분비 경로에서의 단백질 분류는 세포 구획화 및 항상성 유지에 필수적입니다. 세포막 매개 분류 외에도, 분비 수송 과정에서 키네신 분류에 있어 지질의 역할은 오랫동안 해결되지 않은 기초적인 문제였습니다. 본 연구에서는 3D 동시 다색 고해상도 실시간 이미징을 통해 새로 합성된 글리코실포스파티딜이노시톨 고정 단백질(매우 긴 세라마이드 지질 부분을 가짐)이 세포막 단백질이 사용하는 부위와는 다른 특수한 소포체 출구 부위로 군집화되고 분류됨을 생체 내에서 입증했습니다. 또한, 소포체 막에 있는 세라마이드 사슬 길이가 이러한 분류 선택성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 본 연구는 분비 경로에서 지질 사슬 길이에 따라 단백질 화물을 선택적 수출 부위로 분류하는 최초의 직접적인 생체 내 증거를 제시합니다.
진핵세포에서 소포체(ER)에서 합성된 단백질은 분비 경로를 통해 이동하는 동안 분류되어 적절한 세포 목적지로 전달됩니다(1). 코트 매개 분류 외에도 특정 지질이 특정 단백질을 특정 막 영역으로 응집시켜 선택적 배출 지점 역할을 할 수 있다는 가설이 오랫동안 제기되어 왔습니다(2-5). 그러나 이러한 지질 기반 메커니즘을 입증할 직접적인 생체 내 증거는 아직 부족합니다. 이러한 근본적인 문제를 해결하기 위해 본 연구에서는 효모에서 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 단백질(GPI-AP)이 소포체에서 어떻게 차별적으로 분비되는지 연구했습니다. GPI-AP는 다양한 지질 연결 세포 표면 단백질입니다(6, 7). GPI-AP는 글리코지질 부분(GPI 앵커)을 통해 세포막의 바깥쪽 층에 부착된 분비 단백질입니다. 이들은 소포체 내강에서 보존적 번역 후 변형으로 GPI 앵커를 받습니다(8). GPI-AP는 부착 후 골지체(5, 9)를 거쳐 소포체(ER)에서 세포막으로 이동합니다. GPI 앵커의 존재로 인해 GPI-AP는 분비 경로를 따라 다른 세포막 단백질을 포함한 막관통 분비 단백질과 분리되어 수송됩니다(5, 9, 10). 효모 세포에서 GPI-AP는 소포체에서 다른 분비 단백질과 분리된 후, 코트 단백질 복합체 II(COPII)로 둘러싸인 특수한 소포에 포장됩니다(6, 7). 소포체 수출 과정에서 이러한 분류 과정의 결정 요인은 명확하지 않지만, 이 메커니즘에는 지질, 특히 GPI 앵커의 지질 부분의 구조적 재구성이 필요할 것으로 추측됩니다(5, 8). 효모에서 GPI 지질 재구성은 GPI가 부착된 직후 시작되며, 많은 경우 세라마이드가 26탄소 장쇄 포화 지방산(C26:0)에 결합하게 됩니다(11, 12). C26 세라마이드는 현재까지 효모 세포에서 생성되는 주요 세라마이드입니다. 이는 소포체(ER)에서 합성되며 대부분 COPII 소포를 통해 골지체로 수출됩니다(13). GPI-AP의 소포체 수출에는 지속적인 세라마이드 합성이 필수적이며(14, 15), 골지체에서 세라마이드가 이노시톨 인산 세라마이드(IPC)로 전환되는 과정은 GPI 앵커 합성에 의존합니다(16). 인공 막을 이용한 생물물리학적 연구에 따르면, 매우 긴 아실 사슬을 가진 세라마이드가 응집하여 독특한 물리적 특성을 지닌 질서정연한 영역을 형성할 수 있음이 밝혀졌습니다(17, 18). 이러한 데이터는 C26 세라마이드와 C26 세라마이드를 포함하는 GPI-AP가 물리적 특성을 이용하여 상대적으로 혼란스러운 소포체 막 지질 환경 내에서 질서정연한 영역으로 응집한다는 가설을 뒷받침합니다. 소포체는 주로 짧고 불포화된 글리세로지질(C16:1 및 C18:1)로 구성됩니다(19, 20). 이러한 영역은 세라마이드와 세라마이드 기반 GPI-AP가 동일한 전용 COPII 소포(5)에서 골지로 공동 수송될 수 있는 특정 ER 출구 부위(ERES)에 선택적으로 초점을 맞출 것입니다.
본 연구에서는 형광 표지된 단백질을 동시에 관찰할 수 있는 최첨단 현미경 기술인 초고해상도 공초점 실시간 이미징 현미경(SCLIM)을 사용하여 이 지질 기반 메커니즘을 직접 테스트했습니다. 3색 3차원(3D) 이미지는 살아있는 세포에서 매우 높은 해상도와 속도를 제공합니다(21, 22).
우리는 먼저 SCLIM 기술을 적용하여 S. cerevisiae에서 ER을 떠난 후 막횡단 분비 단백질로부터 C26 세라마이드 그룹을 가진 정상 GPI-AP가 어떻게 선별되는지 더 자세히 규명하고자 했습니다. ER 분류를 확인하기 위해 생체 내에서 ERES로 들어가는 새로 합성된 화물을 직접 시각화할 수 있는 유전 시스템을 사용했습니다(7, 23). 화물로는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 C26 세라마이드 기반 GPI-AP Gas1과 근적외선 형광 단백질(iRFP)로 표지된 막횡단 분비 단백질 Mid2를 선택했는데, 이 두 단백질은 모두 세포막을 표적으로 합니다(24-26). sec31-1 온도 민감성 돌연변이체에서 이 두 화물은 갈락토스 유도성 프로모터와 구성적 ERES 마커 하에서 발현됩니다. 극한 온도(37°C)에서 sec31-1 돌연변이는 COPII 코트 구성 요소인 Sec31의 기능을 저해하여 COPII 발아 및 ER 수출을 억제하기 때문에 새로 합성된 물질이 ER에 축적됩니다(23). 저온(24°C)으로 냉각 후, sec31-1 돌연변이 세포는 분비 영역에서 회복되었고, 축적된 새로운 합성 물질이 ER에서 수출되기 시작했습니다. CLIM 시각화 결과, 37°C에서 배양한 후 24°C에서 5분 동안 방출했을 때에도 새로 합성된 Gas1-GFP와 Mid2-iRFP의 대부분이 sec31-1 돌연변이 세포의 ER에 여전히 축적되어 있는 것을 확인할 수 있었습니다(그림 1). Mid2-iRFP는 ER 막 전체에 분포하는 반면, Gas1-GFP는 불연속적인 ER 막 영역에 집중되어 있기 때문에 이들의 분포 양상은 완전히 다릅니다(그림 1, A~C 및 보충 영상 S1). 또한, 그림 1D에서 볼 수 있듯이 Gas1-GFP 클러스터에는 Mid2-iRFP가 없습니다. 이러한 결과는 GPI-AP와 막횡단 단백질이 초기에 서로 다른 ER 막 영역으로 분리되었음을 나타냅니다. Gas1-GFP 클러스터는 mCherry의 COPII 코트 단백질 Sec13으로 표시된 특정 ERES에 인접해 있습니다(그림 1, E 및 F, 그리고 동영상 S1)(23).
