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반란젠 과립은 장내 미생물총을 조절하고 장내 단쇄지방산 유래 GLP-1 생성을 회복시켜 덱스트란 황산나트륨으로 유발된 만성 재발성 대장염을 완화합니다.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21베이징대학교 선전병원 약제부, 선전, 중국; 2선전대학교 보건과학센터 약학대학, 선전, 중국; 3교육부 산하 구이저우 의과대학교 민족의학 및 전통중의학 개발 및 응용 공학기술연구센터, 구이저우성 약학 핵심연구실, 구이저우 의과대학교, 구이양, 중국; 4베이징대학교 선전병원 소화기내과, 선전, 중국; 5구이저우 의과대학교 약학대학, 약용식물 기능 및 응용 국가 핵심연구실, 구이양; 6 베이징대학교 선전병원 임상병리과, 선전, 중국 [email protected] Shen Xiangchun, 구이저우 의과대학 약학대학, 구이저우, 중국, 550004, 이메일 [email protected] 목적: GLP-1 기반 치료는 염증성 장질환의 새로운 치료 옵션입니다. 반란근(BLG) 과립은 다양한 염증성 질환 치료에서 잠재적인 항염증 활성을 나타내는 것으로 알려진 항바이러스 한약 제제입니다. 그러나 대장염에 대한 항염증 효과와 작용 기전은 아직 불분명합니다. 방법: 덱스트란황산나트륨(DSS)으로 유도된 만성 재발성 대장염 마우스 모델을 구축했습니다. 질병 활성 지표, 조직학적 손상 지표 및 염증성 사이토카인 수치를 측정하여 BLG의 보호 효과를 평가했습니다. BLG가 장내 미생물총과 장 건강에 미치는 영향은 혈청 GLP-1 수치와 결장 Gcg 수치를 통해 분석했습니다. GPR41 및 GRP43 발현, 장내 미생물 구성, 대변 단쇄지방산(SCFA) 수치, 그리고 생쥐 대장 상피세포에서 분비되는 GLP-1의 SCFA 유래 생성량을 분석하였다. 결과: BLG 치료는 체중 감소, DAI(소화 지수), 대장 길이 단축, 대장 조직 손상, 그리고 대장 조직 내 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) 수치를 유의하게 감소시켰다. 또한, BLG 치료는 대장염 생쥐에서 대장 Gcg, GPR41 및 GRP43 발현과 혈청 GLP-1 수치를 유의하게 회복시켰으며, 이는 Akkermansia 및 Prevotellaceae_UCG-001과 같은 SCFA 생성 세균의 증식과 Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas 및 Oscillibacter와 같은 세균의 증식을 감소시킴으로써 이루어졌다. 더불어, BLG 치료는 대장염 생쥐의 대변 내 SCFA 수치를 유의하게 증가시켰다. 동시에, 시험관 내 실험에서도 BLG를 투여한 쥐의 대변 추출물이 쥐의 소장 상피세포에서 GLP-1 분비를 크게 자극하는 것으로 나타났습니다. 결론: 이러한 결과는 BLG가 항대장염 효과를 가지고 있음을 시사합니다. BLG는 장내 미생물총을 조절하고 장내 단쇄지방산(SCFA) 유래 GLP-1 생성을 회복시키는 기전을 통해 만성 재발성 대장염 치료제로 개발될 가능성이 있습니다. 키워드: 대장염, 반란젠 과립, 장내 미생물총, 단쇄지방산, GLP-1
궤양성 대장염(UC)은 대장과 직장의 만성 염증성 질환으로, 재발성 설사, 복통, 체중 감소, 점액농성 혈변을 특징으로 합니다.¹ 최근 서구식 생활 방식의 확산으로 중국을 비롯한 과거 발병률이 낮았던 국가에서도 UC 유병률이 증가하고 있습니다.² 이러한 증가는 공중 보건에 심각한 문제를 야기하며, 환자의 노동 능력과 삶의 질에 중대한 영향을 미칩니다. 특히, UC의 병태생리는 아직 명확히 밝혀지지 않았지만, 유전적 요인, 환경적 요인, 장내 미생물, 면역 체계가 모두 UC 발병에 기여하는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있습니다.³ 현재까지 UC를 완치할 수 있는 치료법은 없으며, 치료 목표는 임상 증상 조절, 관해 유도 및 유지, 점막 치유 촉진, 재발 감소에 있습니다. 기존 치료법으로는 아미노살리실산염, 코르티코스테로이드, 면역억제제, 생물학적 제제 등이 있지만, 이러한 약물들은 다양한 부작용으로 인해 원하는 효과를 얻지 못하는 경우가 있습니다.⁴ 최근 여러 사례 연구에서 전통 중국 의학(TCM)이 낮은 독성으로 궤양성 대장염(UC) 증상 완화에 큰 잠재력을 보인다는 사실이 밝혀졌으며, 이는 새로운 TCM 치료법 개발이 UC에 대한 유망한 치료 전략임을 시사합니다.5-7
