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황화수소(H2S)는 인체에 ​​다양한 생리적 및 병리학적 영향을 미칩니다. 황화수소나트륨(NaHS)은 생물학 실험에서 H2S의 영향을 평가하는 데 널리 사용되는 약리학적 도구입니다. NaHS 용액에서 H2S가 사라지는 데는 몇 분밖에 걸리지 않지만, 일부 동물 연구에서는 음용수에 H2S를 공급하는 물질로 NaHS 용액을 사용해 왔습니다. 본 연구에서는 일부 연구자들이 제안한 바와 같이, 쥐/생쥐용 물통에 30μM 농도의 NaHS를 첨가하여 제조한 음용수가 최소 12~24시간 동안 안정적으로 유지될 수 있는지 조사했습니다. 음용수에 30μM의 NaHS 용액을 제조한 후 즉시 쥐/생쥐용 물통에 부었습니다. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24시간 간격으로 물통 입구와 내부에서 시료를 채취하여 메틸렌 블루법으로 황화물 함량을 측정했습니다. 또한, 수컷 및 암컷 쥐에게 2주 동안 NaHS(30 μM)를 주사하고, 첫째 주에는 이틀에 한 번씩, 둘째 주 말에는 혈청 황화물 농도를 측정했습니다. 물병 끝에서 채취한 시료의 NaHS 용액은 불안정하여 12시간 후 72%, 24시간 후 75% 감소했습니다. 물병 내부에서 채취한 시료의 경우, 2시간 이내에는 NaHS 농도 감소가 미미했지만, 12시간 후에는 47%, 24시간 후에는 72% 감소했습니다. NaHS 주사는 수컷 및 암컷 쥐의 혈청 황화물 수치에 영향을 미치지 않았습니다. 결론적으로, 음용수로 제조한 NaHS 용액은 불안정하기 때문에 H2S 기증에 사용해서는 안 됩니다. 이러한 투여 경로는 동물에게 불규칙적이고 예상보다 적은 양의 NaHS를 노출시킬 수 있습니다.
황화수소(H2S)는 1700년대부터 독성 물질로 사용되어 왔지만, 1996년 아베와 키무라에 의해 내인성 생체 신호 전달 분자로서의 역할이 제시되었습니다. 지난 30년 동안 다양한 인체 시스템에서 H2S의 수많은 기능이 밝혀지면서, H2S 공여 분자가 특정 질병의 치료 또는 관리에 임상적으로 적용될 수 있다는 가능성이 대두되었습니다. (최근 연구 논문은 치리노 외 연구진의 리뷰를 참조하십시오.)
황화수소나트륨(NaHS)은 많은 세포 배양 및 동물 연구에서 H2S의 영향을 평가하는 약리학적 도구로 널리 사용되어 왔습니다.5,6,7,8 그러나 NaHS는 용액에서 H2S/HS-로 빠르게 전환되고, 폴리황화물로 쉽게 오염되며, 산화 및 휘발되기 쉽기 때문에 이상적인 H2S 공여체가 아닙니다.4,9 많은 생물학적 실험에서 NaHS는 물에 용해되는데, 이로 인해 H2S의 수동적 휘발 및 손실10,11,12, H2S의 자발적 산화11,12,13 및 광분해14가 발생합니다. 원래 용액의 황화물은 H2S의 휘발로 인해 매우 빠르게 손실됩니다.11 개방 용기에서 H2S의 반감기(t1/2)는 약 5분이며, 농도는 분당 약 13%씩 감소합니다.10 NaHS 용액에서 황화수소가 사라지는 데는 몇 분밖에 걸리지 않지만, 일부 동물 연구에서는 1~21주 동안 음용수에 NaHS 용액을 황화수소 공급원으로 사용하고 12~24시간마다 NaHS 용액을 교체했습니다.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 이러한 방식은 약물 투여량은 다른 종, 특히 인간에서의 사용량을 기준으로 해야 한다는 과학적 연구 원칙에 부합하지 않습니다.27
생의학 분야의 전임상 연구는 환자 치료의 질이나 치료 결과를 개선하는 것을 목표로 합니다. 그러나 대부분의 동물 연구 결과는 아직 인간에게 적용되지 못하고 있습니다.28,29,30 이러한 적용 실패의 한 가지 이유는 동물 연구의 방법론적 질에 대한 관심 부족입니다.30 따라서 본 연구는 쥐/생쥐용 물병에 제조한 30μM NaHS 용액이 일부 연구에서 주장되거나 제안된 바와 같이 음용수에서 12~24시간 동안 안정적으로 유지되는지 여부를 조사하는 것을 목표로 했습니다.