sec31-1 세포는 갈락토스 유도 분비물인 긴 아실 사슬(C26) 세라마이드 GPI-AP Gas1-GFP(GPI-AP, 녹색)와 막횡단 단백질 Mid2-iRFP(TMP, 파란색)를 발현하며, 이 구성적 ERES 라벨링 Sec13-mCherry(ERES, 자홍색)를 37°C에서 30분간 배양한 후 24°C로 옮겨 5분 후 SCLIM으로 이미지를 촬영하였다. (A~C)는 각각 평면의 대표적인 병합 또는 단일 2D 이미지(A), 10개의 z축 단면의 2D 투영 이미지(B), 또는 화물 및 ERES 마커의 3D 세포 반구 이미지(C)를 보여준다. 스케일 바는 1μm(A 및 B)이고, 스케일 단위는 0.551μm(C)이다. Gas1-GFP는 특정 ER 영역 또는 클러스터에서 검출되었고, Mid2-iRFP는 ER 막 전체에 분포되어 검출되었습니다(C). (D) 그래프는 흰색 화살표(왼쪽)를 따라 Gas1-GFP 클러스터 내에서 Gas1-GFP와 Mid2-iRFP의 상대적인 형광 강도를 보여줍니다. AU는 임의 단위입니다. (E 및 F)는 제품과 ERES 표시를 결합한 3D 이미지를 나타냅니다. Gas1-GFP 클러스터는 특정 ERES 근처에서 검출되었습니다. 스케일 단위는 0.551μm입니다. (F) 흰색 실선 화살표는 ERES와 관련된 Gas1-GFP 클러스터를 표시합니다. 가운데 및 오른쪽 패널은 병합된 확대 3D 이미지와 선택된 Gas1-GFP 클러스터의 회전된 모습을 보여줍니다.
Gas1-GFP 클러스터와 특정 ERES 사이의 밀접한 공간적 관계는 Gas1-GFP가 선택적인 ERES에 진입할 수 있음을 시사하며, 이는 Mid2-iRFP가 ER을 빠져나갈 때 사용하는 선택성과는 다릅니다. 이러한 가능성을 확인하기 위해, 우리는 한 가지 또는 두 가지 물질만 포함하는 ERES의 비율을 정량화했습니다(그림 2, A~C). 대부분의 ERES(70%)는 한 가지 유형의 물질만 포함하고 있음을 발견했습니다. 그림 2C의 하단 이미지는 Gas1-GFP만 포함하는 ERES(그림 1) 또는 Mid2-iRFP만 포함하는 ERES(그림 2)의 두 가지 전형적인 예를 보여줍니다. 이와 대조적으로, 약 20%의 ERES는 동일한 영역에서 겹치는 두 가지 유형의 물질을 포함하고 있었습니다. 일부 ERES(10%)는 두 가지 유형의 물질을 포함하고 있었지만, 이들은 명확하게 다른 영역에 분리되어 있었습니다. 따라서, 이 통계 분석은 ER을 통과한 후 GPI-AP인 Gas1-GFP와 막관통 물질인 Mid2-iRFP가 서로 다른 ERES로 나뉘어진다는 것을 보여줍니다(그림 2D). 이러한 분류 효율은 이전의 생화학적 분석(6) 및 형태학적 결정(7)과 매우 일치합니다. 또한 ERES로 들어가는 격리된 화물의 거동을 관찰할 수 있습니다(그림 2E 및 동영상 S2). 그림 2E는 Gas1-GFP(패널 3) 또는 Mid2-iRFP(패널 4)의 일부만 한쪽에서 ERES로 들어가 특정 영역에 국한되는 것을 보여줍니다. 그림 2E의 패널 5는 Gas1-GFP와 Mid2-iRFP가 때때로 동일한 ERES에서 발견되지만, 서로 다른 쪽에서 들어가 서로 다른 COPII 소포를 나타낼 수 있는 별개의 영역에 집중되어 있음을 보여줍니다. 또한 C26 세라마이드 기반 GPI-AP인 Gas1의 선택적 ERES 분리 및 분류가 특이적임을 확인했습니다. 왜냐하면 또 다른 막횡단 분비 화물인 GFP 태그가 부착된 세포막 단백질 Axl2(27)도 Mid2-iRFP와 유사한 거동을 보였기 때문입니다(사진 S1 및 동영상 S3). 새롭게 합성된 Axl2-GFP는 Mid2-iRFP처럼 ER 막을 통해 분포하며(그림 S1, A 및 B), 대부분의 ERES에서 Mid2-iRFP와 함께 국소화됩니다(그림 S1, B~D). 그림 1의 패널 1과 2를 참조하십시오. S1C는 ​​두 개의 막횡단 운반체가 겹치는 두 가지 전형적인 ERES 사례를 보여줍니다. 이러한 경우, 두 운반체는 함께 ERES로 들어갑니다(그림 S1E, 패널 3 및 동영상 S3).
갈락토스 유도 분비 단백질인 Gas1-GFP(GPI-AP, 녹색)와 Mid2-iRFP(TMP, 파란색)를 발현하는 sec31-1 세포와 구성적 ERES 라벨링 단백질인 Sec13-mCherry(ERES, 자홍색)를 37°C에서 30분간 배양한 후, 분비 억제를 해제하기 위해 24°C로 옮기고 20분 후 SCLIM으로 이미지를 촬영하였다. (A~C) 화물과 ERES로 표시된 10개의 z축 단면의 대표적인 2D 투영 이미지(A; 스케일 바, 1μm) 또는 3D 세포 반구 이미지(B 및 C; 스케일 단위, 0.456μm)이다. (B)의 하단 패널과 (C)의 패널은 ERES(자홍색)에 존재하는 화물[Gas1-GFP(회색) 및 Mid2-iRFP(연한 파란색)]만 표시하도록 처리한 이미지이다. (C) 빈 화살표: ERES는 하나의 화물(1~4)만 운반합니다. 회색 화살표: ERES는 분리된 화물(5)을 포함합니다. 흰색 실선 화살표: ERES는 공동 위치 화물을 포함합니다. 아래: 선택된 단일 ERES는 Gas1-GFP(1) 또는 Mid2-iRFP(2)만 포함합니다. 스케일 바, 100 nm. (D) (C)에 설명된 현미경 사진의 정량화. 하나의 화물(Gas1-GFP 또는 Mid2-iRFP)만 포함하는 ERES, 분리된 화물 및 겹치는 화물의 평균 백분율. 3개의 독립적인 실험에서 54개 세포에서 n=432. 오차 막대 = 표준 편차. 양측 비쌍 t 검정. *** P = 0.0002. (E) (C)로 표시된 격리된 화물의 선택된 ERES의 3D 이미지. Gas1-GFP(녹색)(3) 또는 Mid2-iRFP(파란색)(4)는 한쪽에서 ERES(자홍색)로 들어가 ERES 내의 작은 영역에 국한됩니다. 때때로 두 종류의 화물이 동일한 ERES(5)의 동일한 측면에서 들어가 ERES 내의 격리된 영역에 갇히게 됩니다. 스케일 바, 100nm.
