리하거나, 처리하지 않은 대조군(Ctrl)으로 두었습니다. SK-OV-3 세포의 사멸률을 측정했습니다. P값은 Welch t 검정을 통해 결정되었습니다(*P<0.5 및 **P<0.01).
MNA 의존적인 TNFα 발현 조절에 대한 기전적 이해를 얻기 위해 MNA로 처리한 T 세포의 TNFα mRNA 변화를 평가했습니다(그림 5A). 건강한 공여자 T 세포를 MNA로 처리했을 때 TNFα 전사 수준이 두 배 증가했는데, 이는 MNA가 TNFα 전사 조절에 의존한다는 것을 나타냅니다. 이러한 조절 기전을 조사하기 위해 TNFα를 조절하는 것으로 알려진 두 가지 전사 인자인 활성화 T 세포 핵인자(NFAT)와 특이 단백질 1(Sp1)을 MNA가 근위 TNFα 프로모터에 결합하는 것에 대한 반응으로 평가했습니다(30). TNFα 프로모터에는 6개의 NFAT 결합 부위와 2개의 Sp1 결합 부위가 있으며, 이들은 한 부위[5'캡에서 -55 염기쌍(bp)]에서 겹칩니다(30). 크로마틴 면역침전(ChIP) 분석 결과, MNA로 처리했을 때 Sp1의 TNFα 프로모터 결합이 세 배 증가했습니다. NFAT의 통합 또한 증가하여 중요도에 근접했습니다(그림 5B). 이러한 데이터는 MNA가 Sp1 전사를 통해 TNFα의 발현을 조절하고, 더 적은 정도로 NFAT의 발현도 조절한다는 것을 나타냅니다.
(A) MNA 없이 배양한 T 세포와 비교했을 때, MNA를 처리한 T 세포에서 TNFα 발현의 변화율을 나타냈다. SEM으로 발현 양상을 나타냈다(n = 5명의 건강한 공여자). 최소 3회 이상의 독립적인 실험 결과를 나타낸다. (B) NFAT와 Sp1을 함께 발현시킨 후, 8 mM MNA를 처리하거나 처리하지 않은 T 세포에서 TNFα 프로모터의 발현을 측정하였다(대조군). 면역침전법의 음성 및 양성 대조군으로 각각 IgG와 H3를 사용하였다. ChIP 정량 분석 ​​결과, MNA 처리 세포에서 Sp1과 NFAT의 TNFα 프로모터 결합이 대조군에 비해 수 배 증가함을 나타냈다. 최소 3회 이상의 독립적인 실험 결과를 나타낸다. P값은 다중 t-검정을 통해 산출하였다(*** P <0.01). (C) HGSC 복수와 비교했을 때, 종양 내 T 세포(비세포독성)에서 TNFα 발현이 증가함을 나타냈다. 색상은 서로 다른 환자를 나타냅니다. 표시된 세포는 300개로 무작위 샘플링되었으며, 과도한 데이터 수집을 방지하기 위해 미세 조정(** Padj = 0.0076)을 거쳤습니다. (D) 난소암에 대한 MNA의 제안 모델. MNA는 종양 미세환경(TME) 내 종양 세포와 섬유아세포에서 생성되어 T 세포에 흡수됩니다. MNA는 Sp1과 TNFα 프로모터의 결합을 증가시켜 TNFα 전사 및 TNFα 사이토카인 생성을 촉진합니다. 또한 MNA는 IFN-γ를 감소시킵니다. T 세포 기능 억제는 종양 세포 사멸 능력 감소 및 종양 성장 촉진으로 이어집니다.
보고에 따르면, TNFα는 전방 및 후방 의존적인 항종양 효과를 나타내지만, 난소암의 성장과 전이를 촉진하는 역할도 하는 것으로 잘 알려져 있습니다(31-33). 또한, 난소암 환자의 복수 및 종양 조직에서 TNFα 농도가 양성 조직보다 높다는 보고도 있습니다(34-36). 기전적으로 TNFα는 백혈구의 활성화, 기능 및 증식을 조절하고 암세포의 표현형을 변화시킬 수 있습니다(37, 38). 이러한 결과와 일관되게, 차등 유전자 발현 분석 결과 종양 조직의 T 세포에서 TNFα 발현이 복수 조직에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5C). TNFα 발현 증가는 비세포독성 표현형을 가진 T 세포 집단에서만 뚜렷하게 관찰되었습니다(그림 S5A). 요컨대, 이러한 데이터는 MNA가 고등급 장액성 난소암(HGSC)에서 면역억제 효과와 종양 촉진 효과를 동시에 나타낸다는 견해를 뒷받침합니다.
