항진균제이자 흔히 사용되는 식품 첨가물인 프로피온산(PPA)은 장내 미생물 불균형으로 인한 위장 기능 장애를 동반한 신경 발달 이상을 쥐에서 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 식이 PPA 노출과 장내 미생물 불균형 사이의 연관성이 제기되었지만, 직접적인 연구는 이루어지지 않았습니다. 본 연구에서는 PPA 노출이 장내 미생물 불균형으로 이어질 수 있는 장내 미생물 구성 변화를 조사했습니다. PPA를 첨가하지 않은 사료(n=9)와 PPA를 첨가한 사료(n=13)를 섭취한 쥐의 장내 미생물 군집을 장거리 메타게놈 시퀀싱을 이용하여 분석하고, 미생물 구성 및 세균 대사 경로의 차이를 평가했습니다. 식이 PPA는 PPA 생성에 관여하는 것으로 알려진 여러 박테로이데스(Bacteroides), 프레보텔라(Prevotella), 루미노코쿠스(Ruminococcus) 종을 포함한 주요 세균의 풍부도 증가와 관련이 있었습니다. 또한, PPA에 노출된 쥐의 장내 미생물 군집은 지질 대사 및 스테로이드 호르몬 생합성과 관련된 경로가 더 많이 발현되었습니다. 본 연구 결과는 PPA가 장내 미생물군과 그와 관련된 대사 경로를 변화시킬 수 있음을 시사합니다. 이러한 변화는 섭취에 안전하다고 분류된 방부제가 장내 미생물군의 구성과 나아가 인체 건강에 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이들 중 P, G 또는 S는 분석 대상 분류 수준에 따라 선택됩니다. 오분류(false positive)의 영향을 최소화하기 위해 최소 상대 풍부도 임계값은 1e-4(1/10,000 reads)로 설정했습니다. 통계 분석에 앞서 Bracken에서 보고된 상대 풍부도(fraction_total_reads)는 중심 로그 비율(CLR) 변환(Aitchison, 1982)을 사용하여 변환했습니다. CLR 방법은 스케일 불변이며 희소하지 않은 데이터 세트에 적합하기 때문에 데이터 변환에 사용되었습니다(Gloor et al., 2017). CLR 변환은 자연 로그를 사용합니다. Bracken에서 보고된 카운트 데이터는 상대 로그 표현(RLE)을 사용하여 정규화했습니다(Anders and Huber, 2010). 그림은 matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 및 순차 로그 변환(Gloor et al., 2017)을 조합하여 생성했습니다. KrakenTools v. 1.2 및 Stantanotations v. 0.5.0(Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022)을 사용했습니다. 각 샘플에 대해 정규화된 세균 수를 이용하여 Bacillus/Bacteroidetes 비율을 계산했습니다. 표에 보고된 값은 소수점 넷째 자리까지 반올림했습니다. Simpson 다양성 지수는 KrakenTools v. 1.2 패키지에 포함된 alpha_diversity.py 스크립트를 사용하여 계산했습니다(Lu et al., 2022). 스크립트에는 Bracken 보고서가 포함되어 있으며, Simpson 지수 "Si"는 -an 매개변수에 제공됩니다. 풍부도의 유의미한 차이는 평균 CLR 차이가 ±1이거나 -1 이하인 경우로 정의했습니다. 평균 CLR 차이가 ±1이면 특정 샘플 유형의 풍부도가 2.7배 증가한 것을 의미합니다. 부호(+/-)는 해당 분류군이 PPA 샘플과 대조 샘플에서 각각 더 풍부한지를 나타냅니다. 통계적 유의성은 Mann-Whitney U 검정(Virtanen et al., 2020)을 사용하여 분석했습니다. Statsmodels v. 0.14(Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010)를 사용했으며, 다중 검정 보정을 위해 Benjamini-Hochberg 방법을 적용했습니다. 조정된 p값 ≤ 0.05를 통계적 유의성 기준으로 설정했습니다.
인체 미생물군은 흔히 "인체의 마지막 장기"라고 불리며 인간 건강에 매우 중요한 역할을 합니다(Baquero and Nombela, 2012). 특히 장내 미생물군은 전신에 영향을 미치고 여러 필수 기능에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 장내에는 다양한 생태적 지위를 차지하고 영양분을 이용하며 잠재적 병원균과 경쟁하는 공생 박테리아가 풍부하게 존재합니다(Jandhyala et al., 2015). 장내 미생물군의 다양한 박테리아 구성 요소는 비타민과 같은 필수 영양소를 생성하고 소화를 촉진하는 능력을 가지고 있습니다(Rowland et al., 2018). 또한 박테리아 대사산물은 조직 발달에 영향을 미치고 대사 및 면역 경로를 강화하는 것으로 나타났습니다(Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). 인간 장내 미생물군의 구성은 매우 다양하며 식단, 성별, 약물 복용, 건강 상태와 같은 유전적 및 환경적 요인에 따라 달라집니다(Kumbhare et al., 2019).