다음으로, 우리는 ER 막에 존재하는 긴 아실 사슬 세라마이드(C26)가 Gas1의 특정 클러스터링 및 분류를 선택적인 ERES로 유도한다는 가설을 검증했습니다. 이를 위해 우리는 두 개의 내인성 세라마이드 합성효소인 Lag1과 Lac1을 GhLag1(목화의 Lag1 동족체)로 대체한 변형 효모 균주 GhLag1을 사용했습니다. 그 결과, 세포막 세라마이드 사슬이 야생형보다 짧은 효모 균주가 생성되었습니다(그림 3A)(28). 질량 분석법(MS) 분석 결과, 야생형 균주에서는 전체 세라마이드의 95%가 매우 긴(C26) 사슬 세라마이드인 반면, GhLag1에서는 세라마이드의 85%가 매우 긴(C18 및 C16) 사슬 세라마이드이고, 단 2%만이 매우 긴(C26) 사슬 세라마이드인 것으로 나타났습니다. 지금까지 GhLag1 막에서 검출된 주요 세라마이드는 C18 및 C16 세라마이드이지만, MS 분석 결과 GhLag1 균주에서 발현된 Gas1-GFP의 GPI 앵커에는 야생형 지질과 유사한 C26 세라마이드가 포함되어 있음이 확인되었습니다(그림 3A)(26). 따라서 이는 세라마이드 재구성 효소인 Cwh43이 C26 세라마이드에 대해 높은 선택성을 가지며, 그림 26에서 볼 수 있듯이 GhLag1 균주에 소량 존재하는 C26 세라마이드로부터 GPI 앵커를 우선적으로 통합한다는 것을 의미합니다(29). 그럼에도 불구하고 GhLag1의 세포막은 기본적으로 C18-C16 세라마이드만 포함하는 반면, Gas1-GFP는 여전히 C26 세라마이드를 가지고 있습니다. 이러한 사실은 이 균주를 ER 내 막 세라마이드의 아실 사슬 길이 문제를 특이적으로 해결하는 데 이상적인 도구로 만듭니다. 다음으로, 온도 민감성 돌연변이 대립유전자 sec31-1을 가진 GhLag1에서 C26 Gas1-GFP가 클러스터 형태로 축적되는 능력을 일반 형광 현미경을 통해 연구했습니다. 이 돌연변이 대립유전자에서는 ER 막 세라마이드에 긴 사슬(C18-C16)만 존재합니다(그림 3). sec31-1에서는 Gas1-GFP의 대부분이 클러스터 형태로 집중되어 있는 반면, 긴 사슬(C18-C16) 세라마이드가 존재하는 sec31-1 GhLag1에서는 Gas1-GFP가 주로 클러스터를 형성하지 않고 ER 막 전체에 분포되어 있는 것을 관찰했습니다. 특히, C26 세라마이드 기반 클러스터링이 특정 ERES와 밀접한 관련이 있기 때문에(그림 1), 이 과정이 ER 수출 단백질 메커니즘의 기능과도 관련이 있는지 조사했습니다. GPI-AP는 ER 수출을 위해 특수한 COPII 시스템을 사용하는데, 이는 GPI 앵커의 글리칸 부분에 대한 Ted1의 구조적 재구성에 의해 능동적으로 조절됩니다(30, 31). 재조합 GPI-글리칸은 막횡단 화물 수용체 p24 복합체에 의해 인식되고, 이 복합체는 주요 COPII 화물 결합 소단위인 Sec24의 특정 동형 단백질인 Lst1을 선택적으로 모집하여 GPI-AP가 풍부한 COPII 소포를 형성합니다(31-33). 따라서 우리는 이러한 단백질(p24 복합체 구성 요소 Emp24, GPI-글리칸 재구성 효소 Ted1 및 특정 COPII 소단위 Lst1)의 결손을 sec31-1 돌연변이 균주와 결합시킨 이중 돌연변이를 제작하고, 이들이 Gas1-클러스터 GFP를 형성할 수 있는지 연구했습니다(그림 3). sec31-1emp24Δ 및 sec31-1ted1Δ에서 Gas1-GFP는 이전에 sec31-1 GhLag1에서 관찰된 바와 같이 주로 응집되지 않고 ER 막 전체에 분포되어 있는 반면, sec31-1lst1Δ에서는 Gas1-GFP가 sec31-1과 유사하게 분포되어 있음을 관찰했습니다. 이러한 결과는 ER 막에 C26 세라마이드가 존재할 뿐만 아니라 Gas1-GFP의 응집에는 p24 복합체와의 결합이 필요하며, 특정 Lst1 모집은 필요하지 않음을 시사합니다. 다음으로, ER 막에 존재하는 세라마이드의 사슬 길이가 Gas1-GFP와 p24의 결합을 조절할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 그러나 막에 C18-C16 세라마이드가 존재하더라도 p24 복합체에 의해 재구성된 GPI-글리칸(그림 S3 및 S4, A 및 B)이나 GPI-AP와의 결합 및 GPI-AP의 수출 능력에는 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다. COPII 아형 Lst1을 모집합니다(그림 S4C). 따라서 C26 세라마이드 의존적 클러스터링은 서로 다른 ER 수출 단백질 메커니즘과의 단백질 상호작용을 필요로 하지 않지만, 지질 길이에 의해 유도되는 대체 분류 메커니즘을 뒷받침합니다. 다음으로, ER 막의 세라마이드 아실 사슬 길이가 Gas1-GFP를 선택적 ERES로 효과적으로 분류하는 데 중요한지 분석했습니다. 짧은 사슬 세라마이드를 가진 GhLag1 균주의 Gas1이 ER을 떠나 세포막으로 들어가기 때문에(그림 S5), 분류가 세라마이드 아실 사슬 길이에 의해 유도된다면 GhLag1 균주의 Gas1은 방향을 바꿔 동일한 막을 가진 다른 ERES로 이동할 수 있다고 생각합니다.
