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척추동물과 달리 곤충은 수컷에게 특화된 성 스테로이드 호르몬이 없는 것으로 널리 알려져 있습니다. 아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae) 모기에서는 엑디손 스테로이드인 20-하이드록시에크디손(20E)이 암컷에 의해 합성될 때는 난자 발달을 조절하고, 수컷에 의해 성적으로 전달될 때는 짝짓기 불응기를 유도하도록 진화한 것으로 보입니다.2,3 난자 발달과 짝짓기는 필수적인 생식 특성이므로, 아노펠레스 모기 암컷이 이러한 호르몬 신호를 어떻게 통합하는지 이해하는 것은 새로운 말라리아 방제 프로그램을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 연구에서는 이러한 생식 기능이 엑디스테로이드 활성화/비활성화 효소의 복잡한 네트워크를 통해 서로 다른 성 스테로이드에 의해 조절됨을 밝힙니다. 우리는 수컷 특이적인 산화형 엑디손인 3-데하이드로-20E(3D20E)를 확인했는데, 이는 성적 전달 후 탈인산화에 의해 활성화되어 암컷의 성적 수용성을 차단함으로써 친자 관계를 보호합니다. 특히, 3D20E 전달은 짝짓기 불응기를 유도하기도 했습니다. 20E는 말라리아 원충 감염 중 난자 발달을 유지하는 생식 유전자의 발현을 조절하여 감염된 암컷의 건강을 보장합니다. 암컷에서 생성되는 20E는 성적 반응을 유발하지는 않지만, 20E 억제 키나아제를 억제하면 짝짓기하는 개체가 산란할 수 있게 합니다. 이 수컷 특이적 곤충 스테로이드 호르몬의 발견과 암컷의 성적 수용성, 생식력 및 말라리아 원충과의 상호작용 조절에서의 역할은 말라리아를 매개하는 모기의 번식 성공률을 낮출 수 있는 가능성을 시사합니다.
인간 말라리아 기생충의 유일한 매개체인 아노펠레스 모기의 광범위한 살충제 내성으로 인해 말라리아 발병 사례와 사망자 수가 다시 증가하고 있습니다.4 이 모기의 짝짓기 생물학은 암컷이 단 한 번만 짝짓기를 하기 때문에5 새로운 말라리아 통제 개입을 위한 특히 매력적인 목표입니다. 이 단일 짝짓기 행사를 불임으로 만들면 야외에서 모기 개체 수를 줄이는 데 큰 잠재력이 있습니다.
암컷은 수컷으로부터 고농도의 스테로이드 호르몬을 투여받은 후 성적으로 무력해집니다. 연구에 따르면 짝짓기 어려움의 원인은 유충 단계의 탈피 주기를 조절하는 것으로 잘 알려진 스테로이드 호르몬인 20-하이드록시에크디손(20E)입니다. 수컷이 20E를 합성하고 전달하는 능력은 아프리카에 분포하며 말라리아의 가장 위험한 매개체인 아노펠레스 감비아를 포함하는 셀리아7 아속에 속하는 아노펠레스 종에서 특히 진화했습니다. 이는 이 종의 암컷 또한 흡혈 후 20E를 생성하고, 20E가 난자 형성 주기를 유도한다는 점에서 특히 주목할 만합니다(참고문헌 8 참조). 그러나 암컷이 짝짓기 능력을 손상시키지 않고 두 가지 다른 에크디손 공급원(수컷으로부터의 전달과 흡혈 유도)으로부터 오는 신호를 어떻게 통합하는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 실제로 암컷이 생성하는 20E가 성적 불내성을 유발한다면, 이는 결국 짝짓기로 이어질 것입니다. 처녀 흡혈 개체의 불임으로 이어지는데, 이는 이 모기에서 매우 흔한 행동입니다.5
가능한 설명은 A. gambiae 수컷이 변형된 수컷 특이적 엑디손을 전달하여 암컷 생식 기관에서 신호 전달 연쇄 반응을 활성화시켜 짝짓기 불안정성을 유발한다는 것입니다. 그러나 척추동물은 에스트로겐과 안드로겐과 같은 여러 스테로이드 호르몬을 가지고 있지만(참고문헌 9 참조), 우리가 아는 한 곤충에서는 안드로겐 편향 스테로이드가 확인되지 않았습니다.
본 연구에서는 성숙한 A. gambiae 수컷 부속샘(MAG)에서 스테로이드 호르몬의 종류를 규명하고, 조절 스테로이드를 탐색하고자 하였다. 기존에 사용되던 특이성이 낮은 방법 대신 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS)을 이용하여 해당 조직에서 엑디손(E)과 20E를 검출하였고, 이는 기존 연구 결과와 일치한다. 그러나 분석 결과, 시료에는 산화된 인산화 스테로이드가 주를 이루었으며, 이는 3-데하이드로-20E-22-인산(3D20E22P)¹²의 화학식과 일치하였다(그림 1). 다른 형태로는 3-데하이드로-20E(3D20E)와 20E-22-인산(20E22P)이 존재하였다. 3D20E22P의 HPLC-MS/MS 신호 강도는 탈인산화 형태인 3D20E보다 두 자릿수, 세 자릿수 높았다. E와 20E(그림 1). 다른 신체 부위와 하부 생식관(LRT; 확장 데이터 그림 1a)에서도 엑디스테로이드가 검출되었다. 또한, 새로 폐쇄된(<1일) 수컷과 암컷의 엑디스테로이드를 분석한 결과, 3D20E와 3D20E22P는 MAG에서만 검출되었고, E, 20E, 20E22P는 암수 모두에서 검출되었다(확장 데이터 그림 1b). 이러한 데이터는 A. gambiae 성체 수컷이 암컷에서는 합성되지 않는 고농도의 조절 호르몬을 MAG에서 생성한다는 것을 시사한다.
4일령(4 day-old) 수컷과 교미 후 0.5, 3, 12시간이 지난 암컷에서 MAG와 암컷 LRT(심방, 정낭, 난소주위조직 포함)를 적출하였다. 이들 조직의 엑디손 함량은 HPLC-MS/MS로 분석하였다(평균 ± 표준오차; 비쌍 t-검정, 양측 검정, 거짓 발견율(FDR) 보정; NS, 유의하지 않음; *P < 0.05, **P < 0.01). 3D20E: 3시간 vs. 0.5시간, P = 0.035; 12시간 vs. 3시간, P = 0.0015; 12시간 vs. 0.5시간, P = 0.030. 3D20E22P: 3시간 vs. 0.5시간, P = 0.25; 12시간 vs. 3시간 12시간 대 0.5시간, P = 0.0032; 12시간 대 0.5시간, P = 0.015). 데이터는 3개의 생물학적 반복 실험에서 얻은 것입니다. 각 엑디손의 피크 면적을 계산하고 모기 개체 수로 정규화했습니다. 엑디손은 다음과 같이 색상으로 표시됩니다. E: 녹색; 20E: 주황색; 20E22P: 보라색; 3D20E: 파란색; 3D20E22P: 분홍색. 삽입 그림은 y축의 스케일을 확대하여 낮은 엑디손 수치를 보여줍니다.