반랑겐 과립(BLG)은 반랑겐 뿌리의 수용성 추출물로 만든 전통 중국 의약품 제제입니다.8 BLG는 항바이러스 효능 외에도 다양한 염증성 질환 치료에 잠재적인 항염증 활성을 나타냅니다.9,10 또한, 반랑겐 뿌리의 수용성 추출물에서 글루코시놀레이트(R,S-고이트린, 프로고이트린, 에피프로루빈 및 글루코사이드)와 뉴클레오사이드(하이포크산틴, 아데노신, 유리딘 및 구아노신) 및 인디고 알칼로이드(인디고 및 인디루빈)가 분리 및 확인되었습니다.11,12 이전 연구에서는 아데노신, 유리딘 및 인디루빈 화합물이 다양한 동물 모델에서 강력한 항대장염 효과를 나타낸다는 사실이 잘 입증되었습니다.13-17 그러나 BLG의 대장염에 대한 효능을 평가하기 위한 근거 기반 연구는 아직 수행되지 않았습니다. 본 연구에서는 BLG의 대장염에 대한 보호 효과를 조사했습니다. C57BL/6 마우스에서 덱스트란 황산나트륨(DSS)으로 유발된 만성 재발성 대장염을 연구한 결과, BLG의 경구 투여가 DSS로 유발된 만성 재발성 대장염을 유의하게 완화시키는 것으로 나타났습니다. 염증 및 그 조절 메커니즘은 장내 미생물총의 조절과 장 유래 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 생성의 회복과 관련이 있습니다.
BLG 과립(무설탕, NMPA 승인 Z11020357; 베이징 통런탕 기술 개발 유한회사, 베이징, 중국; 배치 번호: 20110966)은 약국에서 구입했습니다. DSS(분자량: 36,000–50,000 달톤)는 MP Biologicals(산타 애나, 미국)에서 구입했습니다. 설파살라진(SASP)(순도 ≥ 98%), 헤마톡실린 및 에오신은 Sigma-Aldrich(세인트루이스, 미주리, 미국)에서 구입했습니다. 마우스 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 루미넥스 ELISA 분석 키트는 R&D Systems(미니애폴리스, 미네소타, 미국)에서 구입했습니다. 아세트산, 프로피온산 및 부티르산은 Aladdin Industries(상하이, 중국)에서 구입했습니다. 2-에틸부티르산은 Merck KGaA에서 구입했습니다. (독일 다름슈타트)
생후 6-8주 된 수컷 C57BL/6 마우스(체중 18-22g)를 베이징 웨타허 실험동물기술유한공사(중국 베이징)에서 구입하여 22±2°C의 온도와 12시간 명/암 주기 환경에서 사육했습니다. 마우스는 새로운 환경에 적응시키기 위해 1주일 동안 표준 설치류 사료와 음용수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 했습니다. 그 후 마우스를 무작위로 네 그룹으로 나누었습니다: 대조군, DSS 모델군, SASP 투여군(200mg/kg, 경구 투여), BLG 투여군(1g/kg, 경구 투여). 그림 1A에 나타낸 바와 같이, 이전 연구에 따라 1.8% DSS를 5일 동안 투여한 후 증류수를 7일 동안 투여하는 과정을 3회 반복하여 마우스에 만성 재발성 대장염을 유발했습니다.18 SASP 투여군과 BLG 투여군은 각각 SASP와 BLG를 1일차부터 매일 투여했습니다. 0.예비 실험에 따르면 BLG의 투여량은 1g/kg으로 설정되었습니다. 한편, SASP의 투여량은 문헌4에 따라 200mg/kg으로 설정되었습니다. 대조군과 DSS 모델군은 실험 전 과정에 걸쳐 동일한 양의 물을 섭취했습니다.
그림 1. BLG는 DSS 유발 만성 재발성 대장염 마우스 모델을 개선합니다. (A) 만성 재발성 대장염 모델 설계 및 치료, (B) 체중 변화, (C) 질병 활성도 지수(DAI) 점수, (D) 결장 길이, (E) 결장 대표 이미지, (F) H&E 염색 결장(배율 ×100), (G) 조직학적 점수. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 6)로 제시되었습니다. ##p < 0.01 또는 ###p < 0.001 대조군(Con) 대비; *p < 0.05 또는 **p < 0.01 또는 ***p < 0.001 DSS군 대비.
체중, 변의 굳기, 직장 출혈은 매일 기록하였다. 질병 활동 지수(DAI)는 이전에 설명한 바와 같이 체중, 변의 굳기, 직장 출혈 점수를 종합하여 결정하였다.19 실험 종료 후 모든 쥐를 안락사시키고 혈액, 대변, 결장을 채취하여 추가 실험에 사용하였다.