(A) GhLag1의 세포막은 주로 C18-C16 길이의 짧은 세라마이드를 함유하는 반면, Gas1-GFP의 GPI 앵커는 야생형 세포와 동일한 C26 IPC를 가지고 있다. 위: 질량 분석법(MS)을 이용한 야생형(Wt) 및 GhLag1p 균주의 세포막 세라마이드의 아실 사슬 길이 분석. 데이터는 총 세라마이드 함량에 대한 백분율을 나타낸다. 3회 독립 실험의 평균값. 오차 막대 = 표준편차. 양측 비쌍 t 검정. **** P < 0.0001. 아래: 야생형 및 GhLag1p 균주에서 발현된 Gas1-GFP(GPI-IPC) GPI 앵커에 존재하는 IPC의 아실 사슬 길이에 대한 MS 분석. 데이터는 총 IPC 신호에 대한 백분율을 나타낸다. 5회 독립 실험의 평균값. 오차 막대 = 표준편차. 양측 비쌍 t 검정. ns, 유의미하지 않음. P = 0.9134. (B) 갈락토스 유도 Gas1-GFP를 발현하는 sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ 및 sec31-1lst1Δ 세포를 37°C에서 30분간 배양한 후 24°C로 식혀 일반적인 형광 현미경 관찰을 수행하였다. 흰색 화살표: ER Gas1-GFP 클러스터. 빈 화살표: 클러스터화되지 않은 Gas1-GFP가 ER 막 전체에 분포되어 있으며, ER 특유의 핵 고리 염색을 나타낸다. 스케일 바: 5μm. (C) (B)에 기술된 현미경 사진의 정량 분석. 점상 Gas1-GFP 구조를 가진 세포의 평균 백분율. 3회 독립 실험, n≥300개 세포. 오차 막대 = 표준편차. 양측 비쌍 t 검정. **** P <0.0001.
이 문제를 직접적으로 해결하기 위해, 온도 민감성 돌연변이 대립유전자 sec31-1을 가진 GhLag1에서 Gas1-GFP와 Mid2-iRFP의 SCLIM 시각화를 수행했습니다(그림 4 및 보충 영상 S4). ER을 37°C에 유지한 후 24°C에서 방출했을 때, 새로 합성된 Gas1-GFP의 대부분은 응집되지 않고 ER 막 전체에 분포되어 있는 것이 일반 현미경으로 관찰되었습니다(그림 4, A 및 B). 또한, 상당수의 ERES(67%)에는 두 종류의 단백질이 함께 존재했습니다(그림 4D). 그림 4C의 패널 1과 2는 Gas1-GFP와 Mid2-GFP가 겹쳐 있는 ERES의 두 가지 전형적인 예를 보여줍니다. 또한, 두 단백질 모두 동일한 ERES에 결합되어 있었습니다(그림 4E, 패널 3 및 보충 영상 S4). 따라서, 본 연구 결과는 ER 막 내 세라마이드 아실 사슬의 길이가 ER 단백질 응집 및 분류를 결정하는 중요한 요소임을 시사합니다.
갈락토스 유도 분비물인 Gas1-GFP(GPI-AP, 녹색)와 Mid2-iRFP(TMP, 파란색)를 발현하는 Sec31-1 GhLag1 세포와 구성적 ERES 표지 Sec13-mCherry(ERES, 자홍색)를 37°C에서 배양합니다. 30분간 배양 후 온도를 24°C로 낮춰 분비물을 방출시키고 20분 후 SCLIM으로 이미지를 촬영합니다. (A~C) 화물과 ERES로 표시된 10개의 z축 단면의 대표적인 2D 투영 이미지(A; 스케일 바, 1μm) 또는 3D 세포 반구 이미지(B 및 C; 스케일 단위, 0.45μm)입니다. (B)의 하단 패널과 (C)의 패널은 ERES(자홍색)에 존재하는 화물[Gas1-GFP(회색) 및 Mid2-iRFP(연한 파란색)]만 표시하도록 처리된 이미지입니다. (C) 흰색 화살표: ERES, 상품 중복. 빈 화살표: ERES에 상품이 하나만 포함됨. 아래 패널: 선택된 ERES는 (C)에 표시된 중복 상품(1과 2)을 포함합니다. 스케일 바, 100 nm. (D) (C)에 설명된 현미경 사진의 정량화. sec31-1 및 sec31-1 GhLag1 단위에는 하나의 화물(Gas1-GFP 또는 Mid2-iRFP)만 포함되며, 분리된 화물과 중복되는 화물에 대한 ERES의 평균 백분율을 나타냅니다. 세 번의 독립적인 실험에서, 54개 세포(sec31-1)에서 n = 432, 47개 세포(sec31-1 GhLag1)에서 n = 430입니다. 오차 막대 = 표준 편차. 양측 비쌍 t 검정. *** P = 0.0002 (sec31-1) 및 ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)에 표시된 겹치는 화물(3)을 포함하는 선택된 ERES의 3D 이미지. Gas1-GFP(녹색)와 Mid2-iRFP(파란색)는 동일한 측면에서 ERES(자홍색)에 접근하여 동일한 ERES 제한 영역에 머무릅니다. 스케일 바, 100 nm.
본 연구는 지질 기반 단백질 운반체가 분비 경로에서 선택적인 수출 부위로 분류된다는 직접적인 생체 내 증거를 제시하고, 분류 선택성에 있어 아실 사슬 길이의 중요성을 밝혀냈습니다. SCLIM이라는 강력하고 최첨단 현미경 기술을 사용하여, 효모에서 새롭게 합성된 Gas1-GFP(매우 긴 아실 사슬(C26) 세라마이드 지질 부분을 가진 주요 세포막 GPI-AP)를 관찰했습니다. 특정 ER에 밀집된 영역들은 특정한 ERES와 연관되어 있는 반면, 막관통 분비 단백질은 ER 막 전체에 분포되어 있습니다(그림 1). 또한, 이 두 종류의 운반체는 서로 다른 ERES로 선택적으로 들어갑니다(그림 2). 세포막 내 세라마이드의 아실 사슬 길이가 C26에서 C18-C16으로 감소하면, Gas1-GFP 밀집 영역은 특정 ER 영역으로 분산되고, Gas1-GFP는 막관통 단백질과 함께 동일한 ERES를 통해 ER을 빠져나가는 경로로 변경됩니다(그림 3 및 3). 4).
GPI-AP는 특수한 단백질 메커니즘을 이용하여 ER을 빠져나가지만, C26 세라마이드 의존적 분리는 ERES 특수화를 유도할 수 있는 차별적인 단백질 상호작용에 의존하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 S4 및 S5). 오히려, 우리의 연구 결과는 지질 기반 단백질 클러스터링과 그에 따른 다른 화물의 배제를 통해 이루어지는 대안적인 분류 메커니즘을 뒷받침합니다. 우리의 관찰에 따르면 특정 ERES와 관련된 Gas1-GFP 영역 또는 클러스터에는 막관통 분비 단백질인 Mid2-iRFP가 존재하지 않는데, 이는 C26 세라마이드 의존적 GPI-AP 클러스터가 해당 ERES로의 진입을 촉진하는 동시에 막관통 분비 단백질이 이 특정 ERES로 들어가는 것을 배제한다는 것을 시사합니다(그림 1 및 2). 대조적으로, ER 막에 C18-C16 세라마이드가 존재하더라도 GPI-AP는 영역이나 클러스터를 형성하지 않으므로, 동일한 ERES로 막관통 분비 단백질을 배제하거나 대체하지 않습니다(그림 3 및 4). 따라서 우리는 C26 세라마이드가 특정 ERES와 연결된 단백질의 클러스터링을 촉진함으로써 분리 및 분류를 유도한다고 제안합니다.