임산부의 식단은 태아 및 신생아 발달에 매우 중요한 요소이며, 발달에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 잠재적 공급원이기도 합니다(Bazer et al., 2004; Innis, 2014). 이러한 화합물 중 하나로 프로피온산(PPA)이 주목받고 있는데, 이는 세균 발효를 통해 얻어지는 단쇄 지방산 부산물이자 식품 첨가물입니다(den Besten et al., 2013). PPA는 항균 및 항진균 특성을 가지고 있어 식품 보존제 및 산업 분야에서 곰팡이와 세균의 성장을 억제하는 데 사용됩니다(Wemmenhove et al., 2016). PPA는 조직에 따라 다양한 효과를 나타냅니다. 간에서는 대식세포의 사이토카인 발현에 영향을 미쳐 항염증 효과를 보입니다(Kawasoe et al., 2022). 이러한 조절 효과는 다른 면역 세포에서도 관찰되어 염증을 억제하는 것으로 나타났습니다(Haase et al., 2021). 그러나 뇌에서는 정반대의 효과가 관찰되었습니다. 이전 연구들은 PPA 노출이 쥐에서 자폐증과 유사한 행동을 유발한다는 것을 보여주었습니다(El-Ansary et al., 2012). 다른 연구들은 PPA가 뇌에서 신경교증을 유발하고 염증 경로를 활성화시킬 수 있음을 보여주었습니다(Abdelli et al., 2019). PPA는 약산이기 때문에 장 상피를 통해 혈류로 확산되어 혈뇌 장벽과 태반을 포함한 여러 장벽을 통과할 수 있습니다(Stinson et al., 2019). 이는 PPA가 박테리아에 의해 생성되는 조절 대사물질로서 중요하다는 것을 시사합니다. PPA가 자폐증의 위험인자로서 어떤 역할을 하는지는 현재 연구 중이지만, 자폐증 환자에게 미치는 영향은 신경 분화 유도를 넘어 더 광범위할 수 있습니다.
신경발달장애 환자에게는 설사와 변비와 같은 위장관 증상이 흔하게 나타납니다(Cao et al., 2021). 이전 연구에서는 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 환자의 장내 미생물군이 건강한 사람과 다르다는 점이 밝혀졌으며, 이는 장내 미생물 불균형(dysbiosis)의 존재를 시사합니다(Finegold et al., 2010). 마찬가지로, 염증성 장질환, 비만, 알츠하이머병 등의 환자에서도 장내 미생물군의 특성이 건강한 사람과 다릅니다(Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). 그러나 현재까지 장내 미생물군과 신경계 질환 또는 증상 사이의 인과관계는 명확히 규명되지 않았습니다(Yap et al., 2021). 다만, 여러 세균 종이 이러한 질병 상태에 관여하는 것으로 추정됩니다. 예를 들어, 아케르만시아(Akkermansia), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 락토바실러스(Lactobacillus), 데술포비브리오(Desulfovibrio) 등의 속은 자폐증 환자의 장내 미생물총에서 더 풍부하게 발견됩니다(Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). 특히, 이러한 속의 일부 종은 PPA 생성과 관련된 유전자를 가지고 있는 것으로 알려져 있습니다(Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). PPA의 항균 특성을 고려할 때, PPA의 풍부도가 증가하면 PPA 생성 박테리아의 성장에 도움이 될 수 있습니다(Jacobson et al., 2018). 따라서 PFA가 풍부한 환경은 위장관 병원균을 포함한 장내 미생물총의 변화를 초래할 수 있으며, 이는 위장관 증상을 유발하는 잠재적 요인이 될 수 있습니다.
미생물군 연구에서 핵심적인 질문은 미생물 구성의 차이가 기저 질환의 원인인지 증상인지 여부입니다. 식이, 장내 미생물군, 그리고 신경 질환 사이의 복잡한 관계를 규명하기 위한 첫 번째 단계는 식이가 미생물 구성에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 장거리 메타게놈 시퀀싱을 이용하여 PPA가 풍부한 식이와 PPA가 결핍된 식이를 섭취한 쥐의 새끼들의 장내 미생물군을 비교했습니다. 새끼들은 어미와 동일한 식이를 섭취했습니다. 우리는 PPA가 풍부한 식이가 장내 미생물 구성 및 미생물 기능 경로, 특히 PPA 대사 및/또는 PPA 생성과 관련된 경로에 변화를 초래할 것이라고 가설을 세웠습니다.
본 연구에서는 플로리다 중부대학교 동물실험윤리위원회(UCF-IACUC)의 지침에 따라(동물실험 허가 번호: PROTO202000002) 신경교세포 특이적 GFAP 프로모터의 조절 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 과발현하는 FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J 형질전환 마우스(Jackson Laboratories)를 사용했습니다. 이유 후, 마우스는 암수 각각 1~5마리씩 개별 케이지에 사육했습니다. 마우스에게는 정제된 대조군 사료(변형된 개방형 표준 사료, 지방 16kcal%) 또는 프로피온산나트륨 보충 사료(변형된 개방형 표준 사료, 지방 16kcal%, 프로피온산나트륨 5,000ppm 함유)를 자유롭게 공급했습니다. 사용된 프로피온산나트륨의 양은 총 사료 무게 1kg당 5,000mg의 PFA에 해당합니다. 이는 식품 보존제로 사용이 승인된 PPA의 최고 농도입니다. 본 연구를 위해 어미 쥐에게 교미 전 4주 동안 두 가지 사료를 모두 급여하고 임신 기간 동안에도 계속해서 급여했습니다. 새끼 쥐(22마리, 대조군 9마리(수컷 6마리, 암컷 3마리) 및 PPA 투여군 13마리(수컷 4마리, 암컷 9마리))는 젖을 뗀 후 5개월 동안 어미와 동일한 사료를 계속 급여했습니다. 새끼 쥐는 생후 5개월에 희생시키고 장내 대변 내용물을 채취하여 1.5ml 마이크로원심분리 튜브에 담아 -20°C에서 보관한 후, 숙주 DNA가 제거되고 미생물 핵산이 추출될 때까지 -80°C 냉동고로 옮겼습니다.