결장 조직을 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하였다. 5마이크론 두께의 절편을 제작하여 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색한 후, 이전에 설명한 바와 같이 맹검법으로 점수를 매겼다.19
결장 조직의 총 RNA는 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 추출한 후, 역전사효소(TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan)를 이용하여 cDNA를 추출했습니다. 정량적 PCR은 SYBR Green Master(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하는 실시간 PCR 시스템으로 수행했습니다. 표적 유전자 전사체는 β-actin으로 정규화하고, 데이터는 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 분석했습니다. 유전자 프라이머 서열은 표 1에 제시되어 있습니다.
생쥐 결장 상피세포의 분리 및 배양은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었습니다.20 간단히 설명하면, 6-8주령 생쥐를 경추 탈골로 희생시킨 후 결장을 적출하고, 세로로 절개한 다음, Hanks Balanced Salt Solution(HBSS, 칼슘 및 마그네슘 불포함)으로 처리하고 0.5-1 mm 크기로 잘랐습니다. 이어서, 조직을 DMEM 배지에서 0.4 mg/mL 콜라게나제 XI(Sigma, Poole, UK)로 소화시키고 실온에서 300 xg로 5분간 원심분리했습니다. 침전물을 DMEM 배지(10% 태아 소 혈청, 100 Units/mL 페니실린, 100 µg/mL 스트렙토마이신 첨가)에 37 °C에서 재현탁시키고 나일론 메쉬(기공 크기 ~250 µm)를 통과시켰습니다. 결장 상피세포의 일부를 유리 바닥 접시에 넣고 배양했습니다. 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 쥐 배설물 추출물을 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 반응시켰다.
결장 조직을 PBS로 균질화한 후, 루미넥스 ELISA 분석 키트(R&D 시스템, 미니애폴리스, 미네소타, 미국)를 사용하여 결장 조직 내 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β 수치를 측정하였다. 마찬가지로, 생쥐 결장 상피세포의 혈청 및 배양액 내 GLP-1 수치는 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트(바이오스왐프, 우한, 중국)를 사용하여 측정하였다.
대변에서 DNA 추출 키트(Tiangen, 중국)를 사용하여 총 DNA를 추출했습니다. DNA의 질과 양은 각각 260 nm/280 nm 및 260 nm/230 nm 비율로 측정했습니다. 추출된 각 DNA를 주형으로 사용하여 특이적 프라이머 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)와 806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)을 이용하여 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 서로 다른 위치에서 증폭했습니다. PCR 산물은 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN, 독일)를 사용하여 정제하고, 실시간 PCR로 정량한 후, Illumina Miseq PE300 시퀀싱 플랫폼(Illumina Inc., CA, USA)을 사용하여 시퀀싱했습니다. 생물정보학 분석을 위해 데이터 처리는 이전에 보고된 프로토콜21,22에 따라 수행했습니다. 간단히 말하면, Cutadapt(V1.9.1)를 사용하여 원시 express 파일을 필터링했습니다. OTU는 다음과 같습니다. UPARSE(버전 7.0.1001)를 사용하여 97%의 유사도 임계값으로 클러스터링을 수행했으며, UCHIME를 사용하여 키메라 서열을 제거했습니다. 군집 구성 분석 및 분류는 SILVA 리보솜 RNA 유전자 데이터베이스를 기반으로 RDP 분류기(http://rdp.cme.msu.edu/)를 사용하여 수행했습니다.
단쇄지방산(아세트산, 프로피온산, 부티르산) 수치는 Tao et al.이 이전에 설명한 방법을 일부 수정하여 측정했습니다.23 간단히 설명하면, 먼저 대변 100mg을 탈이온수 0.4mL에 현탁시킨 후 50% 황산 0.1mL와 2-에틸부티르산(내부 표준물질) 0.5mL를 첨가하고 균질화한 다음 4°C에서 가열했습니다. 원심분리기를 사용하여 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 에테르 0.5 mL로 추출하여 GC에 주입하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피(GC) 분석은 불꽃 이온화 검출기(FID)가 장착된 GC-2010 Plus 가스 크로마토그래프(Shimadzu, Inc.)를 사용하여 수행하였다. 분리는 ZKAT-624 컬럼(30 m × 0.53 mm × 0.3 μm, Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., 중국)을 사용하여 수행하였다. 데이터는 GC solution 소프트웨어(Shimadzu, Inc.)를 사용하여 수집하였다. 분할 비율은 10:1이었고, 운반 기체는 질소였으며, 유속은 6 mL/min이었다. 주입량은 1 μL였다. 주입구와 검출기 온도는 300°C였다. 오븐 온도는 140°C에서 13.5분 동안 유지한 후 상승시켰다. 250°C까지 분당 120°C의 속도로 가열한 후, 해당 온도를 5분간 유지했습니다.