어떻게 특정 ER 영역으로 C26 세라마이드 의존적 클러스터링을 달성할 수 있을까요? 막 세라마이드의 측면 분리 경향으로 인해 GPI-AP와 C26 세라마이드는 더 짧고 불포화된 글리세로지질을 포함하는 ER 막의 불규칙한 지질 환경에서 작고 즉각적으로 정렬된 지질을 형성할 수 있습니다. 이러한 작고 일시적인 클러스터는 p24 복합체와 결합한 후 더 크고 안정적인 클러스터로 융합될 수 있습니다(17, 18). 이와 일관되게, 우리는 C26 Gas1-GFP가 더 크고 가시적인 클러스터를 형성하기 위해서는 p24 복합체와 상호작용해야 함을 보여주었습니다(그림 3). p24 복합체는 효모에서 4개의 서로 다른 p24 막횡단 단백질로 구성된 이형접합 올리고머(35)이며, 다가 결합을 제공하여 작은 GPI-AP 클러스터의 가교 결합을 유도하고 더 크고 안정적인 클러스터를 생성할 수 있습니다(34). GPI-AP의 단백질 외피 도메인 간의 상호작용은 포유류의 극성 상피 세포에서 골지체 수송 중에 나타난 것처럼 응집에 기여할 수도 있습니다(36). 그러나 ER 막에 C18-C16 세라마이드가 존재할 때, p24 복합체가 Gas1-GFP에 결합하면 큰 분리된 클러스터가 형성되지 않습니다. 근본적인 메커니즘은 긴 아실 사슬 세라마이드의 특정한 물리적 및 화학적 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 인공 막에 대한 생물물리학적 연구에 따르면 긴(C24) 및 짧은(C18-C16) 아실 사슬 세라마이드 모두 상 분리를 유발할 수 있지만, 긴 아실 사슬 세라마이드(C24)만이 높은 곡률과 막 굽힘을 유도하여 막을 재성형시킬 수 있습니다. 이는 상호 참조를 통해 이루어집니다(17, 37, 38). Emp24의 인간 동족체인 TMED2의 막관통 나선 구조가 세포질 소엽에서 C18 세라마이드 기반 스핑고미엘린과 선택적으로 상호작용하는 것으로 나타났습니다(39). 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 통해 C18 및 C26 세라마이드 모두 Emp24 막관통 나선 구조의 세포질 소엽 주변에 축적되며 유사한 선호도를 보이는 것을 확인했습니다(그림 S6). 이는 Emp24의 막관통 나선 구조가 막 내 지질의 비대칭적 분포를 유발할 수 있음을 시사합니다. 이는 포유류 세포를 기반으로 한 최근 연구 결과입니다. 유사한 MD 시뮬레이션에서도 에테르 지질의 존재가 확인되었습니다(40). 따라서 우리는 ER26의 두 소엽에서 C26 세라마이드가 국소적으로 풍부하게 존재한다고 추측합니다. 내강 소엽의 GPI-AP가 다가성 p24에 직접 결합하고 세포질 소엽에서 p24 주변에 C26 세라마이드가 축적되면, 동반되는 단백질 응집과 막 곡률이 손가락(41)을 통해 생성되어 GPI-AP가 ERES에 인접한 개별 영역으로 분리되고, 이는 또한 ER 막의 곡률이 큰 영역을 형성하는 데 유리하게 작용합니다(42). 이전 연구들은 제안된 메커니즘을 뒷받침합니다(43, 44). 올리고렉틴, 병원체 또는 항체가 세포막의 세라마이드 기반 당지질(GSL)에 다가 결합하면 GSL의 대량 응집이 유발되고, 상 분리가 강화되며, 막 변형 및 세포 내 유입이 일어납니다(44). 이와부치 등(43)은 긴(C24) 아실 사슬이 존재할 때 짧은(C16) 아실 사슬이 존재하지 않는 경우 GSL 락토실세라마이드에 결합된 다가 리간드가 큰 클러스터 형성과 막 함입을 유도하고 결합된 호중구에서 아실 사슬에 의해 겹치는 소엽의 세포질 Lyn 매개 신호 전달이 유도된다는 것을 발견했습니다.
포유류의 극성 상피 세포에서, 세포막 상단까지 존재하는 항골지 네트워크(TGN)의 농도는 GPI-AP의 분리 및 분류를 조절합니다(10, 45). 이러한 응집은 GPI-AP 올리고머화에 의해 유도되지만(36), 효모에서 발견되는 세라마이드 사슬 길이에도 의존할 수 있습니다. 포유류 GPI-AP는 에테르 지질 기반 앵커를 가지고 있으며, 그 화학 구조는 매우 긴 아실 사슬 세라마이드와는 매우 다르지만, 최근 연구에 따르면 두 지질은 진화적으로 유사한 물리적, 화학적 특성과 기능을 가지고 있는 것으로 나타났습니다(40). 따라서 포유류 세포의 에테르 지질 부분은 효모의 C26 세라마이드와 유사하며, 막에서 긴 사슬 세라마이드와 결합하여 GPI-AP의 응집 및 분류를 촉진하는 역할을 할 수 있습니다. 이 가능성은 아직 직접적으로 검증해야 하지만, 이전 연구 결과는 긴 아실 사슬 세라마이드의 골지체로의 수송이 세포질 전달 단백질에 의해 수행되는 것이 아니라 효모와 같은 GPI 앵커의 합성에 의존한다는 것을 뒷받침합니다. 따라서 진화적으로 보존된 메커니즘은 매우 긴 아실 사슬 세라마이드와 GPI-AP를 동일한 수송 소포 내에서 선택적으로 공동 수송할 수 있는 것으로 보입니다(13, 16, 20, 46, 47).