숙주 DNA는 수정된 프로토콜(Charalampous et al., 2019)에 따라 제거되었습니다. 간단히 설명하면, 대변 내용물을 500 µl의 InhibitEX(Qiagen, Cat#/ID: 19593)에 옮겨 담고 냉동 보관했습니다. 추출당 최대 1~2개의 대변 펠릿만 처리했습니다. 대변 내용물은 튜브 안에서 플라스틱 막자를 사용하여 기계적으로 균질화하여 슬러리를 만들었습니다. 샘플을 10,000 RCF에서 5분 동안 또는 샘플이 침전될 때까지 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 침전물을 250 µl의 1× PBS에 재현탁했습니다. 진핵세포막을 이완시키기 위해 세척제로서 250 µl의 4.4% 사포닌 용액(TCI, 제품 번호 S0019)을 샘플에 첨가했습니다. 샘플이 부드러워질 때까지 부드럽게 혼합한 후 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 다음으로, 진핵세포를 파괴하기 위해 시료에 무균 증류수 350 μl를 첨가하고 30초간 배양한 후, 5 M NaCl 12 μl를 첨가했습니다. 그런 다음 시료를 6000 RCF에서 5분간 원심분리했습니다. 상층액을 제거하고 침전물을 1X PBS 100 μl에 재현탁했습니다. 숙주 DNA를 제거하기 위해 HL-SAN 완충액(NaCl 12.8568 g, 1 MgCl2 4 ml, 무균 증류수 36 ml) 100 μl와 HL-SAN 효소(ArticZymes P/N 70910-202) 10 μl를 첨가했습니다. 시료를 피펫팅하여 충분히 혼합한 후, Eppendorf™ ThermoMixer C 믹서를 사용하여 37°C에서 30분 동안 800rpm으로 교반하면서 배양했습니다. 배양 후, 6000 RCF에서 3분간 원심분리하고 1X PBS 용액 800µl와 1000µl로 각각 두 번씩 세척했습니다. 마지막으로, 침전물을 1X PBS 용액 100µl에 재현탁했습니다.
뉴잉글랜드 바이오랩스 모나크 게놈 DNA 정제 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA, 카탈로그 번호 T3010L)를 사용하여 총 세균 DNA를 분리했습니다. 키트에 제공된 표준 작업 절차를 약간 수정했습니다. 최종 용출을 위해 작업 전에 뉴클레아제 무첨가 증류수를 60°C에서 보관하고 유지합니다. 각 샘플에 프로테아제 K 10 µl와 RNase A 3 µl를 첨가합니다. 그런 다음 세포 용해 완충액 100 µl를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 Eppendorf™ ThermoMixer C에서 56°C, 1400 rpm으로 최소 1시간에서 최대 3시간 동안 배양합니다. 배양된 샘플을 12,000 RCF에서 3분 동안 원심분리하고 각 샘플의 상층액을 결합 용액 400 µL가 들어 있는 별도의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 1초 간격으로 5~10초 동안 펄스 와류 혼합했습니다. 각 샘플의 액체 내용물 전체(약 600~700 µL)를 유동식 수집 튜브에 있는 필터 카트리지로 옮겼습니다. 튜브를 1,000 RCF에서 3분 동안 원심분리하여 초기 DNA 결합을 유도한 후, 12,000 RCF에서 1분 동안 원심분리하여 잔류 액체를 제거했습니다. 샘플 컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮긴 후 두 번 세척했습니다. 첫 번째 세척에서는 각 튜브에 세척 완충액 500 µL를 넣었습니다. 튜브를 3~5회 뒤집은 후 12,000 RCF에서 1분 동안 원심분리했습니다. 수집 튜브의 액체를 버리고 필터 카트리지를 같은 수집 튜브에 다시 넣었습니다. 두 번째 세척에서는 튜브를 뒤집지 않고 필터에 세척 완충액 500 µL를 넣었습니다. 샘플을 12,000 RCF에서 1분 동안 원심분리했습니다. 필터를 1.5mL LoBind® 튜브로 옮기고 미리 데워둔 무균 증류수 100µL를 첨가합니다. 필터를 실온에서 1분간 배양한 후 12,000 RCF에서 1분간 원심분리합니다. 용출된 DNA는 -80°C에서 보관합니다.
DNA 농도는 Qubit™ 4.0 형광광도계를 사용하여 정량화했습니다. DNA는 제조사의 지침에 따라 Qubit™ 1X dsDNA 고감도 키트(제품 번호 Q33231)를 사용하여 준비했습니다. DNA 단편 길이 분포는 Agilent™ 4150 또는 4200 TapeStation을 사용하여 측정했습니다. DNA는 Agilent™ 게놈 DNA 시약(제품 번호 5067-5366)과 게놈 DNA 스크린테이프(제품 번호 5067-5365)를 사용하여 준비했습니다. 라이브러리 준비는 제조사의 지침에 따라 Oxford Nanopore Technologies™(ONT) Rapid PCR Barcoding Kit(SQK-RPB004)를 사용하여 수행했습니다. DNA 시퀀싱은 Min106D 플로우 셀(R 9.4.1)이 장착된 ONT GridION™ Mk1 시퀀서를 사용하여 수행했습니다. 시퀀싱 설정은 고정밀 염기 판독, 최소 q값 9, 바코드 설정 및 바코드 트리밍이었습니다. 샘플은 72시간 동안 시퀀싱되었으며, 이후 염기 판독 데이터는 추가 처리 및 분석을 위해 제출되었습니다.