본 연구의 모든 실험은 이란의 실험동물 관리 및 사용에 관한 공표된 지침31에 따라 수행되었습니다. 또한 본 연구의 모든 실험 보고서는 ARRIVE 가이드라인32을 준수했습니다. 샤히드 베헤슈티 의과대학 내분비과학연구소 윤리위원회는 본 연구의 모든 실험 절차를 승인했습니다.
아세트산아연 이수화물(CAS: 5970-45-6)과 무수 염화제2철(CAS: 7705-08-0)은 Biochem, Chemopahrama(프랑스 코스네쉬르루아르)에서 구입했습니다. 황화수소나트륨 수화물(CAS: 207683-19-0)과 N,N-디메틸-p-페닐렌디아민(DMPD)(CAS: 535-47-0)은 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다. 이소플루란은 Piramal(미국 펜실베이니아주 베들레헴)에서 구입했습니다. 염산(HCl)은 Merck(독일 다름슈타트)에서 구입했습니다.
NaHS(30 μM) 용액을 음용수에 제조하여 즉시 쥐/생쥐용 물병에 부어줍니다. 이 농도는 NaHS를 H2S 공급원으로 사용한 여러 연구 논문을 참고하여 선택했습니다(토론 부분 참조). NaHS는 다양한 양의 수화수(즉, NaHS•xH2O)를 함유할 수 있는 수화 분자입니다. 제조사에 따르면 본 연구에 사용된 NaHS의 함량은 70.7%(즉, NaHS•1.3 H2O)였으며, 우리는 이 값을 계산에 반영했습니다. 계산에는 무수 NaHS의 분자량인 56.06 g/mol을 사용했습니다. 수화수(결정수라고도 함)는 결정 구조를 구성하는 물 분자입니다.33 수화물은 무수물과 비교하여 물리적 및 열역학적 특성이 다릅니다.34
음용수에 NaHS를 첨가하기 전에 용액의 pH와 온도를 측정하십시오. NaHS 용액을 즉시 동물 사육장의 쥐/생쥐용 물병에 부으십시오. 황화물 함량을 측정하기 위해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24시간 간격으로 물병 끝부분과 내부에서 시료를 채취했습니다. 황화물 측정은 각 시료 채취 직후에 실시했습니다. 물관 끝부분에서 시료를 채취한 이유는 일부 연구에서 물관의 작은 기공 크기가 H2S 증발을 최소화할 수 있다는 결과가 나왔기 때문입니다.15,19 이러한 점은 물병 내부의 용액에도 적용되는 것으로 보입니다. 그러나 물병 목 부분의 용액은 증발 속도가 더 빠르고 자동 산화가 일어났으며, 실제로 동물들이 이 물을 먼저 마셨습니다.
본 연구에는 수컷 및 암컷 위스타 쥐를 사용했습니다. 쥐는 표준 조건(온도 21~26°C, 습도 32~40%)에서 폴리프로필렌 케이지(케이지당 2~3마리)에 사육했으며, 12시간 조명(오전 7시~오후 7시)과 12시간 암흑(오후 7시~오전 7시)을 유지했습니다. 쥐들은 수돗물을 자유롭게 섭취할 수 있었고, 표준 사료(Khorak Dam Pars Company, 테헤란, 이란)를 급여했습니다. 연령이 같은(6개월) 암컷(n=10, 체중: 190~230g)과 수컷(n=10, 체중: 320~370g) 위스타 쥐를 무작위로 대조군과 NaHS(30μM) 처리군(각 군당 n=5)으로 나누었습니다. 표본 크기를 결정하기 위해 이전 경험과 검정력 분석을 결합한 KISS(Keep It Simple, Stupid) 방법을 사용했습니다.35 먼저 3마리의 쥐를 대상으로 예비 연구를 수행하여 혈청 총 황화물 농도의 평균값과 표준편차(8.1 ± 0.81 μM)를 측정했습니다. 그런 다음, 검정력 80%와 양측 유의수준 5%를 고려하여, Festing이 실험동물 표본 크기 계산에 대해 제시한 값35을 기준으로 표준화된 효과 크기 2.02에 해당하는 예비 표본 크기(기존 문헌을 참고하여 n = 5)를 결정했습니다. 이 값에 표준편차(2.02 × 0.81)를 곱하면 예측되는 검출 가능 효과 크기(1.6 μM)는 20%로, 이는 허용 가능한 수준입니다. 즉, 각 그룹당 n = 5인 표본 크기는 그룹 간 평균 변화 20%를 감지하기에 충분합니다. 쥐는 Excel 소프트웨어의 무작위 배정 기능36을 이용하여 대조군과 NaSH 처리군으로 무작위로 배정했습니다(보충 그림 1). 결과 변수에 대해서는 맹검법을 적용하여 생화학적 측정을 수행하는 연구자는 그룹 배정을 알지 못하도록 했습니다.