효모 및 포유류 극성 상피 세포 시스템에서 GPI-AP의 응집 및 다른 세포막 단백질과의 분리는 모두 세포 표면에 도달하기 전에 발생합니다. Paladino 등(48)은 포유류 극성 상피 세포의 TGN에서 GPI-AP 클러스터링이 GPI-AP를 첨단 세포막으로 선택적으로 분류하는 데 필요할 뿐만 아니라 GPI-AP의 클러스터링 구조와 생물학적 활성을 조절한다는 것을 발견했습니다. 효모에서 이 연구는 ER에 있는 C26 세라마이드 의존성 GPI-AP 클러스터가 세포막에서 GPI-AP의 클러스터 구조와 기능적 활성을 조절할 수 있음을 보여주었습니다(24, 49). 이 모델과 일관되게, GhLag1 세포는 GPI 억제제 또는 세포벽 완전성에 영향을 미치는 약물에 알레르기 반응을 보이며(28), 효모 세포 접합에서 돌출된 첨단 세라마이드의 기능적 Gas1-GFP 클러스터(49)가 필요하다는 것은 GhLag1 세포의 가능한 생리적 결과를 시사합니다. GPI-AP 오류입니다. 그러나 세포 표면의 기능적 조직화가 지질 길이에 기반한 분류 방법을 통해 ER로부터 프로그램되었는지 여부를 추가적으로 검증하는 것이 향후 연구 주제가 될 것입니다.
본 연구에 사용된 Saccharomyces cerevisiae 균주는 표 S1에 나열되어 있다. 생세포 이미징을 위한 SCLIM의 MMY1583 및 MMY1635 균주는 W303을 배경으로 구축되었다. 형광 단백질 태그가 부착된 Sec13-mCherry를 발현하는 이들 균주는 pFA6a 플라스미드를 주형으로 하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 방법을 사용하여 구축되었다(23). GAL1 프로모터의 조절 하에 형광 단백질로 표지된 Mid2-iRFP를 발현하는 균주는 다음과 같이 구축되었다. pKTiRFP-KAN 벡터(E. O'Shea 제공, Addgene 플라스미드 번호 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; 연구 자원 식별자(RRID): Addgene_64687)로부터 iRFP-KanMx 서열을 PCR 증폭하여 내인성 Mid2의 C-말단에 삽입하였다. Mid2-iRFP 게놈 서열을 증폭하여 GAL1 프로모터에 클로닝한 후, 이를 통합 플라스미드 pRS306의 Not I-Sac I 부위에 삽입하였다. 이렇게 얻은 플라스미드 pRGS7을 Pst I으로 선형화하여 URA3 유전자좌에 삽입하였다.
Gas1-GFP 융합 유전자는 중심체(CEN) 플라스미드 내의 GAL1 프로모터의 조절 하에 발현되며, 이 플라스미드는 다음과 같이 구성됩니다. Gas1-GFP 서열은 pRS416-GAS1-GFP 플라스미드(24)(L. Popolo 제공)에서 PCR로 증폭하여 CEN 플라스미드 pBEVY-GL LEU2(C. Miller 제공; Addgene 플라스미드 번호 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)의 Xma I–Xho I 부위에 클로닝했습니다. 이렇게 얻은 플라스미드를 pRGS6이라고 명명했습니다. Axl2-GFP 융합 유전자 또한 pBEVY-GL LEU2 벡터의 GAL1 프로모터의 조절 하에 발현되며, 그 구성은 다음과 같습니다. Axl2-GFP 서열은 PCR을 통해 pRS304-p2HSE-Axl2-GFP 플라스미드(23)로부터 증폭되었고, pBEVY-GL LEU2 벡터의 Bam HI-Pst I 부위에 클로닝되었습니다. 결과적으로 생성된 플라스미드는 pRGS12로 명명되었습니다. 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 S2에 나열되어 있습니다.
해당 균주는 0.2% 아데닌과 2% 포도당[YP-덱스트로스(YPD)], 2% 라피노스[YP-라피노스]가 풍부한 효모 추출물 단백질 p(YP) 배지(1% 효모 추출물 및 2% 단백질 p(YPR)) 또는 2% 갈락토스[YP-갈락토스(YPG)]를 탄소원으로 첨가하거나, 영양에 필요한 적절한 아미노산과 염기를 보충하기 위해 합성 최소 배지(0.15% 효모 질소 염기 및 0.5% 황산암모늄)에 첨가하고, 탄소원으로 2% 포도당(합성 포도당 최소 배지) 또는 2% 갈락토스(합성 갈락토스 최소 배지)를 첨가하여 배양하였다.
실시간 이미징을 위해 GAL1 프로모터 조절 하에 유전자 구조를 발현하는 온도 민감성 sec31-1 돌연변이 세포를 YPR 배지에서 24°C에서 하룻밤 배양하여 대수 증식기 중반에 도달시켰습니다. 24°C에서 1시간 동안 YPG 배지에서 유도한 후, 세포를 SG 배지에서 37°C로 30분간 배양하고, 24°C로 옮겨 분비 억제를 해제했습니다. 콘카나발린 A를 사용하여 세포를 유리 슬라이드에 고정하고 SCLIM으로 이미징했습니다. SCLIM은 Olympus IX-71 역형광 현미경과 UPlanSApo 100×1.4 개구수 오일 렌즈(Olympus), 고속 및 고신호 대 잡음비 회전 디스크 공초점 스캐너(Yokogawa Electric), 맞춤형 분광기 및 맞춤형 냉각 장치의 조합입니다. 시스템의 이미지 증폭기(Hamamatsu Photonics)는 최종 배율이 ×266.7인 확대 렌즈 시스템과 전자를 증폭하는 전하 결합 소자 카메라(Hamamatsu Photonics)를 제공할 수 있습니다(21). 이미지 획득은 맞춤형 소프트웨어(Yokogawa Electric)를 통해 수행됩니다. 3D 이미지의 경우, 맞춤 제작된 압전 액추에이터를 사용하여 대물 렌즈를 수직으로 진동시키고 광학 부품들을 100nm 간격으로 쌓아 올렸습니다. Z-스택 이미지는 3D 복셀 데이터로 변환되었고, 회전 디스크 공초점 현미경에 사용되는 이론적인 점 확산 함수(PSF)를 이용하여 Volocity 소프트웨어(PerkinElmer)로 디컨볼루션 처리를 수행했습니다. Volocity 소프트웨어를 사용하여 위치 분석을 위한 임계값을 자동으로 설정함으로써, 화물을 포함한 ERES를 측정했습니다. 라인 스캔 분석은 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 수행했습니다.
GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의성을 판단하십시오. 양측 검정 스튜던트 t-검정과 일반적인 일원 분산 분석(ANOVA)에서 그룹 간 차이는 P < 0.05일 때 유의미한 것으로 간주합니다(*).
Gas1-GFP의 형광 현미경 관찰을 위해 대수 성장기 세포를 YPD에서 하룻밤 배양한 후 원심분리하여 수집하고 인산염 완충 식염수로 두 번 세척한 다음 최소 15분 동안 얼음 위에서 배양한 후 이전에 설명한 대로 현미경으로 관찰하였다(24). 대물렌즈, L5(GFP) 필터, Hamamatsu 카메라 및 Application Suite X(LAS X) 소프트웨어가 장착된 Leica DMi8 현미경(HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS)을 사용하여 이미지를 획득하였다.