데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시되었습니다. 데이터의 유의성은 일원분산분석(ANOVA) 후 던컨 다중범위 검정을 통해 평가했습니다. 모든 계산에는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용했으며, p < 0.05인 경우 통계적으로 유의미하다고 판단했습니다.
궤양성 대장염(UC)은 심한 복통, 설사, 출혈을 동반하는 만성 재발성 대장염 질환으로 잘 알려져 있습니다. 따라서, BLG의 항대장염 효능을 평가하기 위해 DSS 유도 만성 재발성 대장염 마우스 모델을 구축했습니다(그림 1A). 대조군과 비교했을 때, DSS 모델 그룹의 마우스는 체중이 현저히 감소하고 DAI(일과성 대장염 지수)가 증가했으며, 이러한 변화는 24일간의 BLG 치료 후 유의하게 회복되었습니다(그림 1B 및 C). 대장 길이 단축은 UC의 중요한 특징입니다. 그림 1D 및 E에서 볼 수 있듯이, DSS를 투여받은 마우스의 대장 길이는 유의하게 단축되었지만, BLG 치료 후 회복되었습니다. 이어서, 대장 염증을 평가하기 위해 조직병리학적 분석을 수행했습니다. H&E 염색 이미지와 병리학적 점수는 DSS 투여가 대장 구조를 현저히 파괴하고 장선 파괴를 유발하는 반면, BLG 치료는 장선 파괴와 병리학적 점수를 유의하게 감소시켰음을 보여줍니다(그림 1F 및 G). 특히, BLG의 보호 효과는 다음과 같습니다. 1g/kg 용량은 200mg/kg 용량의 SASP와 유사한 효과를 보였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, BLG는 DSS 유발 만성 재발성 대장염의 심각도를 줄이는 데 효과적이라는 것을 알 수 있다.
TNF-α, IL-1β 및 IL-6는 대장 염증의 중요한 염증 표지자입니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, DSS는 대조군에 비해 대장에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현을 유의하게 증가시켰습니다. BLG 투여는 이러한 DSS 매개 변화를 유의하게 역전시킬 수 있습니다. 다음으로, ELISA를 사용하여 대장 조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 수준을 측정했습니다. 결과 또한 DSS를 처리한 쥐에서 대장 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 수준이 유의하게 증가했음을 보여주었으며, BLG 치료는 이러한 증가를 완화시켰습니다(그림 2B).
그림 2. BLG는 DSS 처리 마우스의 결장에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현과 생성을 억제한다. (A) 결장의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자 발현; (B) 결장의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 단백질 수준. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 4–6)로 제시되었다. #p < 0.05 또는 ##p < 0.01 또는 ###p < 0.001은 대조군(Con) 대비 유의미한 차이이며, *p < 0.05 또는 **p < 0.01은 DSS 투여군 대비 유의미한 차이이다.
장내 미생물 불균형은 궤양성 대장염(UC) 발병기전에 중요한 역할을 합니다.24 BLG가 DSS 유발 마우스의 장내 미생물총을 조절하는지 알아보기 위해 16S rRNA 시퀀싱을 통해 장 내용물의 세균 군집을 분석했습니다. 벤 다이어그램에서 세 그룹은 385개의 OTU를 공유하는 것으로 나타났습니다. 동시에 각 그룹은 고유한 OTU를 가지고 있었습니다(그림 3A). 또한, 그림 3B와 3C에 나타낸 Chao1 지수와 Shannon 지수는 BLG 처리 마우스에서 장내 미생물총의 다양성이 감소했음을 보여주며, 특히 Shannon 지수가 BLG 처리 그룹에서 유의하게 감소했습니다. 주성분 분석(PCA)과 주좌표 분석(PCoA)을 통해 세 그룹 간의 군집 패턴을 분석한 결과, BLG 처리 후 DSS 유발 마우스의 군집 구조가 명확하게 분리되는 것을 확인할 수 있었습니다(그림 3D 및 3E). 이러한 결과는 BLG 처리가 DSS 유발 대장염 마우스의 군집 구조에 유의한 영향을 미친다는 것을 시사합니다.
그림 3. BLG는 DSS 유도 대장염이 있는 마우스에서 장내 미생물 다양성을 변화시킨다. (A) OTU 벤 다이어그램, (B) Chao1 지수, (C) Shannon 풍부도 지수, (D) OTU 주성분 분석(PCA) 점수 플롯, (E) OTU 주좌표 분석(PCoA) 점수. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 6)로 제시되었다. **p < 0.01 (DSS 그룹 대비).