암수 모두의 NaHS 투여군은 2주 동안 음용수에 30μM NaHS 용액을 첨가하여 투여받았습니다. 24시간마다 새로운 용액을 공급했으며, 이 기간 동안 체중을 측정했습니다. 1주차와 2주차 말에 이소플루란 마취 하에 모든 쥐의 꼬리 끝에서 이틀에 한 번씩 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액 샘플은 3000g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 –80°C에서 보관하여 혈청 요소, 크레아티닌(Cr) 및 총 황화물을 측정했습니다. 혈청 요소는 효소적 우레아제법으로, 혈청 크레아티닌은 시판되는 키트(Man Company, Tehran, Iran)와 자동 분석기(Selectra E, 일련번호 0-2124, The Netherlands)를 사용하여 광도 측정 Jaffe법으로 측정했습니다. 요소와 크레아티닌의 검사 내 및 검사 간 변동 계수는 2.5% 미만이었습니다.
메틸렌 블루(MB)법은 음용수 및 NaHS를 함유한 혈청에서 총 황화물을 측정하는 데 사용됩니다. MB법은 대량 용액 및 생체 시료에서 황화물을 측정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다.11,37 MB법은 총 황화물 풀을 추정하고38 수용액상에서 H2S, HS-, S2 형태의 무기 황화물을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.39 이 방법에서 황은 아세트산아연 존재 하에 황화아연(ZnS)으로 침전됩니다.11,38 아세트산아연 침전은 황화물을 다른 발색단으로부터 분리하는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다.11 ZnS는 강산성 조건에서 HCl11을 사용하여 재용해됩니다. 황화물은 염화제2철(Fe3+는 산화제로 작용)에 의해 촉매되는 반응에서 DMPD와 1:2의 화학량론적 비율로 반응하여 염료 MB를 생성하며, 이는 670 nm에서 분광광도법으로 검출됩니다.40,41 MB 방법의 검출 한계는 약 1 μM입니다.
본 연구에서는 각 시료(용액 또는 혈청) 100 μL를 튜브에 넣고, 이어서 아세트산아연(증류수 1% w/v) 200 μL, DMPD(7.2 M HCl 용액 20 mM) 100 μL, 그리고 FeCl3(1.2 M HCl 용액 30 mM) 133 μL를 첨가하였다. 혼합물을 37°C에서 암실에 30분간 배양하였다. 용액을 10,000 g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA)를 이용하여 670 nm에서 측정하였다. 황화물 농도는 증류수(ddH2O)에 용해된 NaHS(0–100 μM)의 검량곡선을 이용하여 결정하였다(보충 그림 2). 측정에 사용된 모든 용액은 사용 직전에 새로 제조하였다. 황화물 측정에 대한 검사 내 변동 계수와 검사 간 변동 계수는 각각 2.8%와 3.4%였습니다. 또한, 강화 시료법42을 이용하여 티오황산나트륨이 함유된 음용수 및 혈청 시료에서 회수된 총 황화물량을 측정했습니다. 티오황산나트륨이 함유된 음용수 및 혈청 시료의 회수율은 각각 91 ± 1.1% (n = 6) 및 93 ± 2.4% (n = 6)였습니다.