3D20E22P와 3D20E가 교미 중에 전달되는지 조사하기 위해, 교미 후 다양한 시점에서 암컷의 장간막(LRT)을 해부했습니다. 처녀 암컷에서는 엑디손이 발견되지 않았지만, 교미 직후(교미 후 0.5시간) 장간막에서 상당량의 3D20E22P가 관찰되었고, 이는 시간이 지남에 따라 감소하는 반면, 3D20E 수치는 유의하게 증가했습니다(그림 1). 화학적으로 합성된 3D20E를 표준 물질로 사용하여, 교미 중인 장간막에서 이 스테로이드 호르몬의 수치가 20E보다 최소 100배 이상 높다는 것을 확인했습니다(확장 데이터 표 1). 따라서 3D20E22P는 교미 중에 암컷 장간막으로 전달되는 주요 수컷 엑디손이며, 탈인산화 형태인 3D20E는 교미 직후에 매우 풍부해집니다. 이는 후자의 엑디손이 암컷의 교미 후 생식 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 생물학.
맞춤형 생물정보학 파이프라인을 사용하여 새로운 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 데이터 세트를 생성한 후(그림 2a), 엑디손 키나제(EcK), 엑디손 산화효소(EO) 및 엑디손을 코딩하는 20E-변형 인산가수분해효소 유전자(EPP)를 탐색했습니다. EPP는 생식 조직에서 발현됩니다. 우리는 하나의 후보 EPP 유전자와 두 개의 잠재적 EcK 유전자(EcK1 및 EcK2)를 확인했지만, 적합한 후보 EO 유전자는 찾지 못했습니다. 특히, 개별 EPP 유전자는 감비아 수컷 생식세포(MAG)에서는 높은 수준(98.9 백분위수)으로 발현되었지만 암컷 생식세포(LRT)에서는 발현되지 않았습니다(그림 2b). 이는 3D20E22P의 탈인산화가 암컷 조직에서 발생하기 때문에 우리의 예상과 상반되는 결과입니다. 따라서 우리는 수컷 EPP가 짝짓기 과정에서 전달될 수 있다고 생각합니다. 실제로, 우리는 생체 내 안정 동위원소 표지법을 사용하여 짝짓기 후 암컷 단백질을 마스킹했으며, 이 효소는 질량 분석법(MS)으로 확인되었습니다. 암컷 심방에서(그림 2c 및 보충표 1). MAG와 교미한 암컷(미혼 암컷은 아님) LRT에서 EPP의 존재는 특정 항체를 사용하여 확인되었습니다(그림 2d).
a. 각 성별의 생식 조직에서 EcK, EO 및 EPP를 코딩하는 유전자를 검색하기 위해 맞춤 제작된 생물정보학 파이프라인. 화살표 옆의 숫자는 각 단계에서 수컷 및 암컷 후보의 수를 나타냅니다. 이 분석을 통해 수컷에서 발현되는 EPP 유전자(EPP) 1개와 EcK 유전자(EcK1) 1개, 그리고 양성 모두에서 발현되지만 EO 유전자 후보는 생성하지 않는 EcK 유전자(EcK2) 1개가 확인되었습니다. b. 처녀(V) 및 교미(M) 상태의 Anopheles gambiae와 Anopheles albicans 조직에서 후보 유전자 발현을 비교하는 히트맵. Spca: 수정; MAGs: 수컷의 부속샘; 유방, 날개, 다리, 지방체, 내장 기관을 포함한 다른 신체 부위(암수 모두)와 암컷의 난소에서도 발견됩니다. EcK2는 감비아의 MAG와 심방 모두에서 높은 발현량을 보이는 반면, EPP는 MAG에서만 발견됩니다. c, 교미 후 3, 12, 24시간에 암컷 심방으로 이동한 수컷 정액 그룹의 단백질체 분석을 통해 가장 풍부한 67개의 단백질을 보여줍니다. 암컷은 모든 단백질을 표지(및 마스킹)하기 위해 15N이 함유된 사료로 사육되었습니다. 표지되지 않은 수컷을 표지된 암컷과 교미시키고, ​​암컷의 LRT를 교미 후 3, 12, 24시간에 해부하여 단백질체 분석을 수행했습니다(정액 단백질의 전체 목록은 보충표 1 참조). 삽입 그림, EPP, Eck1 및 EcK2는 이들 조직의 단백질체 분석을 통해 처녀 수컷의 MAG에서 검출되었습니다. d, EPP는 교미한 암컷의 MAG와 LRT에서 웨스턴 블롯으로 검출되었지만 다른 부위에서는 검출되지 않았습니다. 처녀 암컷 또는 수컷, 혹은 암컷 신체의 나머지 부위. 막은 항액틴 항체(로딩 컨트롤)와 항EPP 항체로 동시에 프로빙하였다. 모든 수컷은 처녀이다. 겔 원본 데이터는 보충 그림 1을 참조하라. 웨스턴 블롯은 유사한 결과로 두 번 수행되었다.
MAG에서 분리한 3D20E22P와 함께 배양한 후 HPLC-MS/MS를 이용하여 EPP의 엑디스테로이드 포스포포스파타제 활성을 확인하였다(확장 데이터 그림 2a). 또한, RNA 매개 간섭(RNAi)을 통해 EPP를 침묵시켰을 때, 수컷의 생식 조직에서 포스포포스파타제 활성이 크게 감소하는 것을 관찰하였다(그림 3a). EPP가 침묵된 수컷과 교미한 암컷은 부분적인 유전자 침묵에도 불구하고(확장 데이터 그림 2b,c) 탈인산화된 3D20E의 비율이 유의미하게 낮아진 것을 보였다(그림 3b). 대조적으로, 동일한 모기에서 20E22P/20E 비율의 유의미한 변화는 관찰되지 않았는데, 이는 해당 효소가 3D20E22P에 특이적임을 시사한다(그림 3b).