분변 미생물총의 특정 변화를 평가하기 위해 모든 분류학적 수준에서 장내 미생물총의 구성을 분석했습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이 모든 그룹에서 주요 문은 Firmicutes와 Bacteroidetes였으며, 그 다음으로 Verrucomicrobia가 많았습니다. DSS 처리 마우스의 분변 미생물 군집에서 Firmicutes의 상대적 풍부도와 Firmicutes/Bacteroidetes 비율은 대조군 마우스에 비해 유의하게 증가했으며, 이러한 변화는 BLG 처리 후 유의하게 역전되었습니다. 특히, BLG 처리는 DSS 유발 대장염 마우스의 분변에서 Verrucobacterium의 상대적 풍부도를 유의하게 증가시켰습니다. 가구 수준에서 분변 미생물 군집은 Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae 및 Prevotellaceae로 구성되어 있었습니다(그림 4B). DSS 그룹과 비교했을 때, BLG 결핍은 Akkermansiaceae의 풍부도를 증가시켰지만, 다른 종의 풍부도는 감소시켰습니다. Lachnospiraceae 및 Ruminococcaceae. 특히 속 수준에서 분변 미생물군은 Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia 및 Prevotellaceae_UCG-001로 구성되어 있었습니다(그림 4C). 이 결과는 BLG 치료가 DSS 자극에 대한 반응으로 나타난 미생물 불균형을 효과적으로 역전시켰음을 보여줍니다. 이러한 불균형은 Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas 및 Oscillibacter의 감소와 Akkermansia 및 Prevotellaceae_UCG-001의 증가로 특징지어집니다.
그림 4. BLG는 DSS 유도 대장염 마우스에서 장내 미생물 군집의 풍부도를 변화시킨다. (A) 문(phylum) 수준에서의 장내 미생물 군집 풍부도; (B) 과(family) 수준에서의 장내 미생물 군집 풍부도; (C) 속(genus) 수준에서의 장내 미생물 군집 풍부도. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 6)로 제시되었다. #p < 0.05 또는 ###p < 0.001 대조군(Con) 대비; *p < 0.05 또는 **p < 0.01 또는 ***p < 0.001 DSS 투여군 대비.
단쇄지방산(SCFA)이 Akkermansia 및 Prevotellaceae_UCG-001의 주요 대사산물이고 아세트산, 프로피온산 및 부티르산이 장관 내강에서 가장 풍부한 SCFA라는 점을 고려할 때, 25-27 본 연구는 여전히 진행 중입니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이, DSS 처리군에서 대변 내 아세트산, 프로피온산 및 부티르산 농도가 유의하게 감소한 반면, BLG 처리는 이러한 감소를 크게 억제할 수 있었습니다.
그림 5. BLG는 DSS 유발 대장염이 있는 마우스의 대변에서 단쇄지방산(SCFA) 수치를 증가시킨다. (A) 대변의 아세트산 함량; (B) 대변의 프로피온산 함량; (C) 대변의 부티르산 함량. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 6)로 제시되었다. #p < 0.05 또는 ##p < 0.01 대조군(Con) 대비; *p < 0.05 또는 **p < 0.01 DSS군 대비.
또한, 속 수준의 차등 단쇄지방산(SCFA)과 분변 미생물군 간의 피어슨 상관계수를 계산했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이, 아케르만시아(Akkermansia)는 프로피온산(피어슨 상관계수 = 0.4866) 및 부티르산(피어슨 상관계수 = 0.6192) 생성과 양의 상관관계를 보였습니다. 반면, 엔테로모나스(Enteromonas)와 오실로박터(Oscillobacter)는 아세트산 생성과 음의 상관관계를 나타냈으며, 피어슨 상관계수는 각각 0.4709와 0.5104였습니다. 마찬가지로, 루미노코카세아과(Ruminococcaceae_UCG-014)는 프로피온산(피어슨 상관계수 = 0.4508) 및 부티르산(피어슨 상관계수 = 0.5842) 생성과 각각 음의 상관관계를 보였습니다.
그림 6. 차등 단쇄지방산(SCFA)과 대장 미생물 간의 피어슨 상관 분석. (A) 아세트산과 함께 존재하는 엔테로모나스; (B) 아세트산과 함께 존재하는 뇌척수염균; (C) 프로피온산과 함께 존재하는 아케르만시아; (D) 프로피온산과 함께 존재하는 루미노코쿠스_UCG-014; (E) 부티르산과 함께 존재하는 아케르만시아; (F) 부티르산과 함께 존재하는 루미노코쿠스_UCG-014.
글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)은 항염증 특성을 지닌 프로글루카곤(Gcg)의 세포 유형 특이적 번역 후 변형 산물입니다.28 그림 7에서 볼 수 있듯이, DSS는 Gcg mRNA 발현을 유의하게 감소시켰습니다. 대장 및 BLG 치료는 대조군과 비교하여 DSS로 유도된 Gcg 감소를 유의하게 역전시킬 수 있었습니다(그림 7A). 동시에, DSS 처리군에서 혈청 GLP-1 수치가 유의하게 감소했으며, BLG 치료는 이러한 감소를 상당 부분 예방할 수 있었습니다(그림 7B). 단쇄 지방산은 G-단백질 결합 수용체 43(GRP43) 및 G-단백질 결합 수용체 41(GRP41) 활성화를 통해 GLP-1 분비를 자극할 수 있으므로, 우리는 또한 대장염 마우스의 대장에서 GRP41 및 GRP43을 조사했습니다. 그 결과, DSS 투여 후 대장의 GRP43 및 GPR41 mRNA 발현이 유의하게 감소했으며, BLG 치료는 이를 회복시킬 수 있음을 확인했습니다. 이러한 감소를 효과적으로 구제합니다(그림 7C 및 D).