통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 8.0.2(Windows용, GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com)를 사용하여 수행했습니다. NaHS 첨가 전후의 음용수 온도와 pH를 비교하기 위해 대응표본 t-검정을 사용했습니다. NaHS 함유 용액에서 H2S 손실량은 기준 흡수량 대비 백분율 감소로 계산했으며, 손실량의 통계적 유의성을 평가하기 위해 일원 반복 측정 분산 분석(ANOVA) 후 Dunnett의 다중 비교 검정을 수행했습니다. 체중, 혈청 요소, 혈청 크레아티닌 및 총 혈청 황화물의 시간 경과에 따른 변화는 성별이 다른 NaHS 처리군 쥐 간에 이원 혼합 분산 분석(ANOVA) 후 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 비교했습니다. 양측 P값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주했습니다.
음용수의 pH는 NaHS 첨가 전 7.60 ± 0.01이었고, 첨가 후에는 7.71 ± 0.03이었다(n = 13, p = 0.0029). 음용수의 온도는 첨가 전 26.5 ± 0.2°C였고, 첨가 후에도 26.2 ± 0.2°C로 감소했다(n = 13, p = 0.0128). 음용수에 30 μM NaHS 용액을 제조하여 물병에 보관하였다. NaHS 용액은 불안정하여 시간이 지남에 따라 농도가 감소한다. 물병 입구에서 시료를 채취하여 분석한 결과, 첫 1시간 이내에 68.0%의 유의미한 감소가 관찰되었고, 12시간 후에는 72%, 24시간 후에는 75% 감소하였다. 물병에서 채취한 시료의 경우, 2시간까지는 NaHS 농도 감소가 유의미하지 않았지만, 12시간 후에는 47%, 24시간 후에는 72% 감소하였다. 이 데이터는 음용수에 제조한 30μM 용액에서 NaHS의 비율이 샘플링 위치에 관계없이 24시간 후 초기 값의 약 4분의 1로 감소했음을 나타냅니다(그림 1).
쥐/생쥐용 물병에 담긴 음용수 내 NaHS 용액(30 μM)의 안정성. 용액 제조 후, 물병 입구와 내부에서 시료를 채취하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 6/그룹)로 제시하였다. * 및 #는 시간 0과 비교하여 P < 0.05임을 나타낸다. 물병 사진은 입구(개구부 포함)와 병 본체를 보여준다. 입구의 부피는 약 740 μL이다.
새로 제조한 30 μM 용액의 NaHS 농도는 30.3 ± 0.4 μM(범위: 28.7–31.9 μM, n = 12)이었다. 그러나 24시간 후 NaHS 농도는 더 낮은 값(평균: 3.0 ± 0.6 μM)으로 감소했다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 연구 기간 동안 쥐가 노출된 NaHS 농도는 일정하지 않았다.
암컷 쥐의 체중은 시간이 지남에 따라 유의하게 증가했습니다(대조군: 205.2 ± 5.2 g에서 213.8 ± 7.0 g으로, NaHS 처리군: 204.0 ± 8.6 g에서 211.8 ± 7.5 g으로). 그러나 NaHS 처리는 체중에 영향을 미치지 않았습니다(그림 3). 수컷 쥐의 체중 또한 시간이 지남에 따라 유의하게 증가했습니다(대조군: 338.6 ± 8.3 g에서 352.4 ± 6.0 g으로, NaHS 처리군: 352.4 ± 5.9 g에서 363.2 ± 4.3 g으로). 그러나 NaHS 처리는 체중에 영향을 미치지 않았습니다(그림 3).
NaHS(30 μM) 투여 후 암컷 및 수컷 쥐의 체중 변화. 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시되었으며, 본페로니 사후 검정을 포함한 이원 혼합 분산 분석(그룹 내-그룹 간)을 사용하여 비교하였다. 각 그룹의 암수 각 5마리이다.
연구 기간 동안 대조군과 NaSH 처리군 쥐의 혈청 요소 및 크레아틴 인산염 농도는 유사했습니다. 또한, NaSH 처리는 혈청 요소 및 크레아틴크롬 농도에 영향을 미치지 않았습니다(표 1).