a. 이중 가닥 EPP RNA(dsEPP) 또는 이중 가닥 GFP RNA(dsGFP) 대조군을 사용하여 EPP 침묵에 의해 MAG에서 인산가수분해효소 활성이 감소되었습니다. 각 반복 실험에는 20개의 MAG 풀이 사용되었으며(P = 0.0046, 쌍체 t-검정, 양측 검정), 이는 점으로 표시됩니다. b. EPP 침묵 수컷과 교미한 암컷은 교미 후 3시간에 탈인산화된 3D20E의 비율이 유의하게 낮았지만(P = 0.0043, 비쌍체 t-검정, 양측 검정), 20E 수준은 영향을 받지 않았습니다(P = 0.063, 비쌍체). t-검정(양측 검정). 데이터는 각각 13, 16, 19마리의 암컷으로 구성된 세 그룹에서 얻은 평균 ± 표준오차로 제시됩니다. c, EPP 발현이 억제된 수컷과 짝짓기한 암컷은 재짝짓기 비율이 유의하게 더 높았습니다(P = 0.0002, Fisher의 정확 검정, 양측 검정). 암컷은 짝짓기 상태를 확인하기 위해 먼저 강제로 짝짓기를 시켰습니다. 2일 후, 형질전환 정자를 가진 다른 수컷과 접촉시켜 형질전환 유전자의 정량적 PCR 검출을 통해 재교미율을 평가했습니다. EPP 발현이 억제된 수컷과 교미한 흡혈 암컷은 생식력이 유의하게 감소했고(P < 0.0001; Mann-Whitney 검정, 양측 검정), 산란수는 약간 감소했지만(P = 0.088, Mann-Whitney 검정, 양측 검정), 산란율은 영향을 받지 않았습니다(P = 0.94, Fisher의 정확 검정, 양측 검정). 모든 패널에서 n은 생물학적으로 독립적인 모기 샘플 수를 나타냅니다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
다음으로, 우리는 엑디손 탈인산화가 암컷의 짝짓기 저항성을 유도하는 데 중요한 역할을 하는지 평가했습니다. 특히, EPP가 고갈된 수컷과 짝짓기를 한 암컷은 추가적인 (형질전환) 수컷에 노출되었을 때 대조군 암컷(10.4%)보다 훨씬 높은 빈도(44.9%)로 재짝짓기를 했습니다(그림 3c). 또한, 이러한 암컷의 생식력이 현저하게 감소하고(그림 3d, 왼쪽) 산란량이 약간 감소하는 것을 관찰했습니다(그림 3d, 가운데). 반면, 암컷이 산란하는 비율(짝짓기에 의해 암컷에서 유발되는 또 다른 반응)은 영향을 받지 않았습니다(그림 3d, 오른쪽). EPP가 3D20E22P에 대해 특이성을 보이는 것을 고려할 때, 이러한 결과는 짝짓기 동안 전달된 EPP에 의한 3D20E 활성화가 암컷의 추가 짝짓기에 대한 수용성을 차단하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이는 이전에 20E의 성적 전달에 기인하는 것으로 여겨졌던 행동입니다. 따라서, 남성 특이 호르몬은 여성의 생식 능력에도 강한 영향을 미칩니다.
다음으로, 화학적으로 합성된 3D20E(그림 4a–c)와 시판되는 20E를 사용하여 성적으로 성숙한 처녀 암컷에 대한 주사 실험에서 20E와 3D20E의 활성을 비교했습니다. 두 농도 모두에서 3D20E가 20E보다 암컷의 교미 민감도를 차단하는 데 훨씬 더 효과적임을 관찰했습니다(그림 4d). 특히, LRT에서 3D20E의 생리적 농도의 절반(주사 후 1,066 pg vs. 교미 후 2,022 pg)은 최고 농도인 교미 후 18 pg로 주사했을 때 주사 24시간 후 20E의 생리적 농도(주사 후 361 pg)보다 20배 더 높은 비율의 불응성 암컷을 유도했습니다. 확장 데이터 표 1). 이 결과는 20E의 성적 전달이 짝짓기 불응기를 유발하지 않는다는 개념과 일치하며, 3D20E가 부모-자식 관계를 보장하는 주요 요인임을 시사합니다. 또한, 3D20E는 처녀 암컷의 산란 실험에서 20E보다 유의미하게 더 활성이 높았습니다(그림 4e). 이는 부분적인 EPP 억제 후 관찰된 정상적인 산란율이 짝짓기 유도 암컷 요인에 의해 여전히 생성된 잔류 3D20E 활성 때문임을 시사합니다.
(a,b) 20E로부터 화학적으로 합성된 3D20E (a)는 매우 높은 전환율/효율을 보였다(데이터는 세 번의 독립적인 합성 반응에서 얻은 평균 ± 표준오차로 제시됨) (b).c, 질량 스펙트럼(하단)은 교미한 암컷 LRT에서 발견된 엑디손(상단)과 정확히 일치한다.d, 20E(0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher의 정확 검정, 양측 검정) 및 10% 에탄올(0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher의 정확 검정, 양측 검정)과 비교했을 때, 20E는 고용량에서만 대조군보다 유의하게 높은 농도를 보였다(0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fisher의 정확 검정). 3D20E 주사는 10% 에탄올 대조군보다 처녀 암컷의 산란율을 유의하게 높였습니다(0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fisher의 정확 검정, 양측 검정). 반면 20E는 고용량에서만 대조군과 비교했을 때 유의한 차이를 보였습니다(0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fisher의 정확 검정, 양측 검정). 3D20E는 고용량에서 20E보다 유의하게 높은 산란율을 유도했습니다(0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fisher의 정확 검정, 양측 검정). 모든 패널에서 n은 생물학적으로 독립적인 모기 샘플 수를 나타냅니다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01 ***P < 0.001, ****P < 0.001. 데이터는 3회 반복 실험에서 얻은 결과입니다.
이전 연구에서 우리는 스테로이드 호르몬의 성적 전달이 암컷 모기(A. gambiae)를 말라리아 원충(P. falciparum) 감염으로부터 보호하는 암컷 생식 유전자 MISO(Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11)의 발현을 유도한다는 것을 확인했습니다. 말라리아 유행 지역에서 아노펠레스 모기의 생식 적합성에 MISO가 중요하다는 점을 고려하여, 우리는 3D20E와 20E 중 어떤 호르몬이 이 유전자의 발현을 유도하는지 알아보기로 했습니다. 그 결과, 20E 주사는 HR3 및 HR4와 같은 일부 핵 호르몬 수용체(HR)와 난황 생성 유전자 Vg14, 15, 16과 같은 전형적인 하류 스테로이드 표적의 발현을 특이적으로 또는 더 강력하게 유도하는 반면, MISO는 3D20E에 의해 더 강하게 유도되는 것을 발견했습니다(확장 데이터 그림 3). 따라서, 이 안드로겐성 스테로이드 호르몬의 성적 전달은 특정 메커니즘을 유도하는 것으로 보입니다. 이는 기생충 감염으로 인한 피해로부터 암컷을 보호합니다. 또한, 3D20E는 에크디손 수용체 EcR의 두 가지 동형 단백질에 차별적으로 영향을 미쳐 EcR-A를 유도하고 EcR-B를 억제하며, 암컷의 생식능력에 영향을 미치는 HPX15를 포함한 다른 짝짓기 유도 유전자들을 더욱 강력하게 활성화시킵니다. 이는 EPP 발현이 억제된 수컷과 짝짓기한 암컷에서 관찰되는 상당한 불임을 설명할 수 있습니다(확장 데이터 그림 3). 이러한 데이터는 성별 특이적 기능의 기저에 있을 수 있는 두 가지 엑디손 호르몬에 의해 우선적으로 활성화되는 하위 경로의 존재를 시사합니다.