유세포 분석법에 기반한 형광 표지법은 종양침윤림프구(TIL) 대사 연구의 주요 방법으로 자리 잡았습니다. 이러한 연구들은 말초혈액 림프구 또는 이차 림프기관의 T 세포와 비교했을 때, 생쥐와 인간의 TIL이 포도당 흡수 경향이 더 높고(4, 39) 미토콘드리아 기능이 점진적으로 저하됨을 보여주었습니다(19, 40). 본 연구에서도 유사한 결과를 관찰했지만, 핵심은 동일한 절제된 종양 조직에서 유래한 종양 세포와 TIL의 대사를 비교했다는 점입니다. 이전 연구 결과와 일관되게, 복수와 종양에서 유래한 종양 세포(CD45-EpCAM+)는 CD8+ 및 CD4+ T 세포보다 포도당 흡수율이 높았으며, 이는 종양 세포의 높은 포도당 흡수율이 T 세포와 경쟁할 수 있음을 시사합니다. 종양 미세환경(TME)에서 종양 세포의 미토콘드리아 활성은 CD8+ T 세포보다 높지만, CD4+ T 세포와는 유사한 수준입니다. 이러한 결과는 산화 대사가 종양 세포에 중요하다는 새로운 주제를 뒷받침합니다(41, 42). 또한 CD8+ T 세포가 CD4+ T 세포보다 산화 기능 장애에 더 취약하거나, CD4+ T 세포가 미토콘드리아 활성을 유지하기 위해 포도당 이외의 탄소원을 사용할 수 있음을 시사합니다(43, 44). 주목할 점은 복수액에서 CD4+ T 효과기 세포, T 효과기 기억 세포, T 중심 기억 세포 간의 포도당 흡수 또는 미토콘드리아 활성에 차이가 관찰되지 않았다는 것입니다. 마찬가지로, 종양 내 CD8+ T 세포의 분화 상태는 포도당 흡수 변화와 관련이 없으며, 이는 시험관 내 배양된 T 세포와 생체 내 인간 종양침윤림프구(TIL) 간의 상당한 차이를 강조합니다(22). 이러한 관찰 결과는 편향되지 않은 자동 세포 집단 할당을 사용하여 확인되었으며, 이를 통해 종양 세포보다 포도당 흡수 및 미토콘드리아 활성이 높은 CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ 세포가 우세하지만 대사적으로 활성적인 세포 집단임을 추가로 밝혀냈습니다. 이 집단은 scRNA-seq 분석에서 확인된 골수 억제 세포 또는 형질세포양 수지상 세포의 추정 하위 집단을 나타낼 수 있습니다. 비록 이 두 세포가 인간 난소 종양에서 보고되었지만[45], 이 골수 하위 집단을 설명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
유세포 분석 기반 방법은 세포 유형 간의 포도당 및 산화 대사의 일반적인 차이를 명확히 할 수 있지만, 종양 미세환경(TME)에서 미토콘드리아 대사를 위해 포도당 또는 기타 탄소원으로부터 생성되는 정확한 대사산물은 아직 밝혀지지 않았습니다. 특정 종양침윤림프구(TIL) 하위 집단에 대사산물의 존재 여부를 할당하려면 절제된 조직에서 세포 집단을 정제해야 합니다. 따라서 질량 분석법과 결합된 본 연구의 세포 농축 방법은 환자 샘플에서 T 세포와 종양 세포 집단에 차등적으로 농축되는 대사산물에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 형광 활성 세포 분류(FACS)에 비해 장점이 있지만, 특정 대사산물 라이브러리는 고유한 안정성 및/또는 빠른 회전율로 인해 영향을 받을 수 있습니다(22). 그럼에도 불구하고, 본 연구 방법은 샘플 유형에 따라 크게 변하는 두 가지 면역억제 대사산물인 아데노신과 키누레닌을 식별할 수 있었습니다.