대조군과 NaHS 처리군의 수컷(8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM) 및 암컷(9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM) 쥐의 기저 혈청 총 황화물 농도는 유사했습니다. 14일 동안의 NaHS 투여는 수컷과 암컷 쥐 모두에서 혈청 총 황화물 수치에 영향을 미치지 않았습니다(그림 4).
NaHS(30 μM) 투여 후 수컷 및 암컷 쥐의 혈청 총 황화물 농도 변화. 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시되었으며, 본페로니 사후 검정을 포함한 이원 혼합 분산 분석(그룹 내 분석)을 사용하여 비교하였다. 각 성별, n = 5/그룹.
본 연구의 주요 결론은 NaHS를 함유한 음용수가 불안정하다는 것입니다. 쥐/생쥐용 물병의 입구와 내부에서 시료를 채취한 후 24시간이 지나도 초기 총 황화물 함량의 약 4분의 1만이 검출되었습니다. 또한, NaHS 용액에서 H2S가 손실되어 쥐는 불안정한 NaHS 농도에 노출되었지만, 음용수에 NaHS를 첨가해도 체중, 혈청 요소 및 크레아틴 크롬, 총 혈청 황화물 수치에는 영향을 미치지 않았습니다.
본 연구에서 음용수에 제조한 30 μM NaHS 용액의 H2S 손실률은 시간당 약 3%였습니다. 완충 용액(10 mM PBS에 100 μM 황화나트륨, pH 7.4)에서는 황화물 농도가 8시간 동안 7% 감소하는 것으로 보고되었습니다.¹¹ 우리는 이전에 음용수에 제조한 54 μM NaHS 용액의 황화물 손실률이 시간당 약 2.3%(제조 후 처음 12시간 동안은 시간당 4%, 마지막 12시간 동안은 시간당 1.4%)임을 보고하여 NaHS의 복강 내 투여를 지지한 바 있습니다.⁸ 이전 연구⁴³에서는 NaHS 용액에서 H2S가 지속적으로 손실되며, 이는 주로 휘발과 산화 때문인 것으로 나타났습니다. 기포를 첨가하지 않더라도 원액 내 황화물은 H2S 휘발로 인해 빠르게 손실됩니다.¹¹ 연구에 따르면 약 30~60초가 소요되는 희석 과정에서 H2S의 약 5~10%가 증발로 인해 손실되는 것으로 나타났습니다.6 용액에서 H2S의 증발을 방지하기 위해 연구자들은 용액을 부드럽게 저어주는 것,12 원액을 플라스틱 필름으로 덮는 것,6 그리고 H2S 증발 속도가 공기-액체 계면에 따라 달라지므로 용액의 공기 노출을 최소화하는 것 등 여러 가지 조치를 취해 왔습니다.13 H2S의 자발적 산화는 주로 전이 금속 이온, 특히 물에 불순물로 존재하는 3가 철에 의해 발생합니다.13 H2S의 산화는 폴리황화물(공유 결합으로 연결된 황 원자)의 형성을 초래합니다.11 H2S의 산화를 방지하기 위해 탈산소 용매44,45에 H2S를 함유한 용액을 제조한 후 아르곤 또는 질소로 20~30분 동안 퍼징하여 탈산소화를 보장합니다.11,12,37,44,45,46 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)은 호기성 용액에서 HS-의 자동 산화를 방지하는 금속 킬레이트제(10–4 M)입니다. DTPA가 없을 경우 HS-의 자동 산화 속도는 25°C에서 약 3시간 동안 약 50%입니다.37,47 또한, 1e-황화물의 산화는 자외선에 의해 촉매되므로 용액은 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호해야 합니다.11
그림 5에서 볼 수 있듯이, NaHS는 물에 용해될 때 Na+와 HS-6로 해리됩니다. 이 해리는 반응의 pK1에 의해 결정되며, 이 pK1은 온도에 따라 달라집니다. pK1 = 3.122 + 1132/T이며, 여기서 T는 5~30°C 범위이고 켈빈(K) 단위로 측정됩니다. K = °C + 273.1548입니다. HS-는 높은 pK2 값(pK2 = 19)을 가지므로 pH < 96.49에서는 S2-가 생성되지 않거나 매우 소량만 생성됩니다. 반대로, HS-는 염기로 작용하여 H2O 분자로부터 H+를 받아들이고, H2O는 산으로 작용하여 H2S와 OH-로 전환됩니다.