다음으로, 생물정보학 파이프라인에서 확인된 두 개의 EcK 유전자의 기능을 테스트했습니다. EcK1 또는 EcK2를 억제하면 수컷에서 사망률이 현저히 증가했습니다(확장 데이터 그림 4a). 이는 엑디손 인산화, 즉 불활성화가 생존에 중요함을 시사합니다. EcK2는 EcK1보다 높은 수준으로 발현되었고 단백질체학 분석을 통해 MAG에서 검출되었기 때문에(그림 2b,c 및 보충표 2), 20E와 함께 배양하여 엑디스테로이드 키나제 활성을 검증했습니다. 그 결과 20E22P 인산화가 생성되었습니다(확장 데이터 그림 2b). 3D20E를 기질로 사용했을 때는 인산화 생성물인 3D20E22P가 검출되지 않았습니다(확장 데이터 그림 4c). 이는 3D20E보다는 20E가 EcK2의 선호 표적일 수 있음을 시사합니다.
RNA-seq 분석 결과, EcK2는 처녀 암컷의 LRT에서도 높은 발현량을 보였으며, 교미 후에는 발현이 억제되었습니다(그림 2b). 이러한 데이터를 확인한 결과, EcK2 발현은 혈액 섭취에 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다(확장 데이터 그림 5a). 초기 MS 실험을 확장하여, 20E22P의 피크가 20E의 피크와 밀접한 관련이 있음을 확인했습니다(혈액 섭취 후 22-26시간; 확장 데이터 그림 5b). 처녀 암컷에서 EcK2를 억제한 결과, 혈액 섭취 후 26시간에 20E와 20E22P의 상대적 비율이 3배 증가했습니다(확장 데이터 그림 2c 및 5c). 이는 EcK2가 암컷에서도 20E를 인산화한다는 것을 확인시켜 줍니다. 특히, EcK2가 결핍된 처녀 암컷은 완전한 성적 수용성을 유지했습니다(확장 데이터 그림 5d,e). 이는 암컷에서 20E22P 생성이 EcK2에 의해 조절됨을 시사합니다. 20E는 짝짓기 불응기를 유도하지 않습니다. 그러나 이 암컷들은 대조군에 비해 산란율이 현저히 증가했으며, 처녀 암컷의 30% 이상이 산란했습니다(확장 데이터 그림 5f). 혈액 섭취 후 이중 가닥 Eck2 RNA(dsEcK2)를 주입했을 때 산란은 일어나지 않았는데, 이는 혈액 섭취로 인한 20E 최고치가 감소한 시점이었습니다. 전반적으로 이러한 결과는 혈액 섭취 후 생성된 20E가 산란을 유도할 수 있지만, 짝짓기를 통해 산란 억제 인자(EcK2 및 기타 인자)가 해제될 때만 가능하다는 모델을 뒷받침합니다. 20E 또는 3D20E 주입 모두 처녀 암컷에서 EcK2 발현을 억제하지 않았는데(확장 데이터 그림 5g), 이는 다른 인자가 이 키나아제의 억제를 매개한다는 것을 시사합니다. 그러나 혈액 섭취 후 20E 수치는 짝짓기 불편함을 유도하기에 충분하지 않았지만, 성적으로 전달된 높은 역가의 20E에 의해 효과적으로 유발되었습니다. 3D20E.
본 연구 결과는 A. gambiae의 번식 성공을 조절하는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 수컷은 암컷의 짝짓기 감수성을 저하시켜 부모 관계를 보장하는 수컷 특이적 변형 엑디손인 3D20E를 고농도로 합성하도록 진화해 왔다는 모델이 제시되었습니다. 동시에, 이 말라리아 매개체는 수컷 특이적 EPP의 성적 전달에 반응하여 암컷에서 3D20E를 활성화하는 효율적인 시스템도 진화시켜 왔습니다. 저희가 아는 한, 이는 곤충에서 독특하고 중요한 기능을 수행하는 수컷 및 암컷 우세 스테로이드 호르몬 시스템의 첫 번째 사례입니다. 수컷 특이적 엑디손 기능은 가설로 제시되었지만 확실하게 입증되지는 않았습니다. 예를 들어, 이러한 기능이 20E 전구체인 E1에 의해 수행될 수 있다는 가설은 대부분 반박되었습니다. 18 초파리에서는 암컷을 지배하는 신경 세포와 상호 작용하는 작은 성 펩타이드의 성적 전달에 의해 일부일처제가 유발된다는 것이 잘 알려져 있습니다. 19,20 특정 성 펩타이드 수용체21,22를 통해 생식 기관에 작용합니다. A. gambiae 암컷에서 3D20E에 의해 제어되는 하위 신호 전달 경로를 확인하고 이러한 경로가 모기와 초파리 사이에서 보존될 수 있는지 여부를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
본 연구에서 밝혀진 바와 같이 3D20E가 암컷의 생식력과 행동에 중요한 역할을 한다는 점을 고려할 때, 3D20E 합성과 활성화 경로는 미래의 모기 방제 전략에 새로운 가능성을 제시합니다. 예를 들어, 불임 곤충 기술 전략에서 경쟁력 있는 불임 수컷을 생성하거나, 야생 방사에 사용하거나, 처녀 생식에서 3D20E를 모방하는 데 활용할 수 있습니다. 3D20E의 수컷 특이적 기능은 A. gambiae와 다른 Cellia 종들이 정액을 응고시켜 교미 마개를 형성하는 능력을 획득하면서 진화했을 가능성이 있습니다. 이는 다량의 호르몬과 호르몬 활성화 효소를 효율적으로 전달할 수 있게 해주기 때문입니다. 또한, 일부일처제를 구현하는 3D20E의 진화는 암컷이 (MISO의 높은 발현을 통해) 말라리아 유병률이 높은 지역에서 생식 적합성을 높이는 메커니즘을 제공하며, 이는 간접적으로 플라스모디움 전파에 기여합니다. 암컷 20E가 암컷에서 P. falciparum의 생존과 성장에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다는 점을 감안할 때, 아노펠레스 모기24의 경우 수컷과 암컷 스테로이드 호르몬 경로는 이제 모기-기생충 상호작용의 핵심 측면입니다.
A. gambiae G3 계통은 표준 곤충 사육 조건(26-28°C, 상대 습도 65-80%, 12:12시간 광주기)에서 사육되었습니다. 유충은 분말 형태의 어류 사료(TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets 및 Tetra Pond Sticks를 7:7:2의 비율로 혼합)를 먹였습니다. 성충 모기는 10% 포도당 용액을 자유롭게 섭취하도록 하였고, 매주 사람 혈액(연구용 혈액 성분)을 공급했습니다. 암수 구분을 통해 번데기 단계에서 암수를 분리하여 암수 구별이 가능한 미수정 모기를 얻었습니다. DsRed 유전자를 보유한 수컷 모기는 이전에 기술된 바 있습니다.