생물정보학 처리는 이전에 설명된 방법(Greenman et al., 2024)을 사용하여 수행되었습니다. 시퀀싱에서 얻은 FASTQ 파일은 각 샘플별로 디렉토리에 나누어 저장했습니다. 생물정보학 분석 전에 데이터는 다음 파이프라인을 사용하여 처리했습니다. 먼저, 샘플의 FASTQ 파일을 하나의 FASTQ 파일로 병합했습니다. 그런 다음, Filtlong v. 0.2.1을 사용하여 1000bp보다 짧은 리드를 필터링했으며, 유일하게 변경된 매개변수는 –min_length 1000이었습니다(Wick, 2024). 추가 필터링 전에 NanoPlot v. 1.41.3을 사용하여 다음 매개변수로 리드 품질을 검사했습니다. –fastq –plots dot –N50 -o
분류학적 분류를 위해, Kraken2 v. 2.1.2(Wood et al., 2019)를 사용하여 리드와 어셈블된 컨티그를 분류했습니다. 리드와 어셈블리에 대한 보고서와 출력 파일을 각각 생성했습니다. 리드와 어셈블리를 분석하려면 –use-names 옵션을 사용했습니다. 리드 세그먼트에는 –gzip-compressed 및 –paired 옵션을 지정했습니다. 메타게놈에서 분류군의 상대적 풍부도는 Bracken v. 2.8(Lu et al., 2017)을 사용하여 추정했습니다. 먼저 다음 매개변수를 사용하여 bracken-build로 1000개의 염기를 포함하는 kmer 데이터베이스를 생성했습니다. -d
유전자 주석 및 상대적 풍부도 추정은 Maranga et al.이 기술한 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 수행되었습니다(Maranga et al., 2023). 먼저, SeqKit v. 2.5.1(Shen et al., 2016)을 사용하여 모든 어셈블리에서 500bp보다 짧은 컨티그를 제거했습니다. 선택된 어셈블리들을 결합하여 팬 메타게놈을 생성했습니다. 개방형 판독 프레임(ORF)은 Prodigal v. 1.0.1(Prodigal v. 2.6.3의 병렬 버전)을 사용하여 다음 매개변수로 식별했습니다. -d
유전자 경로 풍부도를 비교하기 위해 eggNOG에서 할당한 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 오르토로그(KO) 식별자를 기준으로 유전자들을 먼저 그룹화했습니다. 녹아웃이 없거나 여러 개의 녹아웃이 있는 유전자는 분석 전에 제거했습니다. 그런 다음 샘플별로 각 KO의 평균 풍부도를 계산하고 통계 분석을 수행했습니다. PPA 대사 관련 유전자는 KEGG_Pathway 열에서 ko00640으로 지정된 유전자로 정의했으며, 이는 KEGG에 따라 프로피온산 대사에 관여함을 나타냅니다. PPA 생성과 관련된 것으로 확인된 유전자는 보충표 1에 나열되어 있습니다(Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). 각 샘플 유형에서 유의미하게 더 풍부한 PPA 대사 및 생성 관련 유전자를 식별하기 위해 순열 검정을 수행했습니다. 분석 대상 유전자 각각에 대해 1,000번의 순열을 수행했습니다. 통계적 유의성을 판단하는 기준으로 p값 0.05를 사용했습니다. 클러스터 내 대표 유전자의 주석을 기반으로 각 클러스터 내 개별 유전자에 기능 주석을 할당했습니다. PPA 대사 및/또는 PPA 생성과 관련된 분류군은 Kraken2 출력 파일의 컨티그 ID와 eggNOG를 사용한 기능 주석 과정에서 유지된 동일한 컨티그 ID를 일치시켜 식별할 수 있었습니다. 유의성 검정은 이전에 설명한 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 수행했습니다. 다중 검정 보정은 Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 수행했습니다. 통계적 유의성을 판단하는 기준으로 p값 ≤ 0.05를 사용했습니다.
심슨 다양성 지수를 이용하여 쥐의 장내 미생물군 다양성을 평가하였다. 대조군과 PPA 투여군 간에 속 및 종 다양성 측면에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(속 다양성 p값: 0.18, 종 다양성 p값: 0.16) (그림 1). 이후 주성분 분석(PCA)을 이용하여 미생물 구성을 비교하였다. 그림 2는 문(phylum)별로 샘플을 군집화한 결과를 보여주며, PPA 투여군과 대조군 샘플의 미생물군 종 구성에 차이가 있음을 나타낸다. 이러한 군집화는 속 수준에서는 덜 두드러지게 나타났는데, 이는 PPA가 특정 세균에 영향을 미친다는 것을 시사한다(보충 그림 1).
그림 1. 마우스 장내 미생물 군집의 속별 알파 다양성 및 종 구성. PPA 투여군과 대조군 샘플에서 속별(A) 및 종별(B)의 심슨 다양성 지수를 나타내는 상자 그림. 유의성은 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 결정하였고, 다중 비교 보정은 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 수행하였다. ns, p값이 유의하지 않음(p>0.05).
그림 2. 종 수준에서 마우스 장내 미생물군 구성에 대한 주성분 분석 결과. 주성분 분석 그래프는 샘플들이 첫 번째와 두 번째 주성분에 따라 어떻게 분포하는지 보여준다. 색상은 샘플 유형을 나타낸다. PPA에 노출된 마우스는 보라색이고, 대조군 마우스는 노란색이다. 주성분 1과 2는 각각 x축과 y축에 표시되며, 설명된 분산 비율로 나타낸다.
RLE 변환된 계수 데이터를 사용하여 대조군과 PPA 마우스에서 박테로이데스/바실러스 비율의 중앙값이 유의하게 감소한 것을 관찰했습니다(대조군: 9.66, PPA: 3.02; p값 = 0.0011). 이러한 차이는 PPA 마우스에서 박테로이데스가 대조군보다 더 많이 존재했기 때문이지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(대조군 평균 CLR: 5.51, PPA 평균 CLR: 6.62; p값 = 0.054). 반면 박테로이데스의 존재량은 유사했습니다(대조군 평균 CLR: 7.76, PPA 평균 CLR: 7.60; p값 = 0.18).
장내 미생물군집의 분류학적 구성원 풍부도 분석 결과, PPA 샘플과 대조군 샘플 간에 1개 문과 77개 종에서 유의미한 차이가 나타났다(보충표 2). PPA 샘플에서 풍부도가 유의미하게 높은 종은 59개였으며, 대조군 샘플에서 풍부도가 PPA 샘플보다 높은 종은 16개에 불과했다(그림 3).