그림 7. BLG는 DSS 처리 마우스에서 혈청 GLP-1 수치와 결장 Gcg, GPR41 및 GRP43 mRNA 발현을 증가시킨다. (A) 결장 조직의 Gcg mRNA 발현; (B) 혈청 GLP-1 수치; (C) 결장 조직의 GPR41 mRNA 발현; (D) 결장 조직의 GPR43 mRNA 발현. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 5–6)로 제시되었다. #p < 0.05 또는 ##p < 0.01 대조군(Con) 대비; *p < 0.05 DSS군 대비.
BLG 처리가 DSS 처리 마우스에서 혈청 GLP-1 수치, 결장 Gcg mRNA 발현 및 대변 SCFA 수치를 증가시킬 수 있으므로, 대조군(F-Con), DSS 유발 대장염(F-Con-DSS) 및 BLG 처리 대장염(F-BLG) 마우스에서 아세트산, 프로피온산 및 부티르산뿐만 아니라 마우스 결장 상피세포에서 분비되는 GLP-1의 영향을 추가로 조사했습니다. 그림 8A에서 볼 수 있듯이, 2mM의 아세트산, 프로피온산 및 부티르산을 각각 처리한 마우스 결장 상피세포는 GLP-1 분비를 유의하게 촉진했으며, 이는 이전 연구 결과와 일치합니다.29,30 마찬가지로, F-Con, F-DSS 및 F-BLG(대변 0.25g에 해당) 모두 마우스 결장 상피세포에서 GLP-1 분비를 크게 촉진했습니다. 특히, F-DSS로 처리한 마우스 결장 상피세포에서 분비되는 GLP-1의 양은 유의하게 증가했습니다. 상피세포의 GLP-1 생성량은 F-Con 및 F-BLG로 처리한 생쥐 결장 상피세포보다 훨씬 낮았습니다(그림 8B). 이러한 데이터는 BLG 처리가 장내 SCFA 유래 GLP-1 생성을 유의미하게 회복시켰음을 시사합니다.
그림 8. BLG 유래 SCFA는 생쥐 결장 상피세포에서 GLP-1 분비를 자극한다. (A) 아세트산, 프로피온산, 부티르산은 생쥐 결장 상피세포에서 GLP-1 분비를 자극했다. (B) 대변 추출물 F-Con, F-DSS, F-BLG는 생쥐 결장 상피세포에서 GLP-1 분비를 자극했다. 결장 상피세포를 유리 바닥 페트리 접시에 넣고 각각 2 mM의 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 그리고 대변 추출물 F-Con, F-DSS, F-BLG(대변 0.25 g에 해당)로 처리했다. 각각 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 생쥐 결장 상피세포에서 분비된 GLP-1의 양은 ELISA로 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준오차(n = 3)로 제시하였다. #p < 0.05 또는 ##p < 0.01은 대조군 또는 F-Con과 비교한 결과이고, *p < 0.05는 F-DSS와 비교한 결과이다.
약어: Ace, 아세트산; Pro, 프로피온산; however, 부티르산; F-Con, 대조군 쥐의 분변 추출물; F-DSS, 대장염 쥐의 분변 추출물; F-BLG, BLG 처리 대장에서 추출한 염증 쥐의 분변 추출물.
세계보건기구(WHO)에서 난치성 질환으로 분류된 궤양성 대장염은 전 세계적인 위험 요소로 떠오르고 있습니다. 그러나 궤양성 대장염(UC)의 예측, 예방 및 치료에 효과적인 방법은 여전히 ​​제한적입니다. 따라서 UC에 대한 새롭고 안전하며 효과적인 치료 전략을 탐색하고 개발해야 할 필요성이 시급합니다. 전통 중국 의약품은 많은 제제가 수세기 동안 중국인 인구에서 UC 치료에 효과적인 것으로 입증되었으며, 대부분 인체와 동물에 무해한 생물학적 유기물 및 천연 물질이기 때문에 유망한 선택지입니다.31,32 본 연구는 UC 치료에 안전하고 효과적인 전통 중국 의약품을 찾고 그 작용 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. BLG는 독감 치료에 사용되는 잘 알려진 중국 한약 처방입니다.8,33 본 연구실 및 다른 연구실의 연구 결과에 따르면 BLG와 동일한 원료로 가공된 전통 중국 의약품인 인디고는 사람과 동물에서 UC 치료에 상당한 효능을 나타냅니다.4,34 그러나 BLG의 항대장염 효과와 그 작용 메커니즘은 불분명합니다. 본 연구에서 우리는 BLG가 DSS 유발 대장염을 효과적으로 완화한다는 것을 입증했습니다. 염증은 장내 미생물총의 조절 및 장에서 생성되는 GLP-1의 회복과 관련이 있습니다.