종양 및 TIL 아형에 대한 대사체 분석은 난소 종양 미세환경(TME)에서 대사물질의 역할에 대한 더 많은 통찰력을 제공합니다. 첫째, 유세포 분석을 통해 종양과 CD4+ T 세포 간의 미토콘드리아 활성에는 차이가 없음을 확인했습니다. 그러나 LC-MS/MS 분석 결과, 이들 집단 간에 대사물질의 풍부도에 유의미한 차이가 나타났으며, 이는 TIL 대사 및 전반적인 대사 활동에 대한 결론을 신중하게 해석해야 함을 시사합니다. 둘째, MNA는 종양이 아닌 복수 내 CD45- 세포와 T 세포 간에 가장 큰 차이를 보이는 대사물질입니다. 따라서 구획화 및 종양 위치는 TIL 대사에 서로 다른 영향을 미칠 수 있으며, 이는 특정 미세환경 내에서도 이질성이 존재할 가능성을 강조합니다. 셋째, MNA 생성 효소인 NNMT의 발현은 주로 종양 관련 섬유아세포(CAF)에 국한되며, 종양 세포에서는 상대적으로 적게 발현되지만, 종양 유래 T 세포에서도 검출 가능한 수준의 MNA가 관찰되었습니다. 난소 CAF에서 NNMT의 과발현은 CAF 대사 촉진, 종양 침윤 및 전이 촉진 등 여러 요인에 의해 암을 촉진하는 것으로 알려져 있다(27). TIL의 전체 수준은 중간 정도이지만, CAF에서 NNMT의 발현은 암 게놈 아틀라스(TCGA)의 중간엽 아형과 밀접한 관련이 있으며, 이는 불량한 예후와 연관되어 있다(27, 46, 47). 마지막으로, MNA 분해를 담당하는 효소인 AOX1의 발현 또한 CAF ​​집단에만 국한되어 있다는 점은 T 세포가 MNA를 대사할 능력이 부족함을 시사한다. 이러한 결과는 추가 연구를 통해 검증이 필요하지만, T 세포에서 높은 수준의 MNA가 면역억제성 CAF 미세환경의 존재를 나타낼 수 있다는 생각을 뒷받침한다.
MNA 수송체의 발현 수준이 낮고 MNA 대사에 관여하는 주요 단백질들이 검출되지 않는 점을 고려할 때, T 세포에서 MNA가 발견된 것은 예상치 못한 결과입니다. 두 개의 독립적인 코호트에서 수행된 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석과 표적 qPCR 분석 모두에서 NNMT와 AOX1이 검출되지 않았습니다. 이러한 결과는 MNA가 T 세포에서 합성되는 것이 아니라 주변 종양 미세환경(TME)으로부터 흡수된다는 것을 시사합니다. 시험관 내 실험에서는 T 세포가 외부에서 공급된 MNA를 축적하는 경향이 있는 것으로 나타났습니다.
시험관 내 연구에서 외인성 MNA가 T 세포에서 TNFα 발현을 유도하고 Sp1과 TNFα 프로모터의 결합을 강화하는 것으로 나타났습니다. TNFα는 항종양 및 억제 기능을 모두 가지고 있지만, 난소암에서는 오히려 종양 성장을 촉진할 수 있습니다(31-33). 난소 종양 세포 배양에서 TNFα를 중화시키거나 마우스 모델에서 TNFα 신호를 제거하면 TNFα 매개 염증성 사이토카인 생성이 증가하고 종양 성장이 억제됩니다(32, 35). 따라서 이 경우, 종양 미세환경(TME)에서 유래한 MNA는 자가분비 루프를 통해 TNFα 의존적 기전으로 염증 유발 대사산물로 작용하여 난소암의 발생 및 확산을 촉진할 수 있습니다(31). 이러한 가능성을 바탕으로 TNFα 차단은 난소암 치료를 위한 잠재적 치료제로 연구되고 있습니다(37, 48, 49). 또한, MNA는 난소 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포독성을 저해하여 MNA 매개 면역 억제에 대한 추가적인 증거를 제공합니다. 이러한 결과들을 종합하면, 종양 세포와 CAF 세포가 세포외 종양 미세환경(TME)으로 MNA를 분비하는 모델을 제시합니다. 이는 (i) TNF 유도 난소암 성장 촉진 및 (ii) MNA 유도 T 세포 세포독성 활성 억제를 통해 이중적인 종양 효과를 나타낼 수 있습니다(그림 5D).
결론적으로, 본 연구는 신속한 세포 농축, 단일 세포 시퀀싱 및 대사 프로파일링을 결합하여 HGSC 환자의 종양 세포와 복수 세포 간의 면역대사체학적 차이가 매우 크다는 것을 밝혀냈습니다. 이러한 종합적인 분석을 통해 T 세포 간 포도당 흡수 및 미토콘드리아 활성에 차이가 있음을 확인하고, MNA를 비세포 자율적 면역 조절 대사물질로 규명했습니다. 이러한 결과는 인간 암에서 종양 미세환경(TME)이 T 세포 대사에 미치는 영향에 대한 중요한 시사점을 제공합니다. T 세포와 암세포 간의 영양소에 대한 직접적인 경쟁은 이미 보고되었지만, 대사물질 또한 간접적인 조절인자로서 작용하여 종양 진행을 촉진하고 내인성 면역 반응을 억제할 수 있습니다. 이러한 조절 대사물질의 기능적 역할에 대한 심층적인 연구는 항종양 면역 반응을 강화하는 새로운 전략을 제시할 수 있을 것입니다.
