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윈난성에서 재배되는 약용 식물인 삼칠(Panax notoginseng)의 안전성은 카드뮴(Cd) 오염의 잠재적 위협에 직면해 있습니다. 본 연구에서는 외부에서 Cd를 공급하는 조건에서 석회 시비(0, 750, 2250 및 3750 kg/h/m2)와 옥살산 엽면 살포(0, 0.1 및 0.2 mol/L)가 삼칠의 Cd 축적 및 항산화, 전신 및 약효 성분에 미치는 영향을 알아보기 위해 포장 실험을 수행했습니다. 실험 결과, Cd 스트레스 조건에서 석회 시비와 옥살산 엽면 살포는 삼칠의 Ca2+ 함량을 증가시키고 Cd2+의 독성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 석회와 옥살산의 처리는 항산화 효소 활성을 증가시키고 삼투 조절 물질의 대사를 변화시켰으며, 특히 CAT 활성이 2.77배 증가한 것이 가장 유의미한 변화였습니다. 옥살산의 영향으로 SOD 활성은 1.78배 증가했으며, MDA 함량은 58.38% 감소했습니다. 가용성 당, 유리 아미노산, 프롤린 및 가용성 단백질 함량과 매우 유의미한 상관관계가 나타났습니다. 석회와 옥살산은 삼칠의 칼슘 이온(Ca2+) 함량을 증가시키고, 카드뮴(Cd) 함량을 감소시키며, 삼칠의 스트레스 저항성을 향상시키고, 총 사포닌 및 플라보노이드 생성을 증가시킵니다. Cd 함량은 대조군보다 68.57% 낮아 기준치(Cd≤0.5 mg kg-1, GB/T 19086-2008)에 부합합니다. SPN 함량은 7.73%로 모든 처리구 중 가장 높았으며, 플라보노이드 함량은 21.74% 유의미하게 증가하여 표준 의학적 값과 최적 수율을 달성했습니다.
카드뮴(Cd)은 경작지 토양의 흔한 오염물질로, 쉽게 이동하며 생물학적 독성이 매우 강합니다. El-Shafei 등은 카드뮴 독성이 재배 식물의 품질과 생산성에 영향을 미친다고 보고했습니다. 최근 중국 남서부 지역의 경작지 토양에서 카드뮴 농도가 과도하게 높아지는 문제가 심각해지고 있습니다. 윈난성은 중국의 생물다양성 보고로, 약용 식물 종 다양성이 전국 1위를 차지하고 있습니다. 그러나 윈난성은 광물 자원이 풍부하여 채굴 과정에서 토양 중금속 오염이 불가피하게 발생하며, 이는 지역 약용 식물 생산에 악영향을 미칩니다.
삼칠(Panax notoginseng (Burkill) Chen3)은 두릅나무과(Araliaceae) 삼칠속(Panax)에 속하는 매우 귀중한 다년생 초본 약용 식물입니다. 삼칠은 혈액 순환을 개선하고 어혈을 제거하며 통증을 완화하는 효능이 있습니다. 주요 생산지는 윈난성 원산현입니다5. 이 지역의 삼칠 재배지 토양의 75% 이상이 카드뮴에 오염되어 있으며, 지역에 따라 오염도가 81%에서 100% 이상에 이릅니다6. 카드뮴의 독성은 삼칠의 약효 성분, 특히 사포닌과 플라보노이드의 생성을 크게 저해합니다. 사포닌은 트리테르페노이드 또는 스피로스탄을 아글리콘으로 하는 글리코시드 화합물의 일종입니다. 많은 전통 중국 의약품의 주요 활성 성분이며, 일부 사포닌은 항균 작용이나 해열, 진정, 항암 효과와 같은 유익한 생물학적 활성을 나타냅니다7. 플라보노이드는 일반적으로 페놀성 하이드록실기를 가진 두 개의 벤젠 고리가 세 개의 중심 탄소 원자를 통해 연결된 화합물 계열을 지칭합니다. 주성분은 2-페닐크로마논 8입니다. 이는 식물에서 산소 자유 라디칼을 효과적으로 제거하는 강력한 항산화제입니다. 또한 염증성 생물 효소의 침투를 억제하고, 상처 치유 및 통증 완화를 촉진하며, 콜레스테롤 수치를 낮추는 효능도 있습니다. 플라보노이드는 삼칠의 주요 활성 성분 중 하나입니다. 삼칠 생산 지역의 토양 카드뮴 오염 문제를 시급히 해결하고 필수 약효 성분의 생산을 보장해야 할 필요성이 대두되고 있습니다.