그림 3. PPA 및 대조군 마우스의 장내 미생물 군집에서 분류군의 풍부도 차이. 화산 도표는 PPA 및 대조군 샘플 간의 속(A) 또는 종(B) 풍부도 차이를 나타냅니다. 회색 점은 분류군 풍부도에 유의미한 차이가 없음을 나타냅니다. 색깔 있는 점은 풍부도에 유의미한 차이가 있음을 나타냅니다(p값 ≤ 0.05). 샘플 유형 간 풍부도 차이가 가장 큰 상위 20개 분류군은 각각 빨간색과 연한 파란색(대조군 및 PPA 샘플)으로 표시됩니다. 노란색과 보라색 점은 대조군 또는 PPA 샘플에서 대조군보다 최소 2.7배 더 풍부하게 나타났습니다. 검은색 점은 평균 CLR 차이가 -1에서 1 사이인 유의미하게 다른 풍부도를 나타내는 분류군을 나타냅니다. p값은 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 계산하고 Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 다중 검정 보정을 수행했습니다. 굵은 평균 CLR 차이는 풍부도에 유의미한 차이가 있음을 나타냅니다.
장내 미생물 구성 분석 후, 미생물 군집의 기능적 주석을 수행했습니다. 품질이 낮은 유전자를 제외한 후, 모든 샘플에서 총 378,355개의 고유 유전자가 확인되었습니다. 이러한 유전자들의 변환된 풍부도를 주성분 분석(PCA)에 사용한 결과, 기능적 프로파일을 기반으로 샘플 유형들이 높은 수준으로 군집화되는 것을 확인할 수 있었습니다(그림 4).
그림 4. 마우스 장내 미생물군집의 기능적 프로파일을 이용한 PCA 결과. PCA 도표는 각 샘플이 첫 번째와 두 번째 주성분에 따라 어떻게 분포하는지 보여준다. 색상은 샘플 유형을 나타낸다. PPA에 노출된 마우스는 보라색이고, 대조군 마우스는 노란색이다. 첫 번째 주성분과 두 번째 주성분은 각각 x축과 y축에 표시되며, 설명된 분산 비율로 나타낸다.
다음으로, 서로 다른 샘플 유형에서 KEGG 녹아웃의 풍부도를 조사했습니다. 총 3648개의 고유한 녹아웃이 확인되었으며, 이 중 196개는 대조군 샘플에서, 106개는 PPA 샘플에서 유의미하게 더 풍부하게 나타났습니다(그림 5). 대조군 샘플에서 145개, PPA 샘플에서 61개의 유전자가 유의미한 풍부도 차이를 보였습니다. 지질 및 아미노당 대사와 관련된 경로는 PPA 샘플에서 유의미하게 더 풍부하게 나타났습니다(보충표 3). 질소 대사 및 황 전달 시스템과 관련된 경로는 대조군 샘플에서 유의미하게 더 풍부하게 나타났습니다(보충표 3). 아미노당/핵산 대사(ko:K21279) 및 이노시톨 인산 대사(ko:K07291)와 관련된 유전자의 풍부도는 PPA 샘플에서 유의미하게 더 높았습니다(그림 5). 대조군 샘플에는 벤조산 대사(ko:K22270), 질소 대사(ko:K00368) 및 해당 과정/포도당 신생합성(ko:K00131)과 관련된 유전자가 유의하게 더 많았습니다(그림 5).
그림 5. PPA 및 대조군 마우스의 장내 미생물군에서 KO의 차등적 풍부도. 화산 플롯은 기능 그룹(KO)의 풍부도 차이를 나타냅니다. 회색 점은 샘플 유형 간에 풍부도 차이가 유의미하지 않은 KO를 나타냅니다(p > 0.05). 색깔 있는 점은 풍부도에 유의미한 차이가 있는 KO를 나타냅니다(p ≤ 0.05). 샘플 유형 간에 풍부도 차이가 가장 큰 상위 20개의 KO는 각각 대조군과 PPA 샘플에 해당하는 빨간색과 연한 파란색으로 표시됩니다. 노란색과 보라색 점은 각각 대조군과 PPA 샘플에서 풍부도가 2.7배 이상 높은 KO를 나타냅니다. 검은색 점은 평균 CLR 차이가 -1에서 1 사이로 유의미한 풍부도 차이를 보이는 KO를 나타냅니다. p값은 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 계산하고 Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 다중 비교를 보정했습니다. NaN은 해당 KO가 KEGG 경로에 속하지 않음을 나타냅니다. 굵은 평균 CLR 차이 값은 풍부도에 유의미한 차이가 있음을 나타냅니다. 나열된 KO가 속하는 경로에 대한 자세한 정보는 보충표 3을 참조하십시오.
주석이 달린 유전자 중 1601개 유전자에서 샘플 유형 간에 유의미한 발현량 차이가 관찰되었으며(p ≤ 0.05), 각 유전자는 최소 2.7배 이상 발현량이 높았습니다. 이 중 4개 유전자는 대조군 샘플에서, 1597개 유전자는 PPA 처리 샘플에서 발현량이 더 높았습니다. PPA는 항균 특성을 가지고 있으므로, 샘플 유형 간에 PPA 대사 및 생성 관련 유전자의 발현량을 조사했습니다. 1332개의 PPA 대사 관련 유전자 중 27개 유전자는 대조군 샘플에서, 12개 유전자는 PPA 처리 샘플에서 유의미하게 발현량이 더 높았습니다. 223개의 PPA 생성 관련 유전자 중 1개 유전자는 PPA 처리 샘플에서 유의미하게 발현량이 더 높았습니다. 그림 6A는 PPA 대사에 관여하는 유전자들의 발현량이 대조군 샘플에서 유의미하게 높고 효과 크기가 큰 것을 보여주며, 그림 6B는 PPA 처리 샘플에서 발현량이 유의미하게 높은 개별 유전자들을 보여줍니다.