궤양성 대장염(UC)은 체중 감소, 설사, 직장 출혈, 광범위한 대장 점막 손상과 같은 전형적인 임상 증상을 동반하는 재발성 질환으로 잘 알려져 있습니다.35 따라서, 1.8% DSS를 5일 동안 3회 투여하고 7일 동안 물을 공급하는 방식으로 만성 재발성 대장염을 유발했습니다. 그림 1B에서 볼 수 있듯이, 체중 감소와 DAI 점수의 변동은 만성 재발성 대장염이 성공적으로 유도되었음을 나타냅니다. BLG를 투여한 그룹의 쥐들은 8일째부터 회복이 시작되었으며, 이는 24일째와 유의미한 차이를 보였습니다. DAI 점수에서도 동일한 변화가 관찰되어 대장염의 임상적 개선을 시사합니다. 대장 손상 및 염증 상태 측면에서, 대장 길이, 대장 조직 손상, 그리고 대장 조직 내 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 유전자 발현 및 생성 또한 BLG 치료 후 크게 개선되었습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 BLG가 만성 재발성 대장염 치료에 효과적임을 분명히 보여줍니다. 쥐에서 재발성 대장염.
BLG는 어떻게 약리학적 효과를 발휘하는가? 수많은 선행 연구에서 장내 미생물이 궤양성 대장염(UC)의 병인에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌으며, 미생물 기반 및 미생물 표적 치료법이 UC 치료를 위한 매우 매력적인 전략으로 부상했습니다. 본 연구에서는 BLG 치료가 장내 미생물 구성에 유의미한 변화를 일으켰음을 입증했으며, 이는 DSS 유도 대장염에 대한 BLG의 보호 효과가 장내 미생물 조절과 관련이 있음을 시사합니다. 이러한 관찰 결과는 장내 미생물 항상성 재조정이 한약 제제의 효능을 이해하는 중요한 접근법이라는 개념과 일치합니다.36,37 특히, 아케르만시아(Akkermansia)는 장 점막층에 서식하는 그람 음성 혐기성 세균으로, 뮤신을 분해하고 프로피온산을 생성하며, 술잔세포 분화를 자극하고 점막을 유지하는 역할을 합니다. 장벽 무결성의 기능.26 다수의 임상 및 동물 데이터는 Akkermansia가 건강한 점막과 매우 밀접하게 관련되어 있음을 시사하며,38 Akkermansia spp.의 경구 투여는 점막 염증을 현저하게 개선할 수 있습니다.39 현재 데이터에 따르면 BLG 처리 후 Akkermansia의 상대적 풍부도가 유의하게 증가했습니다. 또한 Prevotellaceae_UCG-001은 SCFA를 생성하는 박테리아입니다.27 여러 연구에서 Prevotellaceae_UCG-001이 대장염이 있는 동물의 대변에서 낮은 상대적 풍부도로 발견되었다는 것을 보여주었습니다.40,41 현재 데이터 또한 BLG 처리가 DSS 처리 마우스의 대장에서 Prevotellaceae_UCG-001의 상대적 풍부도를 유의하게 증가시킬 수 있음을 보여줍니다. 반면 Oscillibacter는 중온성, 절대 혐기성 박테리아입니다.42 Oscillibacter의 상대적 풍부도가 UC 마우스에서 유의하게 증가했으며 IL-6 및 IL-1β 수치 및 병리학적 점수와 유의한 양의 상관관계를 보였다고 보고되었습니다.43,44 특히, BLG 처리는 DSS 처리 마우스의 대변에서 Oscillibacter의 상대적 풍부도를 유의하게 감소시켰습니다. 주목할 만한 점은 이러한 BLG에 의해 변화된 박테리아입니다. SCFA를 가장 많이 생성하는 박테리아는 였습니다. 수많은 이전 연구에서 SCFA가 대장 염증에 대한 잠재적인 유익 효과와 장 상피 무결성 보호 효과를 나타낸다는 것이 입증되었습니다.45,46 본 연구 데이터에서도 DSS 처리된 대변에서 SCFA인 아세트산, 프로피온산, 부티르산의 농도가 BLG 처리된 마우스에서 크게 증가한 것을 관찰했습니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, BLG 처리는 만성 재발성 대장염이 있는 마우스에서 DSS 유도 SCFA 생성 박테리아를 효과적으로 증강시킬 수 있음을 분명히 보여줍니다.