환자 검체 및 임상 데이터는 캐나다 조직 저장소 네트워크(Canadian Tissue Repository Network)에서 인증한 BC 암 종양 조직 저장소를 통해 확보했습니다. BC 암 연구 윤리위원회와 브리티시컬럼비아 대학교(H07-00463)에서 승인한 프로토콜에 따라, 모든 환자의 검체 및 임상 데이터는 서면 동의를 받거나 동의를 공식적으로 면제받은 후 수집되었습니다. 샘플은 인증된 바이오뱅크(BRC-00290)에 보관되어 있습니다. 자세한 환자 특성은 표 S1 및 S5에 제시되어 있습니다. 냉동 보존을 위해, 메스를 사용하여 환자의 종양 샘플을 기계적으로 분해한 후 100마이크론 필터를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻었습니다. 환자의 복수는 4°C에서 10분 동안 1500rpm으로 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거했습니다. 종양 및 복수에서 얻은 세포를 50% 열처리 불활성화 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 배지(Thermo Fisher Scientific) 및 10% 디메틸 설폭사이드 용액에 넣어 냉동 보존하였다. 이렇게 보존된 단일 세포 현탁액을 해동하여 아래에 설명된 대사체 분석 및 대사물질 측정에 사용하였다.
완전 배지는 0.22 μm 필터로 여과한 50:50 비율의 RPMI 1640:AimV로 구성됩니다. RPMI 1640 + 2.05 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific)에 10% 열처리 불활성화 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes(Thermo Fisher Scientific), 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific), 1 x 페니실린-스트렙토마이신(PenStrep) 용액(Thermo Fisher Scientific) 및 50 μM M-메르캅토에탄올을 첨가한 것입니다. AimV(Invitrogen)에는 20 mM Hepes(Thermo Fisher Scientific)와 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific)이 첨가되어 있습니다. 유세포 분석기 염색 완충액은 0.22μm 필터로 여과한 인산염 완충 용액(PBS; Invitrogen)에 3% 열처리 불활성화 AB형 인간 혈청(Sigma)을 첨가하여 제조하였다. 세포 농축 완충액은 0.22μm 필터로 여과한 PBS에 0.5% 열처리 불활성화 AB형 인간 혈청(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 제조하였다.
37°C의 완전 배지에서 세포를 10 nM MT DR과 100 μM 2-NBDG로 30분 동안 염색했습니다. 다음으로, 세포를 생존율 염색 시약 eF506으로 4°C에서 15분 동안 염색했습니다. 세포를 FC Block(eBioscience)과 Brilliant Stain Buffer(BD Biosciences)에 재현탁하고, 유세포 분석기 염색 완충액(제조사 지침에 따름)으로 희석한 후 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 유세포 분석기 염색 완충액에 항체 세트(표 S2)를 넣고 4°C에서 20분 동안 세포를 염색했습니다. 분석 전에 세포를 유세포 분석기 염색 완충액(Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R 구성)에 재현탁했습니다. SpectroFlo와 FlowJo V10을 사용하여 세포 수 데이터를 분석하고, GraphPad Prism 8을 사용하여 데이터를 생성했습니다. 2-NBDG와 MT DR의 중간 형광 강도(MFI)는 로그 정규화되었고, 이후 대응 환자를 고려하여 대응표본 t 검정을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 분석에서 이벤트 수가 40개 미만인 모든 집단을 제외하고, 통계 분석 및 데이터 시각화를 수행하기 전에 모든 음수 값에는 MFI 값을 1로 입력했습니다.
위의 프로세스 패널의 수동 게이팅 전략을 보완하기 위해 FlowJo에서 죽은 세포를 제거한 후 세포를 집단에 자동으로 할당하기 위해 모양 제한 트리(FAUST)(21)의 전체 주석을 사용했습니다. 잘못 할당된 것으로 보이는 집단(PD1+ 종양 세포와 PD1- 종양 세포를 결합)과 유지된 집단을 병합하기 위해 출력을 수동으로 관리했습니다. 각 샘플에는 평균 2% 이상의 세포가 포함되어 총 11개의 집단이 있습니다.