NaHS 용액(30 µM)에서 용해된 H2S 기체의 생성. aq: 수용액; g: 기체; l: 액체. 모든 계산은 물의 pH = 7.0, 물의 온도 = 20 °C를 가정합니다. BioRender.com으로 제작되었습니다.
NaHS 용액이 불안정하다는 증거에도 불구하고, 여러 동물 연구에서 음용수에 H2S 공여체 화합물로 NaHS 용액을 사용했으며, 그 기간은 1주에서 21주까지 다양했습니다(표 2).15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 이 연구들에서 NaHS 용액은 12시간, 15시간, 17시간, 18시간, 24시간, 25시간 또는 24시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간마다 교체되었습니다. 연구 결과, NaHS 용액에서 H2S가 손실되어 쥐의 약물 농도가 불안정해졌으며, 쥐의 음용수 내 NaHS 함량은 12시간 또는 24시간 동안 크게 변동했습니다(그림 2 참조). 이 연구들 중 두 연구에서는 물 속 H2S 농도가 24시간 동안 안정적으로 유지되었다고 보고했거나22, 12시간 동안 2~3%의 H2S 손실만 관찰되었다고 보고했지만15, 이를 뒷받침하는 데이터나 측정 세부 정보는 제공하지 않았습니다. 두 연구에서는 물병의 직경이 작을수록 H2S 증발을 최소화할 수 있다고 밝혔습니다15,19. 그러나 본 연구 결과는 물병에서 H2S 손실을 12~24시간이 아닌 2시간 정도만 지연시킬 수 있음을 보여주었습니다. 두 연구 모두 물의 색 변화가 관찰되지 않았기 때문에 음용수 내 NaHS 농도가 변하지 않았다고 가정했으며, 따라서 공기에 의한 H2S 산화는 중요하지 않았다고 지적했습니다19,20. 놀랍게도, 이 주관적인 방법은 시간에 따른 농도 변화를 측정하는 것이 아니라 물 속 NaHS의 안정성을 평가하는 것입니다.
NaHS 용액에서 H2S 손실은 pH와 온도에 따라 달라집니다. 본 연구에서 언급했듯이, NaHS를 물에 용해시키면 알칼리성 용액이 생성됩니다.50 NaHS를 물에 용해시켰을 때 용존 H2S 가스의 생성량은 pH 값에 따라 달라집니다.6 용액의 pH가 낮을수록 H2S 가스 분자 형태로 존재하는 NaHS의 비율이 높아지고 수용액에서 황화물이 더 많이 손실됩니다.11 그러나 이러한 연구들 중 어느 것도 NaHS 용해에 사용된 음용수의 pH를 보고하지 않았습니다. 대부분의 국가에서 채택하고 있는 WHO 권고에 따르면 음용수의 pH는 6.5~8.5 범위여야 합니다.51 이 pH 범위에서 H2S의 자연 산화 속도는 약 10배 증가합니다.13 이 pH 범위의 물에 NaHS를 용해시키면 용존 H2S 가스 농도가 1~22.5 μM이 되므로 NaHS를 용해시키기 전에 물의 pH를 측정하는 것이 중요합니다. 또한, 위 연구에서 보고된 온도 범위(18~26°C)에서는 용액 내 용존 H2S 가스 농도가 약 10% 정도 변화하는데, 이는 온도 변화가 pK1 값을 변화시키고, pK1 값의 작은 변화도 용존 H2S 가스 농도에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문이다.48 게다가, 일부 연구의 경우 연구 기간이 5개월로 길어 온도 변화가 큰 것이 이 문제를 더욱 악화시킨다.22
한 연구(21)를 제외한 모든 연구에서는 음용수에 30μM NaHS 용액을 사용했습니다. 사용된 용량(즉, 30μM)에 대해 일부 연구자들은 수용액 상태의 NaHS가 정확히 동일한 농도의 H2S 가스를 생성하며, H2S의 생리적 범위는 10~100μM이므로 이 용량이 생리적 범위 내에 있다고 지적했습니다(15,16). 다른 연구자들은 30μM NaHS가 혈장 H2S 수준을 생리적 범위(5~300μM) 내로 유지할 수 있다고 설명했습니다(19,20). 본 연구에서는 H2S의 영향을 연구하기 위해 일부 연구에서 사용된 30μM의 NaHS 수용액 농도(pH = 7.0, T = 20°C)를 고려했습니다. 이를 통해 용해된 H2S 가스의 농도는 14.7μM로 계산되며, 이는 초기 NaHS 농도의 약 50%에 해당합니다. 이 값은 동일한 조건에서 다른 연구자들이 계산한 값과 유사합니다(13,48).