시료를 SDS 샘플 버퍼로 65°C에서 10분간 변성시킨 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하였다. 면역블롯 분석을 위해 각 레인에 10 μl의 시료를 로딩하였다. 1차 항체: 토끼 다클론 항체 anti-Gas1은 1:3000 희석, 토끼 다클론 항체 anti-Emp24는 1:500 희석, 토끼 다클론 항체 anti-GFP(H. Riezman 제공)는 1:3000 희석하여 사용하였다. 마우스 단클론 항체 anti-Pgk1은 1:5000 희석하여 사용하였다(J. de la Cruz 제공). 2차 항체: HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 염소 항토끼 면역글로불린 G(IgG)를 1:3000 희석하여 사용하였다(Pierce). HRP 접합 염소 항마우스 IgG를 1:3000 희석액(Pierce)으로 사용하였다. 면역 반응 영역은 SuperSignal West Pico 시약(Thermo Fisher Scientific)을 이용한 화학발광법으로 관찰하였다.
(31)에 기술된 바와 같이, 농축된 ER 분획에 대해 자연 면역침전 실험을 수행하였다. 간단히 말하면, 효모 세포를 TNE 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드 및 프로테아제 억제제 혼합물]으로 600 nm(OD600)에서 100 광학 밀도로 두 번 세척하였다. 유리 비드를 이용하여 파쇄한 후, 원심분리를 통해 세포 파편과 유리 비드를 제거하였다. 상층액을 4°C에서 15분 동안 17,000 g로 원심분리하였다. 침전물을 TNE에 재현탁시키고 디기탈리스 사포닌을 최종 농도 1%가 되도록 첨가하였다. 현탁액을 4°C에서 1시간 동안 회전시키면서 배양한 후, 4°C에서 60분 동안 13,000 g로 원심분리하여 불용성 성분을 제거하였다. Gas1-GFP 면역침전법을 위해 먼저 시료를 빈 아가로스 비드(ChromoTek)와 함께 4°C에서 1시간 동안 전처리한 후, GFP-Trap_A(ChromoTek)와 함께 4°C에서 3시간 동안 배양하였다. 면역침전된 비드를 0.2% 디곡시게닌을 함유한 TNE 용액으로 5회 세척하고, SDS 샘플 버퍼로 용출한 후, SDS-PAGE에서 분리하고 면역블롯팅으로 분석하였다.
(31)에 기술된 바와 같이, 가교결합 측정은 농축된 ER 분획에서 수행되었습니다. 간단히 말하면, 농축된 ER 분획을 0.5 mM 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20분)와 함께 배양했습니다. 가교결합 반응은 글리신(최종 농도 50 mM, 5분, 20°C)을 첨가하여 중단시켰습니다.
이전에 설명한 바와 같이(50), 야생형 및 GhLag1 균주의 세라마이드에 대한 MS 분석을 수행했습니다. 간단히 말하면, 세포를 30°C의 YPD에서 지수 성장기(3~4 OD600 단위/ml)까지 배양한 후 25×10⁷개의 세포를 수확했습니다. 트리클로로아세트산으로 대사를 중단시켰습니다. 추출 용매[에탄올, 물, 에테르, 피리딘 및 4.2 N 암모늄 하이드록사이드(15:15:5:1:0.018 v/v)]와 내부 표준 물질 C17 세라마이드(860517, Avanti polar lipid) 1.2 nmol을 사용했습니다. 모노메틸아민 시약[메탄올, 물, n-부탄올 및 메틸아민 용액(4:3:1:5 v/v)]을 사용하여 추출물을 약알칼리 가수분해한 다음, 물로 포화된 n-부탄올을 사용하여 탈염했습니다. 마지막으로, 추출물을 양이온 모드 용매[클로로포름/메탄올/물(2:7:1) + 5 mM 아세트산암모늄]에 재현탁시킨 후 질량 분석기에 주입하였다. 스핑고지질 분자의 확인 및 정량을 위해 다중 반응 모니터링(MRM)을 수행하였다. TSQ Vantage 3차 사중극자 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)는 지질 분석을 위해 로봇 나노플로우 이온 소스 Nanomate HD(Advion Biosciences, Ithaca, NY)를 장착하고 있다. 충돌 에너지는 각 세라마이드 종류에 맞게 최적화되었다. MS 데이터는 양이온 모드에서 얻었다. 각 생물학적 반복 실험에서 지질 신호는 세 번의 독립적인 측정값의 중앙값이다.
(31)에 기술된 바와 같이, Gas1-GFP를 발현하는 세포(800×107)를 자연 면역침전법으로 처리하였다. 정제된 Gas1-GFP는 SDS-PAGE로 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼다. 단백질은 아미드 블랙으로 PVDF를 염색하여 시각화하였다. Gas1-GFP 밴드를 PVDF에서 잘라내어 메탄올로 5회, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 등급의 물로 1회 세척하였다. 막 조각을 500μl의 0.3M NaOAc(pH 4.0) 완충액과 500μl의 새로 용해한 1M 아질산나트륨 혼합물과 함께 37°C에서 3시간 동안 배양하여 Gas1-GFP에서 지질 분획을 분리하고 글루코사민과 이노시톨 사이에서 이노신 인산 세라마이드를 방출시켰다(51). 그 후, 막 스트립을 LC-MS 등급의 물로 네 번 세척하고 실온에서 건조시킨 다음 분석 전까지 -80°C의 질소 분위기에서 보관했습니다. 대조군으로는 각 실험에 PVDF 막의 공시료를 사용했습니다. Gas1-GFP에서 추출한 지질은 앞서 설명한 방법(50)에 따라 MS로 분석했습니다. 간단히 말하면, GPI-지질을 함유한 PVDF 스트립을 75μl의 음이온 몰드 용매[클로로포름/메탄올(1:2) + 5mM 아세트산암모늄]에 재현탁시키고 스핑고지질 종의 전기분무 이온화(ESI)-MRM/MS 분석(TSQ Vantage)을 수행했습니다. 이 경우 MS 데이터는 음이온 모드에서 얻었습니다.
앞서 언급했듯이 GPI 앵커의 지질 부분은 [3H]-이노시톨로 표지된 GPI-AP(16)로부터 분리되었습니다. 지질은 용매 시스템(55:45:10 클로로포름-메탄올-0.25% KCl)을 사용한 박막 크로마토그래피로 분리되었고 FLA-7000(Fujifilm)을 사용하여 시각화되었습니다.