그림 6. 마우스 장내 미생물군에서 PPA 관련 유전자의 발현량 차이. 화산 도표는 PPA 대사(A) 및 PPA 생성(B)과 관련된 유전자 발현량 차이를 나타낸다. 회색 점은 샘플 유형 간에 발현량 차이가 유의미하지 않은 유전자(p > 0.05)를 나타낸다. 색깔 있는 점은 발현량 차이가 유의미한 유전자(p ≤ 0.05)를 나타낸다. 발현량 차이가 가장 큰 상위 20개 유전자는 각각 빨간색과 연한 파란색(대조군 및 PPA 투여군)으로 표시되었다. 노란색과 보라색 점의 발현량은 대조군 및 PPA 투여군에서 대조군보다 최소 2.7배 이상 높았다. 검은색 점은 발현량 차이가 유의미하게 다른 유전자를 나타내며, 평균 CLR 차이는 -1에서 1 사이이다. p값은 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 계산하였고, Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 비교를 보정하였다. 유전자는 비중복 유전자 목록의 대표 유전자에 해당한다. 유전자 이름은 KO 유전자를 나타내는 KEGG 기호로 구성된다. 굵게 표시된 평균 CLR 차이는 유의미한 차이를 나타냅니다. 하이픈(-)은 KEGG 데이터베이스에 해당 유전자에 대한 기호가 없음을 나타냅니다.
PPA 대사 및/또는 생산과 관련된 유전자를 가진 분류군은 컨티그의 분류학적 정체성과 해당 유전자의 컨티그 ID를 대조하여 확인하였다. 속 수준에서 130개 속에서 PPA 대사와 관련된 유전자가, 61개 속에서 PPA 생산과 관련된 유전자가 발견되었다(보충표 4). 그러나 어떤 속에서도 유의미한 풍부도 차이는 나타나지 않았다(p > 0.05).
종 수준에서 144종의 세균이 PPA 대사와 관련된 유전자를, 68종의 세균이 PPA 생성과 관련된 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었습니다(보충표 5). PPA 대사균 중 8종은 시료 유형 간에 풍부도가 유의하게 증가했으며, 모든 종에서 유의한 효과 변화가 관찰되었습니다(보충표 6). 풍부도에 유의한 차이를 보인 모든 PPA 대사균은 PPA 처리 시료에서 더 풍부하게 존재했습니다. 종 수준 분류 결과, 여러 Bacteroides 및 Ruminococcus 종을 비롯하여 Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, Alcaligenes polymorpha 등 시료 유형 간에 유의한 차이를 보이지 않은 속의 대표종들이 확인되었습니다. PPA 생성 세균 중 4종은 시료 유형 간에 풍부도에 유의한 차이를 보였습니다. 풍부도에 유의한 차이를 보인 종에는 Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, Ruminococcus bovis가 포함됩니다.
본 연구에서는 PPA 노출이 생쥐의 장내 미생물총에 미치는 영향을 조사했습니다. PPA는 특정 종에서 생성되거나, 다른 종에서 영양원으로 이용되거나, 항균 효과를 가지는 등 다양한 방식으로 세균에 반응을 일으킬 수 있습니다. 따라서 식이 보충을 통해 장내에 PPA를 첨가하면 내성, 감수성, 그리고 PPA를 영양원으로 이용하는 능력에 따라 다양한 영향을 미칠 수 있습니다. 민감한 세균 종은 제거되고 PPA에 내성이 있거나 PPA를 영양원으로 이용할 수 있는 종으로 대체되어 장내 미생물총의 구성이 변화할 수 있습니다. 연구 결과, 미생물 구성에는 유의미한 차이가 나타났지만, 전체적인 미생물 다양성에는 변화가 없었습니다. 가장 큰 영향은 종 수준에서 관찰되었으며, PPA 투여군과 대조군 사이에서 70개 이상의 분류군에서 유의미한 풍부도 차이가 나타났습니다(보충표 2). PPA에 노출된 시료의 미생물 구성을 추가적으로 분석한 결과, 노출되지 않은 시료에 비해 미생물 종의 이질성이 더 큰 것으로 나타났습니다. 이는 PPA가 세균의 성장 특성을 강화하고 PPA가 풍부한 환경에서 생존할 수 있는 세균의 개체수를 제한할 수 있음을 시사합니다. 따라서 PPA는 장내 미생물 다양성의 광범위한 교란을 일으키기보다는 선택적으로 변화를 유도할 수 있다.
PPA와 같은 식품 방부제는 전반적인 다양성에는 영향을 미치지 않으면서 장내 미생물군 구성 요소의 풍부도를 변화시키는 것으로 이전에 밝혀졌습니다(Nagpal et al., 2021). 본 연구에서는 PPA에 노출된 쥐에서 Bacteroidetes 문(이전에는 Bacteroidetes로 알려짐) 내의 Bacteroidetes 종에서 가장 두드러진 차이를 관찰했습니다. Bacteroides 종의 풍부도 증가는 점액 분해 증가와 관련이 있으며, 이는 감염 위험을 높이고 염증을 유발할 수 있습니다(Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). 한 연구에서는 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)로 처리된 신생 수컷 쥐가 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 유사한 사회적 행동을 보였다는 사실을 발견했으며(Carmel et al., 2023), 다른 연구에서는 박테로이데스 종이 면역 활동을 변화시켜 자가면역 염증성 심근병증을 유발할 수 있음을 보여주었습니다(Gil-Cruz et al., 2019). 루미노코쿠스(Ruminococcus), 프레보텔라(Prevotella), 파라박테로이데스(Parabacteroides) 속의 종들도 PPA에 노출된 쥐에서 유의하게 증가했습니다(Coretti et al., 2018). 특정 루미노코쿠스 종은 염증성 사이토카인 생성을 통해 크론병과 같은 질병과 관련이 있으며(Henke et al., 2019), 프레보텔라 휴마니(Prevotella humani)와 같은 프레보텔라 종은 고혈압 및 인슐린 민감도와 같은 대사 질환과 관련이 있습니다(Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). 마지막으로, PPA에 노출된 쥐에서 박테로이데테스(이전에는 피르미쿠테스로 알려짐)와 박테로이데테스의 비율이 대조군 쥐보다 유의하게 낮았는데, 이는 박테로이데테스 종의 총 개체수가 더 많았기 때문입니다. 이 비율은 장내 항상성의 중요한 지표로 알려져 있으며, 이 비율의 교란은 염증성 장 질환(Stojanov et al., 2020)을 포함한 다양한 질병 상태와 관련이 있습니다(Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023). 종합적으로, 박테로이데테스문에 속하는 종들이 식이 PPA 증가에 가장 큰 영향을 받는 것으로 보입니다. 이는 PPA에 대한 내성이 높거나 PPA를 에너지원으로 이용할 수 있는 능력이 있기 때문일 수 있으며, 적어도 한 종인 호일레셀라 에노세아(Hoylesella enocea)에서는 이러한 능력이 입증되었습니다(Hitch et al., 2022). 또는, 어미 쥐의 PPA 노출은 새끼 쥐의 장을 박테로이데스균 군집 형성에 더 취약하게 만들어 태아 발달을 촉진할 수 있지만, 본 연구 설계에서는 이러한 평가를 수행할 수 없었습니다.