GLP-1은 주로 회장과 결장에서 생성되는 인크레틴으로, 위 배출 지연 및 식후 혈당 저하에 중요한 역할을 합니다.47 디펩티딜 펩티다제(DPP)-4, GLP-1 수용체 작용제, 그리고 GLP-1 나노의약품이 생쥐의 장 염증을 효과적으로 완화할 수 있다는 증거가 있습니다.48-51 이전 연구에서 보고된 바와 같이, 높은 단쇄지방산(SCFA) 농도는 사람과 생쥐 모두에서 혈장 GLP-1 수치와 관련이 있습니다.52 본 연구 결과는 BLG 처리 후 혈청 GLP-1 수치와 Gcg mRNA 발현이 유의하게 증가했음을 보여줍니다. 마찬가지로, BLG로 처리한 대장염 생쥐의 분변 추출물로 자극했을 때의 대장 배양액에서 GLP-1 분비가 DSS로 처리한 대장염 생쥐의 분변 추출물로 자극했을 때보다 유의하게 증가했습니다. SCFA는 GLP-1 분비에 어떻게 영향을 미칠까요? Gwen Tolhurst 외. SCFA가 GRP43 및 GPR41을 통해 GLP-1 분비를 자극할 수 있다는 보고가 있습니다.29 본 연구 결과 또한 BLG 처리가 DSS 처리 마우스의 결장에서 GRP43 및 GPR41의 mRNA 발현을 유의하게 증가시키는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 BLG 처리가 GRP43 및 GPR41 활성화를 통해 SCFA에 의해 촉진된 GLP-1 생성을 회복시킬 수 있음을 시사합니다.
BLG는 중국에서 장기간 일반의약품으로 판매되고 있습니다. 쿤밍 마우스에서 BLG의 최대 내약 용량은 80g/kg이며, 급성 독성은 관찰되지 않았습니다.53 현재 사람에게 권장되는 BLG(무설탕) 복용량은 9-15g/일(1일 3회)입니다. 본 연구에서는 BLG 1g/kg이 DSS 유발 만성 재발성 대장염을 개선하는 것을 확인했습니다. 이 용량은 임상적으로 사용되는 BLG 복용량과 유사합니다. 또한, 본 연구는 BLG의 작용 기전이 적어도 부분적으로는 장내 미생물총, 특히 Akkermansia 및 Prevotellaceae_UCG-001과 같은 단쇄지방산(SCFA) 생성 세균의 변화를 통해 장내 GLP-1 생성을 회복시키는 데 관여함을 밝혀냈습니다. 이러한 결과는 BLG가 임상 대장염 치료를 위한 잠재적인 치료제로 추가 연구될 가치가 있음을 시사합니다. 그러나 BLG가 장내 미생물총을 조절하는 정확한 기전은 미생물 결핍 마우스 모델 및 분변 세균 이식 연구를 통해 추가적으로 규명되어야 합니다.
Ace, 아세트산; but, 부티르산; BLG, 판단; DSS, 덱스트란 황산나트륨; DAI, 질병 활성 지수; DPP, 디펩티딜 펩티다제; FID, 불꽃 이온화 검출기; F-Con, 대조군 마우스 분변 추출물; F-DSS, DSS 유발 대장염 마우스 분변 추출물; F-BLG, BLG 처리 대장염 마우스 분변 추출물; GLP-1, 글루카곤 유사 펩타이드-1; Gcg, 글루카곤; gas chromatography, 가스 크로마토그래피; GRP43, G 단백질 결합 수용체 43; GRP41, G 단백질 결합 수용체 41; H&E, 헤마톡실린-에오신 염색; HBSS, 행크스 평형 염 용액; OTC, OTC; PCA, 주성분 분석; PCoA, 주좌표 분석; Pro, 프로피온산; SASP, 설파살라진; SCFA, 단쇄 지방산; 중의학, 전통 중국 의학; UC, 궤양성 대장염.
모든 실험 프로토콜은 기관 지침 및 동물 규정에 따라 베이징대학교 선전-홍콩과학기술대학교 의학센터 동물윤리위원회(중국 선전)의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호 A2020157).
모든 저자는 연구의 개념 및 설계, 데이터 수집, 데이터 분석 및 해석에 상당한 기여를 했으며, 논문 초안 작성 또는 중요한 지적 내용에 대한 비판적 검토에 참여했고, 해당 저널에 원고를 제출하는 데 동의했으며, 최종 출판 버전을 승인했습니다. 또한, 연구의 모든 측면에 대한 책임을 졌습니다.
본 연구는 중국 국가자연과학기금(81560676 및 81660479), 선전대학교 일류 연구사업(86000000210), 선전시 과학기술혁신위원회 기금(JCYJ20210324093810026), 광둥성 의학과학기술연구기금(A2020157 및 A2020272), 구이저우 의과대학 약학과 구이저우성 핵심연구실 기금(YWZJ2020-01), 그리고 베이징대학교 선전병원(JCYJ2018009)의 지원을 받아 수행되었습니다.
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