Gas1-GFP를 발현하는 세포(600×10⁷개)를 TNE 완충액으로 두 번 세척하고, 유리 비드를 이용하여 파쇄한 후 원심분리하여 세포 파편과 유리 비드를 제거하였다. 상층액을 4°C에서 1시간 동안 17,000g로 원심분리하였다. 침전물을 TNE로 세척하고 0.2% 디기탈리스 사포닌을 함유한 TNE 용액에서 1U PI-PLC(Invitrogen)와 함께 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소 처리 후, 4°C에서 1시간 동안 17,000g로 원심분리하여 막을 분리하였다. Gas1-GFP를 면역침전시키기 위해 상층액을 GFP-Trap_A(ChromoTek)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. SDS-PAGE로 분리한 정제된 Gas1-GFP는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. Gas1-GFP 염색 밴드를 수로 주변의 회색 부분에서 잘라낸 후, 아이오도아세트아미드로 알킬화하고 디티오트레이톨로 환원시킨 다음, 겔 내 트립신 소화를 수행했습니다. 트립신 펩타이드와 GPI-글리칸을 포함하는 펩타이드를 추출하고 건조했습니다. 건조된 펩타이드를 물 20μl에 용해시켰습니다. 이 용액의 일부(8μl)를 액체 크로마토그래피(LC)에 주입했습니다. 옥타데실실란(ODS) 컬럼(Develosil 300ODS-HG-5; 내경 150mm×1.0mm; 노무라 화학, 아이치현, 일본)을 사용하여 특정 기울기 조건에서 펩타이드를 분리했습니다. 이동상은 용매 A(0.08% 포름산)와 용매 B(80% 아세토니트릴에 0.15% 포름산)입니다. Accela HPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, 보스턴, 매사추세츠)을 사용하여 용매 A로 컬럼을 55분 동안, 유속 50 μl min⁻¹로 5분간 용출한 후, 용매 B의 농도를 40%로 증가시켰다(미국). 용출액을 ESI 이온 소스로 연속적으로 주입하고, 트립신 펩타이드와 GPI-글리칸을 포함하는 펩타이드를 LTQ Orbitrap XL(하이브리드 선형 이온 트랩-오비트랩 질량 분석기; Thermo Fisher Scientific)로 분석하였다. MS 설정에서 모세관 소스의 전압은 4.5 kV로, 전달 모세관의 온도는 300°C로 설정하였다. 모세관 전압과 튜브 렌즈 전압은 각각 15 V와 50 V로 설정하였다. MS 데이터는 양이온 모드(분해능 60,000, 질량 정확도 10ppm)에서 질량 범위 300/m/z(질량 대 전하비(m/z) 3000)에서 얻었습니다. MS/MS 데이터는 LTQ Orbitrap XL의 이온 트랩을 통해 얻었습니다[데이터의 앞 세 자리는 충돌 유도 분해(CID)를 나타냅니다].
MD 시뮬레이션은 GROMACS(52) 소프트웨어와 MARTINI 2 힘장(53-55)을 사용하여 수행되었습니다. 그런 다음 CHARMM GUI Membrane Builder(56, 57)를 사용하여 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)과 Cer C18 또는 DOPC와 Cer C26을 포함하는 이중층을 구성했습니다. Cer C26의 토폴로지와 좌표는 스핑고신 꼬리에서 추가 비드를 제거하여 DXCE에서 얻었습니다. 아래에 설명된 과정을 사용하여 이중층의 균형을 맞추고 실행한 다음, 시스템의 마지막 좌표를 사용하여 Emp24를 포함하는 시스템을 구축했습니다. 효모 Emp24의 막횡단 도메인(173~193번 잔기)은 VMD(Visual MD) 도구 분자 구조(58)를 사용하여 α-나선으로 구성되었습니다. 그런 다음 겹치는 지질을 제거한 후, 단백질을 거칠게 과립화하고 CHARMM GUI를 사용하여 이중층에 삽입했습니다. 최종 시스템은 DOPC 1202개와 Cer C26 302개 또는 DOPC 1197개와 Cer C18 및 Emp24 295개를 포함합니다. 시스템을 0.150M 농도로 이온화합니다. 두 가지 이중층 조성에 대해 각각 4개의 독립적인 반복 실험을 수행했습니다.
지질 이중층은 CHARMM GUI 프로세스를 사용하여 평형화됩니다. 이 프로세스는 405,000단계에 걸쳐 최소화 및 평형화를 수행하며, 위치 제약 조건은 점진적으로 감소 및 제거되고 시간 단계는 0.005ps에서 0.02ps로 증가합니다. 평형화 후, 0.02ps의 시간 단계로 6µs의 결과가 생성됩니다. Emp24를 삽입한 후, 동일한 CHARMM GUI 프로세스를 사용하여 시스템을 최소화 및 평형화하고, 프로덕션 환경에서 8초 동안 실행합니다.
모든 시스템에서 평형 과정 중에는 Berendsen 바로스타트(59)로 압력을 제어하고, 생산 과정 중에는 Parrinello-Rahman 바로스타트(60)로 압력을 제어합니다. 모든 경우에 평균 압력은 1 bar이며, 반등방성 압력 결합 방식이 사용됩니다. 평형 및 생산 과정에서는 속도 재보정 기능이 있는 온도 조절기(61)를 사용하여 단백질, 지질 및 용매 입자의 온도를 각각 결합합니다. 전체 작동 과정에서 목표 온도는 310K입니다. 비결합 상호작용은 0.005 버퍼 허용 오차를 갖는 Verlet 방식을 사용하여 페어링 목록을 생성함으로써 계산됩니다. 쿨롱 항은 반응장과 1.1 nm의 차단 거리를 사용하여 계산됩니다. 반데르발스 항은 1.1 nm의 차단 거리를 갖는 차단 방식을 사용하며, 전위 드리프트에는 Verlet 차단 방식이 사용됩니다(62).
VMD를 사용하여 DOPC 인산염 비드 또는 세라마이드 AM1 비드와 단백질 사이의 차단 파장은 0.7 nm이고, 단백질과 상호작용하는 지질의 수를 계산합니다. 다음 공식에 따라 (63)과 같이 고갈-농축(DE) 인자를 계산합니다. DE 인자 = (단백질 0.7의 총 지질량) / 단백질 0.7의 (총 지질 중 Cer의 양)
보고된 값은 평균값이며, 오차 막대는 SE의 4개 독립 측정값을 나타냅니다. DE 인자의 통계적 유의성은 t 검정[(평균DE-인자-1)/SE]을 통해 계산합니다. 단측 검정에서 P값을 계산합니다.
GROMACS 도구를 사용하여 추적 데이터의 마지막 250ns 동안 Emp24를 포함하는 시스템의 2차원 측면 밀도 맵을 계산했습니다. 세라마이드 농축/결핍 맵을 얻기 위해 세라마이드 밀도 맵을 세라마이드와 DOPC 맵의 합으로 나누고, 다시 체내 세라마이드 농도로 나누었습니다. 동일한 색상 맵 스케일을 사용했습니다.
본 논문의 추가 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 에서 확인하실 수 있습니다.
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3D 고해상도 실시간 이미징을 통해 선택적 출력 부위에서 단백질 분류에 있어 세라마이드 사슬 길이의 중요성이 밝혀졌습니다.
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