Ficoll 밀도 구배 원심분리를 이용하여 PBMC를 백혈구 분리 산물(STEMCELL Technologies)로부터 분리하였다. CD8+ T 세포는 CD8 MicroBeads(Miltenyi)를 사용하여 PBMC에서 분리하고, 제조사의 지침에 따라 TransAct(Miltenyi)를 첨가한 완전 배지에서 2주간 배양하여 증식시켰다. 세포를 IL-7(10 ng/ml; PeproTech)이 함유된 완전 배지에서 5일간 배양한 후, TransAct로 재자극하였다. 7일째 되는 날, 제조사의 지침에 따라 인간 CD45 MicroBeads(Miltenyi)를 사용하여 3회에 걸쳐 세포를 농축하였다. 세포를 유세포 분석(상기 설명 참조)을 위해 분주하고, LC-MS/MS 분석을 위해 100만 개의 세포를 3회에 걸쳐 분주하였다. LC-MS/MS 분석은 아래에 설명된 방법으로 수행하였다. 누락된 대사물질 값은 이온 번호 1,000을 기준으로 추정하였다. 각 샘플은 총 이온 수(TIC)로 정규화되고, 로그 변환된 후 분석 전에 MetaboAnalystR에서 자동으로 정규화됩니다.
각 환자의 단일 세포 현탁액을 해동한 후 40μm 필터를 통과시켜 완전 배지(상기 설명 참조)에 여과했습니다. 제조사 프로토콜에 따라 MicroBeads(Miltenyi)를 사용한 자기 비드 분리법을 3회 연속 적용하여 CD8+, CD4+, CD45- 세포를 농축했습니다(얼음 위에서). 간단히 설명하면, 세포를 세포 농축 완충액(상기 설명 참조)에 재현탁하고 계수했습니다. 세포를 인간 CD8 비드, 인간 CD4 비드 또는 인간 CD45 비드(Miltenyi)와 함께 4°C에서 15분 동안 배양한 후 세포 농축 완충액으로 세척했습니다. 샘플을 LS 컬럼(Miltenyi)에 통과시켜 양성 및 음성 분획을 수집했습니다. 세포 회수율을 극대화하고 소요 시간을 줄이기 위해 CD8- 분획은 두 번째 CD4+ 농축에 사용하고, CD4- 분획은 후속 CD45- 농축에 사용했습니다. 분리 과정 내내 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
대사물질 분석을 위한 시료 준비를 위해 세포를 얼음처럼 차가운 염용액으로 한 번 세척한 후, 각 시료에 80% 메탄올 1ml를 첨가하고 볼텍싱한 다음 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 시료는 3회의 동결-해동 과정을 거친 후 4°C에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리했다. 대사물질이 포함된 상층액을 건조될 때까지 증발시켰다. 대사물질을 0.03% 포름산 50μl에 다시 녹이고 볼텍싱하여 혼합한 후 원심분리하여 잔여물을 제거했다.
위에서 설명한 대로 대사체를 추출합니다. 상층액을 고성능 액체 크로마토그래피 병으로 옮겨 대사체학 연구를 수행합니다. 배치 효과를 방지하기 위해 각 샘플을 비슷한 수의 세포로 처리하도록 무작위 처리 프로토콜을 사용합니다. 우리는 AB SCIEX QTRAP 5500 트리플 사중극자 질량 분석기(50)에서 이전에 발표된 전체 대사체에 대한 정성적 평가를 수행했습니다. 크로마토그래피 분석 및 피크 면적 적분은 MultiQuant 버전 2.1 소프트웨어(Applied Biosystems SCIEX)를 사용하여 수행했습니다.
누락된 대사체 값을 추정하기 위해 1000의 이온 카운트를 사용했으며, 각 샘플의 TIC를 사용하여 검출된 각 대사체의 정규화된 피크 면적을 계산하여 샘플 처리에서 기기 분석에 의해 도입된 변화를 보정했습니다. TIC가 정규화된 후 MetaboAnalystR(51)(기본 매개변수)을 사용하여 로그 변환 및 자동 정규화 라인 스케일링을 수행했습니다. vegan R 패키지를 사용하여 PCA를 수행하여 샘플 유형 간의 대사체 차이에 대한 탐색적 분석을 수행하고 부분 중복 분석을 사용하여 환자를 분석했습니다. Ward 방법을 사용하여 샘플 간의 유클리드 거리를 클러스터링하는 히트맵 덴드로그램을 구성했습니다. 표준화된 대사체 풍부도에 limma(52)를 사용하여 전체 세포 유형 및 미세환경에 걸쳐 차등적으로 풍부한 대사체를 식별했습니다. 설명을 단순화하기 위해 그룹 평균 매개변수를 사용하여 모델을 지정하고 미세환경의 세포 유형을 각 그룹(n = 6개 그룹)으로 간주했습니다. 유의성 검정을 위해 각 대사물질에 대해 3회 반복 측정을 수행했습니다. 잘못된 반복 측정을 방지하기 위해 환자를 limma 설계에 장애물로 포함시켰습니다. 서로 다른 환자 간의 대사물질 차이를 확인하기 위해 환자를 고정된 방식으로 포함하는 limma 모델을 조정했습니다. 세포 유형과 미세환경 간의 사전 정의된 대비의 유의성은 Padj <0.05(Benjamini-Hochberg 보정)인 경우로 보고합니다.