강제 교미 실험은 이전에 설명된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 자연 교미의 경우, 생후 4일 된 처녀 암컷을 성적으로 성숙한 처녀 수컷과 1:3 비율로 2박 동안 함께 사육했습니다. 수컷에게 dsEPP를 주입한 실험에서는 인산가수분해효소 활성이 최대치로 억제되는 주입 후 3~4일째에 함께 사육했습니다(확장 데이터 그림 2b).
모기 조직, 나머지 사체(몸통의 나머지 부분), 또는 전체 몸체를 100% 메탄올에 넣고 비더(2mm 유리 비드, 2,400rpm, 90초)를 사용하여 균질화했습니다. 조직의 양과 메탄올 부피는 다음과 같습니다. 나머지 몸체: 50개/1,000µl; MAG: 50~100개/80µl; 암컷 LRT: 25~50개/80µl. 침전물을 동일한 부피의 메탄올로 두 번째 추출했습니다. 세포 잔해는 원심분리를 통해 제거했습니다. 두 추출액의 메탄올을 합쳐 질소 기류 하에서 건조시킨 후, 다음과 같은 부피의 80% 메탄올 수용액에 재현탁했습니다. 나머지 몸체: 50µl; MAG 및 암컷 LRT: 30µl.
시료는 LC 기기(Vanquish, Thermo Fisher)에 연결된 질량 분석기(ID-X, Thermo Fisher)를 사용하여 분석했습니다. 시료 5 µl를 25 °C로 유지된 3 µm, 100 × 4.6 mm 컬럼(Inspire C8, Dikma)에 주입했습니다. LC 이동상은 A(물, 0.1% 포름산)와 B(아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 사용했습니다. LC 그래디언트는 다음과 같습니다: 1분 동안 5% B 유지 후 11분 동안 100% B까지 증가시켰습니다. 100% B에서 8분 유지 후 5% B에서 4분 동안 재평형화했습니다. 유속은 0.3 ml min⁻¹였습니다. MS 소스에서의 이온화는 양이온 및 음이온 모드에서 가열 전기분무 이온화(ESI)를 통해 이루어졌습니다.
질량 분석기는 풀 MS 모드에서 60,000 해상도로 m/z 범위 350~680의 데이터를 측정합니다. MS/MS 데이터는 [M + H]+ (모든 표적), [M - H2O + H]+ (모든 표적) 및 [M - H]- (인산화된 표적)에 대해 수집되었습니다. MS/MS 데이터는 표준 물질이 없는 표적의 엑디손 특성을 확인하는 데 사용되었습니다. 비표적 엑디스테로이드를 식별하기 위해 상대적 존재 비율이 15% 이상인 모든 HPLC 피크의 MS/MS 데이터를 분석했습니다. 순수 표준 물질(20E, 3D20E)로 생성된 표준 곡선을 사용하여 정량화하고, 특정 샘플(다른 모든 표적)의 절대량 또는 희석량을 계산하여 한 남성에서 발견된 양과의 등가성을 계산했습니다. 3D20E의 경우, 다음 부가물의 합을 사용하여 정량화했습니다: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + [Cl]-, [M + NO3]-. 데이터는 Tracefinder(버전 4.1)를 사용하여 추출 및 정량화되었습니다. MS/MS 데이터는 Xcalibur(버전 4.4)를 사용하여 분석되었습니다. E, 20E 및 3D20E의 MS 스펙트럼은 각각의 표준 물질과 비교되었습니다. 3D20E22P는 Girard 시약을 이용한 유도체화로 분석되었고, 20E22P는 m/z 비율로 분석되었습니다.
3D20E22P는 MAG로부터 정제되었습니다. 정제는 HPLC-MS/MS 분석과 동일한 LC 조건에서 사중극자 질량 검출기(QDa, Acquity, Waters)가 장착된 초고성능 액체 크로마토그래프(Acquity, Waters)를 사용하여 분석 규모로 수행되었습니다. 분획 수집은 이전에 결정된 것과 동일한 유지 시간에서 3D20E22P에 해당하는 m/z 값이 검출되었을 때 시작되었습니다. 추출된 화합물의 순도는 위에서 설명한 바와 같이 HPLC-MS/MS를 사용하여 확인되었습니다.
제조사의 지침에 따라 TRI 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 10-12개의 생식 조직 또는 기타 신체 부위(머리 제외)에서 총 RNA를 추출했습니다. 추출된 RNA는 TURBO DNase(Thermo Fisher)로 처리했습니다. 제조사의 지침에 따라 Moloney 생쥐 백혈병 바이러스 역전사효소(M-MLV RT; Thermo Fisher)를 사용하여 cDNA를 합성했습니다. 역전사 정량 PCR(RT-qPCR; 확장 데이터 표 2)에 사용된 프라이머는 이전에 발표된 논문24을 참고하거나 Primer-BLAST26을 사용하여 설계했으며, 엑손-엑손 접합부를 포함하는 70-150 bp 크기의 산물을 우선적으로 고려하거나 엑손을 분리하는 프라이머 쌍을 사용했습니다. 3-4개의 생물학적 반복 실험에서 얻은 cDNA 샘플을 RT-qPCR을 위해 물에 4배 희석했습니다. 정량은 1× PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher), 프라이머, 희석된 cDNA 5 µl를 포함하는 15 µl 반복 반응에서 수행했습니다. QuantStudio 6 Pro 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher)에서 실행되었고 데이터는 Design and Analysis(버전 2.4.3)를 사용하여 수집 및 분석되었습니다. 본 연구에서 입증된 바와 같이 상대적 양은 혈액 공급 27 또는 교미 3에 따라 발현이 크게 변하지 않은 리보솜 유전자 RpL19(AGAP004422)에 대해 정규화되었습니다.
RNA 품질은 Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer(Agilent)를 사용하여 확인했습니다. Illumina 페어드 엔드 라이브러리는 MIT와 하버드 대학교의 브로드 연구소에서 제작 및 시퀀싱했습니다. 시퀀싱 데이터는 HISAT2(버전 2.0.5)를 기본 매개변수로 사용하여 A. gambiae 게놈(PEST 균주, 버전 4.12)에 정렬했습니다. 매핑 품질(MAPQ) 점수가 30 미만인 데이터는 Samtools(버전 1.3.1)를 사용하여 제거했습니다. 유전자에 매핑된 리드 수는 htseq-count(버전 0.9.1)를 기본 매개변수로 사용하여 계산했습니다. 정규화된 리드 수를 계산하고, R(버전 4.0.3)의 DESeq2 패키지(버전 1.28.1)를 사용하여 차등 유전자 발현을 분석했습니다.