메타게놈 콘텐츠 분석 결과, PPA 대사 및 생성과 관련된 유전자들의 풍부도에 유의미한 차이가 나타났습니다. PPA에 노출된 쥐는 PPA 생성에 관여하는 유전자들의 풍부도가 더 높았고, PPA에 노출되지 않은 쥐는 PAA 대사에 관여하는 유전자들의 풍부도가 더 높았습니다(그림 6). 이러한 결과는 PPA가 미생물 구성에 미치는 영향이 단순히 PPA 사용 때문만은 아닐 수 있음을 시사합니다. 만약 그렇다면 PPA 대사와 관련된 유전자들의 풍부도가 PPA에 노출된 쥐의 장내 미생물에서 더 높게 나타났어야 할 것입니다. 한 가지 설명은 PPA가 세균의 영양소로서의 이용보다는 주로 항균 효과를 통해 세균의 풍부도를 조절한다는 것입니다. 이전 연구에서는 PPA가 Salmonella Typhimurium의 성장을 용량 의존적으로 억제한다는 사실이 밝혀졌습니다(Jacobson et al., 2018). 고농도의 PPA에 노출되면 항균 작용에 내성을 가진 세균이 선택적으로 증식할 수 있으며, 이러한 세균은 PPA를 대사하거나 생성할 수 없을 수도 있습니다. 예를 들어, 몇몇 Parabacteroides 종은 PPA 샘플에서 유의미하게 높은 풍부도를 보였지만, PPA 대사 또는 생산과 관련된 유전자는 검출되지 않았습니다(보충표 2, 4, 5). 더욱이, 발효 부산물로서의 PPA 생산은 다양한 박테리아에 널리 분포되어 있습니다(Gonzalez-Garcia et al., 2017). 박테리아 다양성이 높기 때문에 대조군 샘플에서 PPA 대사와 관련된 유전자의 풍부도가 더 높을 수 있습니다(Averina et al., 2020). 또한, 1332개의 유전자 중 27개(2.14%)만이 PPA 대사에만 관여하는 것으로 예측되었습니다. PPA 대사와 관련된 많은 유전자들은 다른 대사 경로에도 관여합니다. 이는 PPA 대사에 관여하는 유전자의 풍부도가 대조군 샘플에서 더 높았음을 더욱 분명히 보여줍니다. 이러한 유전자들은 PPA 이용이나 부산물로서의 PPA 생성을 초래하지 않는 경로에서도 기능할 수 있습니다. 이 경우, PPA 생성과 관련된 유전자 중 단 하나만이 샘플 유형 간에 풍부도에서 유의미한 차이를 보였습니다. PPA 대사와 관련된 유전자들과는 대조적으로, PPA 생산 마커 유전자들은 PPA 생산을 위한 세균 경로에 직접적으로 관여하기 때문에 선택되었다. PPA에 노출된 쥐에서 모든 종들이 PPA 생산 능력과 풍부도가 유의미하게 증가한 것으로 나타났다. 이는 PPA가 PPA 생산균을 선택적으로 증식시키고, 따라서 PPA 생산 능력이 증가할 것이라는 예측을 뒷받침한다. 그러나 유전자 풍부도가 유전자 발현과 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다. 따라서 대조군에서 PPA 대사와 관련된 유전자의 풍부도가 높더라도 발현율은 다를 수 있다(Shi et al., 2014). PPA 생산 유전자의 발현과 PPA 생산량 간의 관계를 확인하기 위해서는 PPA 생산에 관여하는 유전자들의 발현에 대한 연구가 필요하다.
PPA와 대조군 메타게놈의 기능적 주석 분석 결과 몇 가지 차이점이 드러났습니다. 유전자 함량에 대한 PCA 분석은 PPA와 대조군 샘플 간에 뚜렷한 클러스터를 형성했습니다(그림 5). 샘플 내 클러스터링 분석 결과, 대조군의 유전자 함량은 더 다양했지만, PPA 샘플들은 서로 밀집된 클러스터를 형성했습니다. 유전자 함량에 따른 클러스터링은 종 구성에 따른 클러스터링과 유사한 양상을 보였습니다. 따라서 경로 풍부도의 차이는 특정 종 및 그 내 균주의 풍부도 변화와 일관성이 있습니다. PPA 샘플에서 유의미하게 높은 풍부도를 보인 두 가지 경로는 아미노당/뉴클레오티드당 대사(ko:K21279)와 다중 지질 대사 경로(ko:K00647, ko:K03801; 보충표 3)와 관련이 있었습니다. ko:K21279와 관련된 유전자는 PPA 샘플에서 유의미하게 많은 종을 포함하는 속 중 하나인 Bacteroides 속과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 효소는 캡슐 다당류를 발현함으로써 면역 반응을 회피할 수 있습니다(Wang et al., 2008). 이는 PPA에 노출된 쥐에서 관찰된 박테로이데스(Bacteroidetes)의 증가를 설명할 수 있습니다. 이는 PPA 미생물군에서 관찰된 지방산 합성 증가와도 일맥상통합니다. 박테리아는 FASIIko:K00647(fabB) 경로를 이용하여 지방산을 생성하는데, 이는 숙주의 대사 경로에 영향을 미칠 수 있으며(Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), 지질 대사의 변화는 신경 발달에 중요한 역할을 할 수 있습니다(Yu et al., 2020). PPA 샘플에서 풍부도가 증가한 또 다른 경로는 스테로이드 호르몬 생합성(ko:K12343)입니다. 장내 미생물이 호르몬 수치에 영향을 미치는 능력과 호르몬의 영향을 받는 능력 사이에는 역관계가 있다는 증거가 점점 늘어나고 있으며, 따라서 스테로이드 수치 상승은 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다(Tetel et al., 2018).