석회는 카드뮴 오염으로부터 토양을 정화하는 데 널리 사용되는 부동화제 중 하나입니다.10 석회는 토양의 pH를 높이고 토양 양이온 교환 용량(CEC), 토양 염 포화도(BS), 토양 산화환원 전위(Eh)를 변화시켜 토양 내 카드뮴의 생체 이용률을 감소시킴으로써 토양 내 카드뮴의 흡착 및 침착에 영향을 미칩니다.3, 11 또한, 석회는 다량의 Ca2+를 제공하고 Cd2+와 이온 길항 작용을 하여 뿌리의 흡착 부위를 놓고 경쟁하며, 카드뮴의 토양 유입을 차단하고 생물학적 독성이 낮습니다. 카드뮴 스트레스 조건에서 50mmol L-1의 Ca를 첨가했을 때 참깨 잎의 카드뮴 이동이 억제되고 카드뮴 축적이 80% 감소했습니다. 벼(Oryza sativa L.) 및 기타 작물에서도 유사한 연구 결과가 보고되었습니다.12,13
최근 중금속 축적을 제어하기 위한 작물 엽면 살포는 중금속 제어의 새로운 방법으로 주목받고 있습니다. 이 방법의 주요 원리는 식물 세포 내 킬레이션 반응과 관련이 있으며, 이로 인해 중금속이 세포벽에 침착되어 식물의 중금속 흡수가 억제됩니다.14,15 안정적인 이산 킬레이트제인 옥살산은 식물 내 중금속 이온과 직접 킬레이트를 형성하여 독성을 감소시킵니다. 연구에 따르면 콩에 함유된 옥살산은 Cd2+와 킬레이트를 형성하고 상피세포를 통해 Cd 함유 결정을 방출하여 체내 Cd2+ 수치를 낮추는 것으로 나타났습니다.16 또한 옥살산은 토양 pH를 조절하고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 퍼옥시다제(POD), 카탈라제(CAT)의 활성을 증진시키며, 가용성 당, 가용성 단백질, 유리 아미노산 및 프롤린의 침투를 조절하는 대사 조절제 역할을 합니다.17,18 식물 내 산과 과잉의 Ca2+는 핵형성 단백질의 작용으로 옥살산칼슘 침전물을 형성한다. 식물 내 Ca2+ 농도를 조절하면 식물 내 용해된 옥살산과 Ca2+를 효과적으로 조절하고 옥살산과 Ca2+의 과잉 축적을 방지할 수 있다.19,20
석회 시비량은 토양 복구 효과에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 석회 시비량은 750~6000 kg/m2 범위인 것으로 나타났습니다. pH 5.0~5.5의 산성 토양의 경우, 3000~6000 kg/h/m2의 석회 시비량은 750 kg/h/m2의 시비량보다 효과가 현저히 높았습니다.21 그러나 석회를 과다 시비하면 토양 pH의 급격한 변화 및 토양 다짐과 같은 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.22 따라서 본 연구에서는 CaO 처리량을 0, 750, 2250, 3750 kg hm-2로 설정했습니다. 아라비도프시스 탈리아나에 옥살산을 처리했을 때, 10 mmol L-1 농도에서 Ca2+ 농도가 현저히 감소하고 Ca2+ 신호 전달에 영향을 미치는 CRT 유전자군이 강하게 반응하는 것으로 나타났습니다.20 기존 연구들을 종합하여 본 연구에서는 이 시험의 농도를 결정하고 외인성 보충제가 Ca2+ 및 Cd2+에 미치는 상호작용 효과를 추가적으로 연구할 수 있었습니다.23,24,25 따라서 본 연구는 카드뮴으로 오염된 토양에서 재배되는 삼칠의 카드뮴 함량 및 스트레스 내성에 대한 외인성 석회 및 옥살산 잎 분무의 조절 기전을 탐구하고, 삼칠 생산의 품질과 효능을 더욱 향상시키는 방안을 모색하는 것을 목표로 합니다. 본 연구는 카드뮴으로 오염된 토양에서 초본 식물 재배 규모를 확대하고 제약 시장에서 요구하는 고품질의 지속 가능한 생산을 달성하는 데 귀중한 지침을 제공합니다.
현지 인삼 품종인 원산 삼칠을 재료로 사용하여 윈난성 원산시 추베이현 란니자이(북위 24°11′, 동경 104°3′, 해발 1446m)에서 포장 실험을 수행하였다. 연평균 기온은 17°C, 연평균 강수량은 1250mm였다. 연구 대상 토양의 기본 값은 총 질소(TN) 0.57g kg⁻¹, 총 인(TP) 1.64g kg⁻¹, 총 탄소(TC) 16.31g kg⁻¹, 유기물(OM) 31.86g kg⁻¹, 알칼리 가수분해 질소(N) 88.82mg kg⁻¹, 유리 인 18.55mg kg⁻¹, 유리 칼륨 100.37mg kg⁻¹, 총 카드뮴 0.3mg kg⁻¹, pH 5.4였다.