엑디손 변형 유전자 후보는 먼저 PSI-BLAST 알고리즘(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/)을 사용하여 A. gambiae 게놈을 검색하고, 다음 쿼리 단백질 서열을 기본값으로 설정하여 식별했습니다. 누에(Bombyx mori, 접근 번호 NP_001038956.1), 집파리(Musca domestica, 접근 번호 XP_005182020.1, XP_005175332.1 및 XP_011294434.1) 및 미나리(Microplitis demolitor, 접근 번호 XP_008552646.1 및 XP_008552645.1)의 EcK, 누에(B. mori, 접근 번호 NP_001036900) 및 초파리(Drosophila melanogaster, 접근 번호 NP_651202)의 EcK. Apis mellifera(접근 번호 XP_394838) 및 Acyrthosiphon pisum(접근 번호 XP_001947166); 그리고 B. mori(접근 번호 XP_001947166)의 EPP, NP_001177919.1 및 NP_001243996.1) 및 D. melanogaster(접근 번호 NP_572986.1)의 EO를 사용했습니다(1단계). 다음으로, 감비아의 생식 조직(암컷 LRT 또는 MAG)에서 높은 mRNA 발현(백만 매핑된 읽기당 100개 이상의 단편/킬로베이스 엑손(FPKM) 또는 >85%)을 기준으로 결과를 필터링했습니다(2단계). 특이성을 향상시키기 위해, 우리는 짝짓기 동안 엑디손을 합성하거나 전달하지 않는 아노펠레스 종인 A. albimanus의 생식 조직에서도 발현되는 후보 효소를 선택했습니다. 후보 유전자는 A. albimanus 생식 조직에서 발현량이 낮은(<100 FPKM 또는 <85번째 백분위수) 유전자를 기준으로 필터링했습니다(3단계). 최종 필터링(4단계)으로, 후보 유전자는 다음 중 하나 이상을 만족해야 합니다. (1) 차등 발현 유전자 분석에 따라 짝짓기 후 유의하게 상향 조절됨(P < 0.05) 및 (2) 비생식 조직에서 발현량 < 85% 또는 <100 FPKM.
우리는 전체 유기체 동위원소 표지를 달성하기 위해 이전에 기술된 방법 28,29,30을 수정했습니다. 간단히 설명하면, 야생형 Saccharomyces cerevisiae type II(YSC2, Sigma)를 효모 질소 배지(BD Difco, DF0335)에서 테스트했습니다. 이 배지는 (wt/vol) 2% 포도당(G7528, Sigma), 1.7% 아미노산 무첨가 황산암모늄, 그리고 유일한 질소 공급원인 5% 15N 황산암모늄(NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories)을 함유하고 있습니다. 효모는 원심분리를 통해 회수했으며, 모기 유충은 번데기가 될 때까지 자유롭게 먹이를 공급받았습니다. 4령 유충의 사망률을 방지하기 위해 어분(유충 300마리당 0.5mg)을 첨가했습니다. 그런 다음 암컷만 사용하여 표지되지 않은 수컷과 교미 실험을 수행하여 교미 중에 전달된 수컷 단백질체를 분석했습니다.
4-6일 된 15N 표지된 처녀 암컷을 같은 연령의 표지되지 않은 처녀 수컷과 강제 교미시켰다. 교미 성공 여부는 형광 현미경으로 교미 흔적을 관찰하여 확인하였다. 교미 후 3, 12, 24시간에 45-55마리의 암컷의 심방을 50 µl의 중탄산암모늄 완충액(pH 7.8)에 넣고 막자사발로 균질화하였다. 균질액을 원심분리하고 상층액에 50 µl의 0.1% RapiGest(186001860, Waters)를 50 mM 중탄산암모늄에 용해시킨 용액을 첨가하였다. 각 시료의 상층액과 침전물을 드라이아이스에 넣어 급속 냉동시킨 후 워싱턴 대학교의 MacCoss 연구실로 익일 배송하여 LC-MS/MS 분석을 위한 시료 준비를 완료하였다. 침전물을 50 µl의 0.1% RapiGest(186001860, Waters)에 재현탁하였다. RapiGest를 50 mM 중탄산암모늄에 넣고 수조에서 초음파 처리했습니다. 침전물과 상층액의 단백질 농도는 BCA 분석법으로 측정했습니다. 샘플은 5 mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma)로 환원시키고, 15 mM 아이오도아세트아미드(Sigma)로 알킬화한 후, 트립신 처리(트립신:기질 비율 1:50)를 통해 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰습니다. RapiGest는 200 mM HCl을 첨가하여 용해시킨 후, 37 °C에서 45분 동안 반응시키고, 4 °C에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 잔여물을 제거했습니다. 샘플은 이중 모드 고체상 추출(Oasis MCX 카트리지, Waters)로 세척하고 0.1% 포름산에 재현탁하여 최종 단백질 농도를 0.33 µg/µl로 맞추었습니다. 유사한 방식으로 미처 생식하지 않은 수컷의 단백질체도 분석했습니다. 각 샘플에 대해 두 번의 분석 반복을 수행했습니다. 다음으로, 각 샘플 1 µg을 25 cm 길이의 융합 실리카 75 μm 컬럼과 4 cm 길이의 융합 실리카 Kasil1(PQ) 프릿 트랩(Phenomenex사의 Jupiter C12 역상 수지 충전)을 사용하여 180분 동안 액체 크로마토그래피로 분석했습니다. 시료 분석 – MS/MS는 nanoACQUITY UPLC 시스템(Waters)이 장착된 Q-Exactive HF 질량 분석기(Thermo Fisher)를 사용하여 수행되었습니다. 각 실행에서 생성된 데이터 관련 획득 데이터는 Proteowizard(버전 3.0.20287)를 사용하여 mzML 형식으로 변환되었고, Comet31(버전 3.2)을 사용하여 Anopheles gambiae(VectorBase 버전 54), Anopheles coluzzi A, Saccharomyces cerevisiae(Uniprot, 2021년 3월), A. gambiae RNA-seq 및 알려진 인체 오염 물질의 3프레임 번역을 포함하는 FASTA 데이터베이스를 대상으로 검색되었습니다. 펩타이드 맵 매칭 FDR은 Percolator32(버전 3.05)를 사용하여 0.01의 임계값으로 결정되었고, 펩타이드는 단백질 파시모니를 사용하여 단백질 식별로 조립되었습니다. Limelight33(버전 2.2.0)을 사용했습니다. 상대적 단백질 존재량은 이전에 설명한 대로 각 실행에서 각 단백질에 대해 계산된 정규화된 스펙트럼 존재량 계수(NSAF)를 사용하여 추정했습니다. 각 단백질에 대한 NSAF는 서로 다른 두 개의 생물학적 반복 샘플에서 평균화했습니다. 15N 표지는 암컷 프로테옴을 성공적으로 마스킹했지만, 표지된 처녀 암컷에서 소량의 표지되지 않은 단백질이 검출될 수 있었습니다. 암컷 원시 샘플에서 수컷 단백질 감소(1-5개 스펙트럼)는 HPLC "이월"로 인해 원시 샘플을 수컷/교미 샘플 후에 분석한 기술적 실행에서만 관찰되었습니다. 표지된 처녀 암컷에서 '오염물질'로 발견된 단백질은 보충표 1에 나열되어 있습니다.