밀테니 사멸세포 제거 키트(Miltenyi Dead Cell Removal Kit)를 사용하여 활력 증진(생존율 80% 이상) 후, 10배율 5' 유전자 발현 프로토콜을 이용하여 냉동 보관된 전체 생존 복수 및 종양 샘플에 대해 단일 세포 전사체 시퀀싱을 수행했습니다. 종양과 복수가 일치하는 5건의 사례를 분석했지만, 한 종양 샘플의 생존율이 낮아 분석에 포함하지 못했습니다. 여러 환자를 선별하기 위해 각 환자의 샘플을 10배율 크롬 컨트롤러의 레인에 혼합하고 복수와 종양 부위를 별도로 분석했습니다. 시퀀싱 후 [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; 종양과 복수에서 각각 세포당 평균 73,488개와 41,378개의 리드를 얻었으므로 CellSNP와 Vireo(53)를 사용했습니다. CellSNP는 GRCh38에서 제공하는 공통 인간 SNP(VCF)에 기증자 신원을 할당합니다. SNPRelate를 사용하여 환자의 유전자형 상태(IBS)와 가장 가까운 신원(IBS)을 추론하고, 할당되지 않은 세포와 이중체로 식별된 세포를 제외하고 복수와 종양 샘플 간의 기증자를 일치시킵니다(54). 이 작업을 기반으로 종양과 복수에서 세포 표현이 풍부한 세 가지 사례를 하위 분석을 위해 유지했습니다. scater(55) 및 scran(56) BioConductor 패키징에서 대량 필터링 단계를 수행한 후 분석을 위해 6975개의 세포(종양과 복수에서 각각 2792개와 4183개)를 얻었습니다. igraph(57)의 공유 최근접 이웃 네트워크의 Louvain 클러스터링을 사용합니다. (SNN)은 발현에 따라 세포를 클러스터링하기 위한 Jaccard 거리를 기반으로 합니다. 클러스터는 마커 유전자 발현을 기반으로 추정 세포 유형으로 수동으로 주석 처리되었으며 t-SNE를 사용하여 시각화되었습니다. 세포독성 T 세포는 CD8A 및 GZMA 발현으로 정의되며, 리보솜 단백질 발현이 낮은 하위 클러스터는 제외됩니다. 우리는 Izar et al.(16)의 공개된 데이터를 활용했으며, 여기에는 t-SNE 임베딩이 포함되어 있어 면역 세포 마커와 NNMT 발현 간의 발현 중복을 제어할 수 있습니다.
PBMC는 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 백혈구 분리 제품(STEMCELL Technologies)으로부터 분리했습니다. CD3+ 세포는 CD3 비드(Miltenyi)를 사용하여 PBMC에서 분리했습니다. MNA 존재 또는 부재 하에, CD3+ 세포는 플레이트 결합형 CD3(5μg/ml), 가용성 CD28(3μg/ml) 및 IL-2(300U/ml; Proleukin)로 활성화시켰습니다. 배양 마지막 날, 세포 생존율(Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) 및 증식률(123count eBeads, Thermo Fisher Scientific)을 유세포 분석기로 평가했습니다. GolgiStop을 이용하여 PMA(20 ng/ml)와 이오노마이신(1 μg/ml)으로 세포를 4시간 동안 자극하여 이펙터 기능을 평가하고, CD8-PerCP(RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700(RPA-T4, BioLegend) 및 TNFα-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(MAb11, BD)를 측정하였다. qPCR 및 ChIP 분석을 위해 PMA(20 ng/ml)와 이오노마이신(1 μg/ml)으로 세포를 4시간 동안 자극하였다. ELISA 상층액은 PMA(20 ng/ml)와 이오노마이신(1 μg/ml)으로 4시간 동안 자극하기 전과 후에 수집하였다.
RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 RNA를 분리합니다. QIAshredder(QIAGEN)를 사용하여 샘플을 균질화합니다. 고용량 RNA-cDNA 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성합니다. TaqMan Rapid Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 다음 프로브로 유전자 발현량을 정량화합니다(제조사 프로토콜에 따름): Hs00196287_m1(NNMT), Hs00154079_m1(AOX1), Hs00427552_m1(SLC22A1), Hs02786624_g1[GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen)] 및 Hs01010726_m1(SLC22A2). 샘플은 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)과 MicroAmp 광학 필름이 장착된 MicroAmp fast optical 96웰 반응 플레이트(Applied Biosystems)를 사용하여 분석했습니다. Ct 값이 35를 초과하는 경우 검출 한계 이상으로 간주하여 검출 불가로 표시했습니다.