본 연구에서 NaSH 투여는 체중에 변화를 주지 않았으며, 이는 수컷 마우스22,23 및 수컷 쥐18을 대상으로 한 다른 연구 결과와 일치합니다. 그러나 두 연구에서는 NaSH가 신장 절제술을 시행한 쥐의 감소된 체중을 회복시켰다고 보고한 반면24,26, 다른 연구에서는 NaSH 투여가 체중에 미치는 영향을 보고하지 않았습니다15,16,17,19,20,21,25. 또한, 본 연구에서 NaSH 투여는 혈청 요소 및 크레아틴 크롬 수치에 영향을 미치지 않았으며, 이는 다른 연구 결과25와 일치합니다.
본 연구에서는 음용수에 NaHS를 2주 동안 첨가해도 수컷 및 암컷 쥐의 총 혈청 황화물 농도에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 Sen 등(16)의 연구 결과와 일치합니다. Sen 등은 음용수에 30μM NaHS를 8주 동안 투여했을 때 대조군 쥐의 혈장 황화물 수치에는 변화가 없었지만, 신장 절제술을 시행한 쥐에서는 감소된 혈장 H2S 수치가 회복되었다고 보고했습니다. Li 등(22) 또한 음용수에 30μM NaHS를 5개월 동안 투여했을 때 노령 쥐의 혈장 유리 황화물 수치가 약 26% 증가했다고 보고했습니다. 다른 연구에서는 음용수에 NaHS를 첨가한 후 혈중 황화물 농도의 변화를 보고하지 않았습니다.
7개의 연구에서는 Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23를 사용했다고 보고했지만 수화수에 대한 자세한 정보는 제공하지 않았으며, 5개의 연구에서는 제조 방법에 사용된 NaHS의 출처를 언급하지 않았습니다17,18,24,25,26. NaHS는 수화된 분자이며 수화수 함량이 다양할 수 있으므로 특정 몰 농도의 용액을 제조하는 데 필요한 NaHS의 양에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 본 연구에서 사용된 NaHS는 NaHS•1.3 H2O였습니다. 따라서 이러한 연구에서 실제 NaHS 농도는 보고된 농도보다 낮을 수 있습니다.
Pozgay 등21은 쥐의 대장염에 대한 NaHS의 효과를 평가하면서 "어떻게 이렇게 수명이 짧은 화합물이 그토록 오래 지속되는 효과를 나타낼 수 있을까?"라는 질문을 던졌습니다. 그들은 향후 연구를 통해 이 질문에 대한 답을 찾을 수 있기를 바라며, NaHS 용액에는 NaHS의 효과를 매개하는 H2S와 이황화물 외에도 더 안정적인 폴리황화물이 함유되어 있을 가능성을 추측했습니다21. 또 다른 가능성은 용액에 매우 낮은 농도로 남아 있는 NaHS 또한 유익한 효과를 나타낼 수 있다는 것입니다. 실제로 Olson 등은 혈액 내 마이크로몰 농도의 H2S는 생리적이지 않으며 나노몰 농도 범위이거나 아예 없어야 한다는 증거를 제시했습니다13. H2S는 단백질 황산화라는 가역적인 번역 후 변형을 통해 작용할 수 있으며, 이는 많은 단백질의 기능, 안정성 및 위치에 영향을 미칩니다52,53,54. 실제로 생리적 조건에서 많은 간 단백질의 약 10%~25%가 황산화됩니다53. 두 연구 모두 NaHS19,23의 빠른 분해를 인정하지만 놀랍게도 "우리는 매일 NaHS를 교체하여 음용수 내 NaHS 농도를 조절했다"고 명시하고 있다.23 한 연구에서는 "NaHS는 표준 H2S 공여체이며 임상에서 H2S 자체를 대체하기 위해 흔히 사용된다"고 실수로 언급했다.18