Genscript사의 QTTDRVAPAPDQQQ (PA 동형) 및 MESDGTTPSGDSEQ (PA 및 PB 동형) 두 가지 항원 펩타이드를 조합한 후, 운반 단백질 KLH에 접합시켜 뉴질랜드 토끼에 주입했습니다. 토끼는 네 번째 주입 후 희생시켰고, 총 IgG는 친화성 정제법을 통해 분리했습니다. EPP 특이성이 가장 높은 토끼에서 얻은 IgG를 웨스턴 블롯 분석에 사용했습니다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 4일령의 미수정 수컷과 미수정 또는 강제 교미된 암컷(교미 후 10회 미만)에서 얻은 MAG(n = 10, 여기서 n은 생물학적으로 독립적인 모기 샘플 수를 나타냄) 및 암컷 LRT(n = 30) 샘플을 준비하였다. 단백질 추출 완충액(50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% 소듐 데옥시콜레이트; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× 프로테아제 억제제 칵테일(Roche))을 각각 첨가하였다. 샘플은 해부 직후 비더(2 mm 유리 비드, 2,400 rpm, 90초)를 사용하여 균질화하였다. 불용성 잔해는 4 °C에서 20,000 g로 원심분리하여 제거하였다. 단백질은 Bradford assay(Bio-Rad)로 정량하였다. 그런 다음, MAG 단백질 20 µg, LRT 단백질 40 µg, 그리고 잔류 단백질 20 µg을 변성시킨 후 MOPS 버퍼를 사용하여 10% Bis-Tris NuPAGE로 분리했습니다. iBlot2 전송 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 전사했습니다. 멤브레인을 1× PBS-T(PBS에 0.1% Tween-20 함유)로 두 번 세척한 후, Odyssey 차단 버퍼(Li-Cor)에서 22°C에서 1시간 동안 차단했습니다. 멤브레인을 맞춤형 토끼 항-EPP 다클론 1차 항체(차단 버퍼에서 1:700 희석)와 쥐 항-액틴 단클론 1차 항체 MAC237(Abeam; 1:4,000 희석)과 함께 4°C에서 밤새도록 진탕했습니다. 멤브레인을 PBS-T로 세척한 후, 차단 버퍼에 2차 항체(당나귀 항-토끼 800CW 및 염소 항-쥐 680LT(Li-Cor), 각각 1:20,000 희석)와 함께 반응시켰습니다. 0.01% SDS와 0.2% Tween-20 용액에 22°C에서 1시간 동안 반응시켰습니다. 멤브레인을 PBS-T로 세척한 후 Odyssey CLx 스캐너로 이미지를 촬영했습니다. 이미지는 Image Studio(버전 5.2)에서 수집 및 처리했습니다. EPP-RA 동형 단백질(82 kDa)에 해당하는 특정 밴드는 검출되지 않았습니다.
EPP(히스티딘 인산가수분해효소 도메인을 포함하는 동형 AGAP002463-RB, NCBI 보존 도메인 검색 34) 및 EcK2(AGAP002181)의 코딩 영역은 pET-21a(+) 플라스미드(Novagen Millipore Sigma)에 클로닝되었습니다. 프라이머는 확장 데이터 표 2에 나열되어 있습니다. 8개의 GS4 링커(직렬로)가 pET-21a(+)-EcK2 구축물의 C-말단 6xHis 태그 앞에 삽입되었습니다. 재조합 단백질은 NEBExpress 무세포 대장균 단백질 합성 반응(New England BioLabs)을 사용하여 생산되었습니다. 재조합 단백질은 NEBExpress Ni 스핀 컬럼(New England BioLabs)을 사용하여 정제되었습니다. 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 대조 단백질은 NEBExpress 무세포 대장균 단백질 합성 키트의 DNA 템플레이트를 사용하여 생산되었습니다. 단백질은 PBS에 50% 글리세롤을 첨가하여 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관했습니다.
EPP와 조직 추출물의 포스파타제 활성은 4-니트로페닐 포스페이트(pNPP; Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다. 반응 완충액은 25 mM Tris, 50 mM 아세트산, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 포함하였다. 조직을 반응 완충액에서 균질화하고 원심분리를 통해 세포 잔해를 제거하였다. 2.5 mg ml⁻¹의 pNPP를 포함하는 반응 완충액에 효소 또는 조직 추출물을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응 혼합물을 실온에서 암실에 보관하고, 다양한 시간 간격으로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 pNPP로부터 전환된 pNP의 양을 정량하였다.
시험관 내 EcK 활성 측정을 위해, 단백질을 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP 및 10 mM MgCl2를 함유하는 200 µl 완충액(pH 7.5)에서 0.2 mg의 20E 또는 3D20E와 함께 27 °C에서 2시간 동안 배양하였다. 반응은 800 µl의 메탄올을 첨가하여 중단시킨 후, -20 °C에서 1시간 동안 냉각하고, 4 °C에서 20,000 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 HPLC-MS/MS로 분석하였다. 대조군에 사용된 단백질의 열 불활성화를 위해, 단백질을 PBS에 50% 글리세롤을 첨가한 용액에서 95 °C에서 20분 동안 배양하였다.
시험관 내 EPP 활성 측정을 위해, 단백질을 25 mM Tris, 50 mM 아세트산, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 포함하는 100 µl 완충액(pH 7.5)에서 3D20E22P(HPLC-MS/MS로 정제된 18쌍의 MAG에서 발견된 양과 동일)와 함께 27 °C에서 3시간 동안 배양하였다. 반응은 400 µl의 메탄올을 첨가하여 중단시키고 -20 °C에서 1시간 동안 냉각한 후, 4 °C에서 20,000 g로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 HPLC-MS/MS로 분석하였다.