이전에 설명한 대로 ChIP를 수행했습니다(58). 간단히 말하면, 세포를 포름알데히드(최종 농도 1.42%)로 처리하고 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 보충된 팽창 완충액(25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl 및 0.1% NP-40)을 사용하여 얼음 위에서 10분 동안 처리한 다음, 설명된 대로 면역침전 완충액에 재현탁했습니다(58). 그런 다음 샘플을 다음 주기로 초음파 처리했습니다: 10회 주기(1초 펄스 20회) 및 40초의 정지 시간. ChIP 등급 면역글로불린 G(Cell Signaling Technology; 1μl), 히스톤 H3(Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT(Invitrogen; 3μl) 및 SP1(Cell Signaling Technology; 3μl) 항체를 샘플과 함께 4°C에서 밤새도록 흔들어주며 배양했습니다. 단백질 A 비드(Thermo Fisher Scientific)를 시료와 함께 4°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어주면서 배양한 후, 첼렉스 비드(Bio-Rad)를 사용하여 DNA를 농축하고, 프로테아제 K(Thermo Fisher Scientific)로 단백질을 분해했습니다. TNFα 프로모터는 PCR을 통해 검출했습니다. 정방향 프라이머는 GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT이고, 역방향 프라이머는 GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG입니다(207bp 산물). 이미지는 Image Lab(Bio-Rad)으로 생성하고 ImageJ 소프트웨어로 정량화했습니다.
세포 배양 상층액은 앞서 설명한 방법으로 수집하였다. 측정은 인간 TNFα ELISA 키트(Invitrogen), 인간 IL-2 ELISA 키트(Invitrogen) 및 인간 IFN-γ ELISA 키트(Abcam)의 제조사 지침에 따라 수행하였다. 제조사 프로토콜에 따라 TNFα와 IL-2 검출을 위해 상층액을 1:100으로 희석하였고, IFN-γ 검출을 위해 1:3으로 희석하였다. 흡광도는 EnVision 2104 Multilabel Reader(PerkinElmer)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
PBMC는 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 백혈구 분리 산물(STEMCELL Technologies)로부터 분리하였다. CD3+ 세포는 CD3 비드(Miltenyi)를 사용하여 PBMC에서 분리하였다. MNA 존재 또는 부재 하에, CD3+ 세포를 플레이트 결합형 CD3(5μg/ml), 가용성 CD28(3μg/ml) 및 IL-2(300U/ml; Proleukin)로 3일 동안 활성화시켰다. 3일 후, 세포를 수집하고 0.9% 생리식염수로 세척한 후, 침전물을 급속 냉동하였다. 세포 수는 123개 eBeads를 사용하는 유세포 분석기(Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R 구성)로 측정하였다.
위에서 설명한 대로 대사산물을 추출했습니다. 건조된 추출물을 4000 세포 당량/μl 농도로 재구성했습니다. 역상 크로마토그래피(1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)와 CORTECS T3 컬럼(2.1×150 mm, 입자 크기 1.6 μm, 기공 크기 120 Å; #186008500, Waters)을 사용하여 시료를 분석했습니다. 전기분무 이온화 방식이 양이온 모드에서 작동하는 극성 질량 분석기(6470, Agilent)를 사용했습니다. 이동상 A는 0.1% 포름산(H2O), 이동상 B는 90% 아세토니트릴, 0.1% 포름산입니다. LC 그래디언트는 100% A에 대해 0~2분, 99% B에 대해 2~7.1분, 그리고 99% B에 대해 7.1~8분입니다. 그런 다음 이동상 A를 사용하여 0.6 ml/min의 유속으로 3분 동안 컬럼을 재평형화합니다. 유속은 0.4 ml/min이고, 컬럼 챔버는 50°C로 가열합니다. MNA의 순수 화학 표준물질(M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada)을 사용하여 유지 시간(RT)과 변환을 설정합니다(RT = 0.882분, 변환 1 = 137→94.1, 변환 2 = 137→92, 변환 3 = 137→78). 세 가지 변환 모두 정확한 유지 시간에서 발생하면 변환 1을 사용하여 정량 분석을 수행하여 특이성을 확보합니다. MNA(Toronto Research Chemical Company)의 표준 곡선은 원액(1 mg/ml)을 6단계로 연속 희석하여 0.1, 1.0, 10, 100 ng/ml 및 1.0, 10 μg/ml의 표준 용액을 각각 제조하여 생성하였다. 검출 한계는 1 ng/ml이며, 선형 반응 범위는 10 ng/ml에서 10 μg/ml 사이이다. LC/MS 분석에는 시료와 표준 용액 각각 2 μl를 사용하였으며, 분석 플랫폼의 안정성을 확보하기 위해 8회 주입마다 혼합 품질 관리 시료를 함께 분석하였다. 모든 MNA 처리 세포 시료의 MNA 반응은 분석의 선형 범위 내에 있었다. 데이터 분석은 MassHunter 정량 분석 ​​소프트웨어(v9.0, Agilent)를 사용하여 수행하였다.