본 연구에는 몇 가지 한계점과 고려 사항이 있습니다. 중요한 차이점은 동물의 생리적 평가를 수행하지 않았다는 점입니다. 따라서 장내 미생물군 변화가 특정 질병과 관련이 있는지 직접적으로 결론을 내릴 수는 없습니다. 또 다른 고려 사항은 본 연구에 사용된 쥐들이 어미와 동일한 사료를 섭취했다는 점입니다. 향후 연구에서는 PPA 함량이 높은 사료에서 PPA가 없는 사료로 전환했을 때 장내 미생물군에 미치는 영향이 개선되는지 확인할 수 있을 것입니다. 다른 많은 연구와 마찬가지로 본 연구의 한계점 중 하나는 표본 크기가 작다는 것입니다. 타당한 결론을 도출할 수는 있지만, 표본 크기를 늘리면 결과 분석 시 통계적 검정력이 향상될 것입니다. 또한 장내 미생물군 변화와 특정 질병 간의 연관성에 대한 결론을 내리는 데에는 신중해야 합니다(Yap et al., 2021). 연령, 성별, 식단과 같은 교란 변수는 미생물 구성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 요인들은 장내 미생물군과 복합 질환 간의 연관성에 대한 기존 연구 결과의 불일치를 설명할 수 있습니다(Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). 예를 들어, 박테로이데테스(Bacteroidetes) 속의 구성원은 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 가진 동물과 인간에서 증가하거나 감소하는 것으로 나타났습니다(Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). 마찬가지로, 염증성 장 질환 환자의 장내 미생물 구성 연구에서도 동일한 분류군의 증가와 감소가 모두 관찰되었습니다(Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). 성별 편향의 영향을 최소화하기 위해, 우리는 남녀를 동등하게 대표하여 차이가 식단에 의해 발생했을 가능성이 가장 높도록 노력했습니다. 기능 주석의 한 가지 어려움은 중복되는 유전자 서열을 제거하는 것입니다. 우리의 유전자 클러스터링 방법은 잘못된 클러스터링을 제거하기 위해 95%의 서열 동일성, 85%의 길이 유사성, 그리고 90%의 정렬 범위를 요구합니다. 그러나 일부 경우, 동일한 주석을 가진 COG(예: MUT)가 관찰되었습니다(그림 6). 이러한 상동 유전자들이 서로 구별되는지, 특정 속과 연관되어 있는지, 아니면 유전자 클러스터링 접근 방식의 한계인지 여부를 판단하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 기능 주석의 또 다른 한계는 오분류 가능성입니다. 세균 유전자 mmdA는 프로피온산 합성에 관여하는 효소로 알려져 있지만, KEGG는 이를 프로피온산 대사 경로와 연관시키지 않습니다. 반면, scpB와 mmcD 상동 유전자는 서로 관련되어 있습니다. 지정된 녹아웃이 없는 유전자가 많기 때문에 유전자 풍부도를 평가할 때 PPA 관련 유전자를 식별하지 못할 수 있습니다. 향후 연구에서는 장내 미생물의 기능적 특성을 더 깊이 이해하고 유전자 발현과 잠재적인 하류 효과를 연결하는 데 도움이 될 수 있는 메타전사체 분석이 유용할 것입니다. 특정 신경발달 장애 또는 염증성 장 질환과 관련된 연구에서는 미생물 구성의 변화와 이러한 질환 간의 연관성을 파악하기 위해 동물의 생리적 및 행동적 평가가 필요합니다. 또한, 장내 미생물을 무균 쥐에 이식하는 추가 연구를 통해 미생물이 질병의 원인인지 또는 특징인지 여부를 확인할 수 있을 것입니다.
요약하자면, 본 연구는 식이성 PPA가 장내 미생물 구성 변화에 영향을 미치는 요인임을 입증했습니다. PPA는 FDA 승인을 받은 방부제로 다양한 식품에 널리 함유되어 있으며, 장기간 노출될 경우 정상적인 장내 미생물총을 교란시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 여러 박테리아의 풍부도 변화를 관찰했으며, 이는 PPA가 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 미생물총의 변화는 특정 대사 경로의 변화를 초래하고, 이는 숙주의 건강과 관련된 생리적 변화로 이어질 수 있습니다. 식이성 PPA가 미생물 구성에 미치는 영향이 장내 미생물 불균형이나 다른 질병으로 이어지는지 여부를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 본 연구는 PPA가 장내 미생물 구성에 미치는 영향이 인체 건강에 미치는 영향을 규명하는 향후 연구의 기초를 마련합니다.
본 연구에 사용된 데이터 세트는 온라인 저장소에서 이용 가능합니다. 저장소 이름과 접근 번호는 다음과 같습니다: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
본 동물 실험은 센트럴 플로리다 대학교 동물실험윤리위원회(UCF-IACUC)의 승인을 받았습니다(동물 사용 허가 번호: PROTO202000002). 본 연구는 관련 법률, 규정 및 기관의 요구 사항을 준수합니다.
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게시 시간: 2025년 4월 18일