2017년 12월 10일, 6 mg/kg의 Cd2+ (CdCl2·2.5H2O)와 석회 처리(0, 750, 2250 및 3750 kg/h/m2)를 혼합하여 각 시험구의 표토 0~10cm 층에 시비하였다. 각 처리는 3회 반복하였다. 시험구는 무작위로 배치하였으며, 각 시험구의 면적은 3m2이다. 1년생 삼칠 묘목을 파종 후 15일째에 이식하였다. 차광망을 사용하여 차광망 내부의 삼칠 광량은 일반 자연광의 약 18% 수준으로 유지하였다. 재배는 지역 전통 재배 방식에 따라 수행하였다. 2019년 삼칠 성숙기 전에 옥살산나트륨 형태의 옥살산을 살포하였다. 옥살산 농도는 각각 0, 0.1, 0.2 mol L⁻¹였고, NaOH를 사용하여 pH를 5.16으로 조절하여 낙엽 침출액의 평균 pH를 모사하였다. 잎의 위아래 면에 일주일에 한 번 오전 8시에 분무하였다. 5주 차에 4회 분무한 후, 3년생 삼칠을 수확하였다.
2019년 11월, 3년생 삼칠을 밭에서 채취하여 옥살산을 살포하였다. 생리대사 및 효소 활성 측정이 필요한 3년생 삼칠 시료 일부는 동결용 튜브에 넣어 액체 질소로 급속 냉동한 후 -80°C 냉장고에 보관하였다. 카드뮴(Cd) 및 유효 성분 함량 측정을 위한 성숙 단계의 뿌리 시료 일부는 수돗물로 세척하고 105°C에서 30분간 건조시킨 후 75°C에서 항량이 될 때까지 건조하고 막자사발에 갈아 보관하였다.
건조 식물 시료 0.2g을 계량하여 삼각 플라스크에 넣고 질산(HNO₃) 8ml와 과산화수소(HClO₄) 2ml를 첨가한 후 뚜껑을 덮어 하룻밤 동안 방치한다. 다음 날, 삼각 플라스크에 곡선 깔때기를 꽂아 전기열 분해를 실시하여 흰 연기가 나고 분해액이 투명해질 때까지 반응시킨다. 실온으로 식힌 후, 혼합물을 10ml 부피 플라스크로 옮긴다. 카드뮴(Cd) 함량은 원자 흡수 분광기(Thermo ICE™ 3300 AAS, USA)를 사용하여 측정한다. (GB/T 23739-2009).
건조 식물 시료 0.2g을 계량하여 50ml 플라스틱 병에 넣고, 10ml에 1mol L⁻¹ HCl을 첨가한 후 뚜껑을 닫고 15시간 동안 잘 흔들어 섞은 다음 여과한다. 피펫을 사용하여 필요한 양의 여과액을 취하여 적절히 희석하고, SrCl₂ 용액을 첨가하여 Sr²⁺ 농도를 1g L⁻¹로 맞춘다. Ca 함량은 원자 흡수 분광기(Thermo ICE™ 3300 AAS, USA)를 사용하여 측정한다.
말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 퍼옥시다제(POD) 및 카탈라제(CAT) 측정은 베이징 프롱 신기술 유한회사(DNM-9602)의 제품 등록 번호 2400147번인 해당 측정 키트를 사용하여 수행하였다.
삼칠 시료 약 0.05g을 계량하여 시험관 측면에 안트론황산 시약을 넣습니다. 시험관을 2~3초간 흔들어 액체가 충분히 섞이도록 합니다. 시험관을 시험관대에 놓고 15분간 발색시킵니다. 가용성 당 함량은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-5800, 상하이 위안시 기기 유한회사, 중국)를 이용하여 620nm 파장에서 측정합니다.
신선한 삼칠 시료 0.5g을 칭량하여 증류수 5ml와 함께 균질화한 후, 10,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 일정량으로 희석하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법을 사용하였다. 가용성 단백질 함량은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China)를 이용하여 595nm 파장에서 측정하고, 소 혈청 알부민 표준 곡선을 기준으로 계산하였다.