2세대 αFR-CAR 구조체는 Song et al.(59)에서 가져왔습니다. 간단히 말하면, 이 구조체는 CD8a 리더 서열, 인간 αFR 특이적 단일 사슬 가변 단편, CD8a 힌지 및 막관통 영역, CD27 세포내 도메인 및 CD3z 세포내 도메인을 포함합니다. 완전한 CAR 서열은 GenScript에서 합성한 후, 형질전환 효율을 평가하는 데 사용된 GFP 발현 카세트 상류에 있는 2세대 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝했습니다.
렌티바이러스는 HEK293T 세포(ATCC(American Type Culture Collection)에서 분양받은 세포)를 형질전환하여 생산하였다. 이 세포는 10% 태아소혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(PenStrep)이 함유된 Dulbecco 변형 Eagle 배지에서 배양하였다. CAR-GFP 벡터와 패키징 플라스미드(psPAX2 및 pMD2.G, Addgene)는 리포펙션 아민(Sigma-Aldrich)을 사용하여 도입하였다. 바이러스 함유 상층액은 형질전환 후 48시간 및 72시간에 수집하여 여과하고 초원심분리하여 농축하였다. 농축된 바이러스 상층액은 형질도입 전까지 -80°C에서 보관하였다.
건강한 공여자로부터 얻은 백혈구 분리 제품(STEMCELL Technologies)을 사용하여 Ficoll 밀도 구배 원심분리법으로 PBMC를 분리합니다. 양성 선택 CD8 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여 PBMC에서 CD8+ 세포를 분리합니다. TransAct(Miltenyi)와 TexMACS 배지[Miltenyi; 3% 열처리 불활성화 인간 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 IL-2(300 U/ml) 첨가]에서 T 세포를 자극합니다. 자극 24시간 후, T 세포에 렌티바이러스(세포 10⁶개당 농축 바이러스 상층액 10 μl)를 도입합니다. Cytek Aurora 현미경(FSC(전방 산란)/SSC(측방 산란), Singlet, GFP+)에서 도입 후 1~3일 후에 세포의 GFP 발현을 평가하여 도입 효율이 30% 이상임을 확인합니다.
CAR-T 세포를 Immunocult(STEMCELL Technologies; 1% 페니실린-스트렙토마이신 첨가) 배지에서 다음과 같은 조건으로 24시간 동안 배양했습니다: 무처리, 250 μM 아데노신 처리 또는 10 mM MNA 처리. 전처리 후, CAR-T 세포를 PBS로 세척하고 SK-OV-3 세포 20,000개[ATCC; McCoy 5A 배지(Sigma-Aldrich)에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가]와 10:10의 비율로 혼합했습니다. 이펙터 대 타겟 비율은 1로 설정하여 Immunocult 배지에서 3회 반복 실험했습니다. SK-OV-3 세포와 디기탈리스 사포닌(0.5mg/ml; Sigma-Aldrich)으로 용해시킨 SK-OV-3 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했습니다. 24시간 공동 배양 후 상층액을 수집하고 제조사의 지침에 따라 젖산탈수소효소(LDH)를 측정했습니다(LDH Glo 세포독성 분석 키트, Promega). LDH 상층액을 LDH 완충액에 1:50으로 희석했습니다. 사멸률은 다음 공식을 사용하여 계산했습니다. 사멸률 = 교정률 / 최대 사멸률 × 100%, 여기서 교정률은 T 세포만 공동 배양한 경우이고, 최대 사멸률은 양성 대조군 - 음성 대조군입니다.
본문 또는 재료 및 방법에 설명된 대로 통계 분석에는 GraphPad Prism 8, Microsoft Excel 또는 R v3.6.0을 사용합니다. 동일 환자로부터 여러 샘플(예: 복수 및 종양)을 채취한 경우, 적절한 경우 대응표본 t 검정을 사용하거나 선형 모델 또는 일반화 모델에 환자를 무작위 효과로 포함합니다. 대사체 분석의 경우, 중요도 검정은 3회 반복하여 수행합니다.
본 논문의 추가 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 에서 확인하실 수 있습니다.
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MNA는 T 세포의 면역 억제에 기여하며, 인간 암 치료를 위한 잠재적인 면역 요법 표적입니다.
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