위의 논의는 NaHS가 휘발, 산화 및 광분해를 통해 용액에서 손실됨을 보여주며, 따라서 용액으로부터 H2S 손실을 줄이기 위한 몇 가지 제안이 제시됩니다. 첫째, H2S의 증발은 기체-액체 계면¹³ 및 용액의 pH¹¹에 따라 달라지므로, 증발 손실을 최소화하기 위해 이전에 설명한 바와 같이¹⁵,¹⁹ 물병의 목 부분을 가능한 한 작게 만들고, 물의 pH를 허용 가능한 상한(즉, 6.5~8.5⁵¹)으로 조정하여 증발 손실을 최소화할 수 있습니다¹¹. 둘째, H2S는 산소의 영향과 음용수에 존재하는 전이 금속 이온으로 인해 자발적으로 산화되므로¹³ 아르곤 또는 질소를 이용한 음용수 탈산소화⁴⁴⁵ 및 금속 킬레이트제³⁷,⁴⁷ 사용은 황화물의 산화를 줄일 수 있습니다. 셋째, H2S의 광분해를 방지하기 위해 물병을 알루미늄 호일로 감쌀 수 있습니다. 이러한 방법은 스트렙토조신55과 같은 광감성 물질에도 적용됩니다. 마지막으로, 무기 황화물(NaHS, Na2S 및 CaS)은 이전에 보고된 바와 같이 음용수에 용해하는 대신 위관영양법으로 투여할 수 있습니다56,57,58. 연구에 따르면 쥐에게 위관영양법으로 투여된 방사성 황화나트륨은 흡수가 잘 되고 거의 모든 조직에 분포되는 것으로 나타났습니다59. 현재까지 대부분의 연구에서는 무기 황화물을 복강 내 투여했지만, 이 경로는 임상 환경에서 거의 사용되지 않습니다60. 반면, 경구 투여는 사람에게 가장 흔하고 선호되는 투여 경로입니다61. 따라서 설치류에서 H2S 공여체의 효과를 경구 위관영양법으로 평가할 것을 권장합니다.
본 연구의 한계점은 수용액과 혈청 내 황화물을 MB법을 이용하여 측정했다는 점입니다. 황화물 측정 방법에는 요오드 적정법, 분광광도법, 전기화학적 방법(전위차법, 전류측정법, 전기량측정법, 전류측정법) 및 크로마토그래피(가스 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피) 등이 있으며, 그중 가장 일반적으로 사용되는 방법은 MB 분광광도법입니다.62 생체 시료에서 H2S를 측정하는 MB법의 한계점은 산성 조건에서 수행되기 때문에 모든 황 함유 화합물을 측정하고 유리 H2S는 측정하지 못한다는 것입니다.63 이는 생물학적 공급원으로부터 황이 추출되는 결과를 초래합니다.64 그러나 미국 공중보건협회에 따르면 MB법은 물 속 황화물 측정의 표준 방법입니다.65 따라서 이러한 한계점은 NaHS 함유 용액의 불안정성에 대한 본 연구의 주요 결과에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 본 연구에서 NaHS를 함유한 물 및 혈청 시료에서 황화물 측정 회수율은 각각 91%와 93%였습니다. 이러한 값들은 이전에 보고된 범위(77–92)66와 일치하며, 허용 가능한 분석 정밀도42를 나타냅니다. 전임상 연구에서 수컷만을 사용한 동물 연구에 지나치게 의존하는 것을 피하고67 가능한 한 수컷과 암컷 쥐를 모두 포함하기 위해68 미국 국립보건원(NIH) 지침에 따라 수컷과 암컷 쥐를 모두 사용했다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 이 점은 다른 연구자들69,70,71에 의해서도 강조되었습니다.
결론적으로, 본 연구 결과는 음용수로 제조한 NaHS 용액이 불안정하여 H2S를 생성하는 데 사용할 수 없음을 시사합니다. 이러한 투여 경로는 동물을 불안정하고 예상보다 낮은 농도의 NaHS에 노출시키므로, 본 연구 결과는 인체에 ​​적용하기 어려울 수 있습니다.
본 연구에서 사용 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청이 있을 경우 해당 저자에게서 제공받을 수 있습니다.
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