신선한 시료 0.5g을 계량하고 10% 아세트산 5ml를 첨가한 후 균질화될 때까지 갈아서 여과하고 일정한 부피가 될 때까지 희석하였다. 발색법은 닌히드린 용액을 사용하였다. 유리 아미노산 함량은 UV-visible 분광광도계(UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China)를 이용하여 570nm에서 측정하고 류신 표준곡선28을 기준으로 계산하였다.
신선한 시료 0.5g을 칭량하고, 3% 설포살리실산 용액 5ml를 첨가한 후, 수조에서 가열하고 10분간 흔들어 섞었다. 냉각 후, 용액을 여과하여 일정한 부피로 맞추었다. 산성 닌히드린을 사용한 비색법을 적용하였다. 프롤린 함량은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China)를 이용하여 520nm 파장에서 측정하고, 프롤린 표준곡선29을 기준으로 계산하였다.
사포닌 함량은 중국 약전(2015년판)을 참고하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정하였다. 고성능 액체 크로마토그래피의 기본 원리는 고압 액체를 이동상으로 사용하고, 고성능 컬럼 크로마토그래피의 초미세 입자 분리 기술을 고정상에 적용하는 것이다. 조작 방법은 다음과 같다.
HPLC 조건 및 시스템 적합성 시험(표 1): 충전제로는 옥타데실실란 결합 실리카겔을 사용하고, 이동상 A는 아세토니트릴, 이동상 B는 물을 사용한다. 아래 표에 나타낸 바와 같이 그라디언트 용출을 수행한다. 검출 파장은 203 nm이다. 삼칠산 총 사포닌의 R1 피크를 기준으로 이론 단수는 최소 4000 이상이어야 한다.
표준 용액 제조: 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rb1 및 노토진세노사이드 R1을 정확하게 칭량하고 메탄올을 첨가하여 용액 1ml당 진세노사이드 Rg1 0.4mg, 진세노사이드 Rb1 0.4mg 및 노토진세노사이드 R1 0.1mg을 함유하는 혼합물을 제조한다.
시험 용액 제조: 인삼 분말 0.6g을 칭량하고 메탄올 50ml를 첨가한다. 혼합 용액의 무게를 측정하고(W1) 하룻밤 동안 방치한다. 그 후, 혼합 용액을 80°C의 수조에서 2시간 동안 약하게 끓인다. 식힌 후, 혼합 용액의 무게를 측정하고 앞서 측정한 W1에 앞서 준비한 메탄올을 첨가한다. 잘 흔든 후 여과한다. 여과액을 분석용으로 보관한다.
표준 용액 10μL와 여과액 10μL를 정확하게 채취하여 고성능 액체 크로마토그래피(Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.)에 주입하여 사포닌 24 함량을 측정한다.
표준 곡선: Rg1, Rb1 및 R1의 혼합 표준 용액 측정. 크로마토그래피 조건은 위와 동일합니다. y축에 측정된 피크 면적, x축에 표준 용액 내 사포닌 농도를 나타내어 표준 곡선을 작성합니다. 시료의 측정된 피크 면적을 표준 곡선에 대입하여 사포닌 농도를 계산할 수 있습니다.
P. notogensings 시료 0.1g을 칭량하고 70% CH3OH 용액 50ml를 첨가하였다. 초음파 추출을 2시간 동안 수행한 후, 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액 1ml를 취하여 12배 희석하였다. 플라보노이드 함량은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China)를 이용하여 249nm 파장에서 측정하였다. 퀘르세틴은 표준 공통 물질 중 하나이다.
데이터는 Excel 2010 소프트웨어를 사용하여 정리했습니다. SPSS 20 통계 소프트웨어를 이용하여 분산 분석을 수행했습니다. 그림은 Origin Pro 9.1을 사용하여 그렸습니다. 계산된 통계값은 평균 ± 표준편차로 나타냈습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05를 기준으로 판단했습니다.
잎에 살포하는 옥살산의 농도가 동일할 때, 석회 시비량이 증가함에 따라 삼칠근 뿌리의 칼슘 함량이 유의하게 증가했다(표 2). 석회를 시비하지 않은 경우와 비교했을 때, 옥살산을 살포하지 않고 석회를 3750 kg/h/m2 첨가했을 때 칼슘 함량이 212% 증가했다. 석회 시비량이 동일할 경우, 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 칼슘 함량은 약간 증가했다.