EPP(362 bp), EcK1(AGAP004574, 365 bp) 및 EcK2(556 bp)의 PCR 단편은 암수 혼합된 머리 없는 모기 사체에서 준비된 cDNA로부터 증폭되었습니다. eGFP 대조군(495 bp)의 PCR 단편은 이전에 설명된 pCR2.1-eGFP로부터 증폭되었습니다. PCR 프라이머는 확장 데이터 표 2에 나열되어 있습니다. PCR 산물은 pL4440 플라스미드의 역전된 T7 프로모터 사이에 삽입되었습니다. 플라스미드 구조물은 NEB 5-α 형질전환능을 갖춘 대장균(New England Biolabs)에서 회수되었으며 사용 전에 DNA 시퀀싱을 통해 확인되었습니다(삽입 서열은 보충 데이터 1 참조). T7 프로모터에 맞는 프라이머(확장 데이터 표 2)를 사용하여 pL4440 기반 플라스미드에서 삽입물을 증폭했습니다. PCR 산물의 크기는 아가로스 겔 전기영동으로 확인했습니다. dsRNA는 Megascript T7 Transcription Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 PCR 주형으로부터 전사되었고, 이전에 설명한 수정 사항을 적용하여 제조사의 지침에 따라 정제되었습니다.
dsRNA 주입의 경우, dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP 1,380 ng을 10 ng nl⁻¹ 농도로 성체 수컷 또는 암컷의 흉부에 주입하였다(Nanoject III, Drummond). 주입은 우화 후 1일 이내에 실시하였다. 유전자 발현 억제 수준은 RNA 추출, cDNA 합성 및 RT-qPCR을 통해 최소 3회 반복 실험에서 측정하였다. 엑디손 주입의 경우, 4일령 또는 6일령의 흡혈한 암컷에게 실험 설계에 따라 20E 또는 3D20E(Nanoject III, Drummond) 0.13, 0.21, 또는 0.63 µg을 각각 1.3, 2.1 ng nl⁻¹ 또는 6.3 ng nl⁻¹ 농도로 주입하였다. 10% 용액 100 nl를 주입하였다. (부피/부피) 에탄올 수용액; 10% 에탄올에 3D20E22P 100 nl (MAG 한 쌍에 들어 있는 양의 75%에 해당). 모기는 무작위로 주입 그룹에 배정되었습니다.
산란 실험을 위해 생후 3일 된 암컷 모기에게 사람 혈액을 자유롭게 공급했습니다. 혈액을 부분적으로 섭취했거나 섭취하지 않은 모기는 제거했습니다. 처리 조건에 따라 암컷 모기를 혈액 섭취 후 최소 48시간이 지난 후 4일 밤 동안 별도의 산란컵에 넣었습니다. 알은 입체현미경(Stemi 508, Zeiss)으로 계수했으며, 짝짓기를 한 암컷의 경우 유충으로 부화한 알을 수정된 알로 간주했습니다.
짝짓기 실험에서 암컷은 처리 조건에 따라 최소 2일 동안 짝짓기에 대한 저항성을 발달시키도록 하였고, 그 후 같은 연령의 야생형 수컷을 동일한 사육장에 넣었다. 이틀 밤 후, 암컷의 수정란을 해부하고 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl(pH 8.2)을 포함하는 완충액에서 동결-해동 및 초음파 처리를 통해 게놈 DNA를 추출했다. 샘플은 Proteinase K(0.86 µg µl-1)와 함께 55 °C에서 15분, 이어서 95 °C에서 10분 동안 배양했다. 조제된 게놈 DNA는 10배 희석하여 Y 염색체 서열의 qPCR 검출을 수행했다. 프라이머는 확장 데이터 표 2에 나열되어 있다. Y 염색체 서열이 검출되지 않으면 짝짓기가 일어나지 않은 것으로 간주한다.
재교배 분석을 위해 강제 교배된 암컷에서 교배 마개 존재 여부를 확인하여 교배 상태를 확인하고, 이전에 설명한 바와 같이 수컷이 없는 환경에서 2일 동안 교배 불응성을 나타내도록 했습니다.36 그런 다음 DsRed 형질전환 정자를 가진 수컷을 암컷 케이지에 넣었습니다. 이틀 밤 후, 암컷에서 수정낭을 분리하고 위에서 설명한 대로 게놈 DNA를 준비하여 DsRed 형질전환 유전자의 qPCR 검출을 수행했습니다. 프라이머는 확장 데이터 표 2에 나열되어 있습니다. DsRed 형질전환 유전자가 검출되지 않으면 재교배가 일어나지 않았음을 나타냅니다.
3D20E는 이전에 설명된 바와 같이 합성되었습니다.37 간단히 설명하면, 20E(Sigma-Aldrich) 10mg을 물 10ml에 용해시킨 후, 백금흑색(분말 형태, Sigma-Aldrich) 30mg을 첨가했습니다. 반응 혼합물에 산소를 지속적으로 주입하면서 실온에서 교반했습니다. 6시간 후, 메탄올 30ml를 첨가하여 반응을 중지시켰습니다. 촉매 입자를 제거하기 위해 혼합물을 원심분리했습니다. 상층액을 실온에서 진공 상태로 건조시켰습니다. 건조된 반응 생성물을 10% 에탄올과 메탄올에 용해시켜 HPLC-MS/MS 분석을 위해 주입했습니다. 전환율(20E에서 3D20E로)은 약 97%였으며(그림 4b), 합성된 3D20E의 MS 스펙트럼은 교미한 암컷에서 발견된 스펙트럼과 일치했습니다(그림 4c).
범례에는 수행된 통계 검정에 대한 구체적인 내용이 포함되어 있습니다. Fisher의 정확 검정, Mantel-Cox 검정 및 Student t-검정은 GraphPad(버전 9.0)를 사용하여 수행했습니다. Cochran-Mantel-Haenszel 검정은 사용자 정의 R 스크립트(https://github.com/duopeng/mantelhaen.test에서 사용 가능)를 사용하여 수행했습니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 유의 수준 0.05에서 검정했습니다. 정규성 검정을 통과하지 못한 경우 Mann-Whitney 검정을 수행했습니다. 생존 데이터는 Mantel-Cox 검정을 사용하여 분석했습니다. RNA-seq 유전자 수준의 차등 발현 분석은 DESeq2 패키지(버전 1.28.1)를 사용하여 수행했습니다. 그래프의 가로 막대는 중앙값을 나타냅니다. 모든 검정에서 유의 수준은 P = 0.05로 설정했습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 네이처 연구 보고서 초록을 참조하십시오.
MS 프로테오믹스 데이터는 PRIDE 파트너 저장소(https://www.ebi.ac.uk/pride/)를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄(http://proteomecentral.proteomexchange.org)에 데이터셋 식별자 PXD032157로 등록되었습니다.
RNA-seq 데이터 세트는 유전자 발현 종합 라이브러리(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에 GSE198665라는 일련 번호로 등록되어 있습니다.
본 연구에서 생성 및/또는 분석된 추가 데이터 세트는 합리적인 요청 시 해당 저자에게서 얻을 수 있습니다. 본 논문은 원본 데이터를 제공합니다.
De Loof, A. 엑디스테로이드: 무시된 곤충 성 스테로이드? 수컷: 블랙박스. 곤충과학. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone 및 Anopheles stephens의 난소 발달.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).