뿌리의 카드뮴 함량은 0.22~0.70 mg kg⁻¹ 범위입니다. 옥살산 살포 농도가 동일할 때, 첨가하는 석회량이 증가함에 따라 2250 kg/h 처리구의 카드뮴 함량은 유의하게 감소했습니다. 대조군과 비교했을 때, 2250 kg hm⁻²의 석회와 0.1 mol l⁻¹의 옥살산을 살포한 후 뿌리의 카드뮴 함량은 68.57% 감소했습니다. 석회를 처리하지 않은 경우와 750 kg/h의 석회를 처리한 경우, 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 삼칠 뿌리의 카드뮴 함량은 유의하게 감소했습니다. 2250 kg/m²와 3750 kg/m²의 석회를 처리했을 때는 옥살산 농도가 증가함에 따라 뿌리의 카드뮴 함량이 처음에는 감소하다가 이후 증가했습니다. 또한, 이변량 분석 결과 석회는 삼칠근의 칼슘 함량(F = 82.84**), 카드뮴 함량(F = 74.99**), 옥살산 함량(F=7.72*)에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
첨가된 석회량과 분무 옥살산 농도가 증가함에 따라 MDA 함량은 유의하게 감소했습니다. 석회를 첨가하지 않은 경우와 3750 kg/m2의 석회를 첨가한 경우의 삼칠근 뿌리의 MDA 함량에는 유의한 차이가 없었습니다. 750 kg/h/m2 및 2250 kg/h/m2의 살포량에서 0.2 mol/L 옥살산 분무 처리 시 석회 함량은 옥살산을 살포하지 않은 경우에 비해 각각 58.38% 및 40.21% 감소했습니다. 가장 낮은 MDA 함량(7.57 nmol g⁻¹)은 석회 750 kg/h/m²와 0.2 mol/L 옥살산을 살포했을 때 관찰되었습니다(그림 1).
카드뮴 스트레스 조건에서 옥살산 엽면 살포가 삼칠 뿌리의 말론디알데히드 함량에 미치는 영향. 참고: 그림의 범례는 살포 시 옥살산 농도(mol L⁻¹)를 나타내며, 서로 다른 소문자는 동일한 석회 처리 조건에서 처리 간 유의미한 차이를 나타냅니다. (P < 0.05). 이하 동일.
3750 kg/h의 석회를 시용한 경우를 제외하고는, 삼칠근의 SOD 활성에는 유의미한 차이가 없었다. 석회를 0, 750, 2250 kg/h/m2 첨가했을 때, 0.2 mol/l 농도의 옥살산을 분무 처리한 경우 SOD 활성은 옥살산을 사용하지 않은 경우보다 각각 177.89%, 61.62%, 45.08% 유의하게 증가했다. 뿌리의 SOD 활성(598.18 U g⁻¹)은 석회를 시용하지 않은 경우와 0.2 mol/l 농도의 옥살산을 분무 처리한 경우에 가장 높았다. 옥살산을 동일 농도 또는 0.1 mol/l 농도로 분무 처리했을 때는 석회 시용량이 증가함에 따라 SOD 활성도 증가했다. 그러나 0.2 mol/l 옥살산을 분무 처리한 후에는 SOD 활성이 유의하게 감소했다(그림 2).
카드뮴 스트레스 조건에서 옥살산을 잎에 분무했을 때 삼칠근 뿌리의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 퍼옥시다제 및 카탈라제 활성에 미치는 영향
뿌리에서의 SOD 활성과 마찬가지로, 석회를 처리하지 않고 0.2 mol L⁻¹ 옥살산을 분무 처리한 뿌리에서 POD 활성이 가장 높았으며(63.33 µmol g⁻¹), 이는 대조군(25.50 µmol g⁻¹)보다 148.35% 높은 수치였다. 옥살산 분무 농도와 3750 kg/m²의 석회 처리량이 증가함에 따라 POD 활성은 처음에는 증가하다가 감소했다. 0.1 mol L⁻¹ 옥살산 처리와 비교했을 때, 0.2 mol L⁻¹ 옥살산 처리 시 POD 활성은 36.31% 감소했다(그림 2).
0.2 mol/l 옥살산을 살포하고 2250 kg/h/m2 또는 3750 kg/h/m2의 석회를 첨가한 경우를 제외하고, CAT 활성은 대조군보다 유의하게 높았습니다. 0.1 mol/l 옥살산을 살포하고 0.2250 kg/m2 또는 3750 kg/h/m2의 석회를 첨가했을 때, CAT 활성은 옥살산을 살포하지 않은 처리구에 비해 각각 276.08%, 276.69%, 33.05% 증가했습니다. 뿌리에서의 CAT 활성은 석회를 첨가하지 않은 처리구와 0.2 mol/L 옥살산을 처리한 처리구에서 가장 높았고(803.52 μmol/g), 3750 kg/h/m2의 석회와 0.2 mol/L 옥살산을 함께 처리한 경우 가장 낮았습니다(172.88 μmol/g) (그림 2).
이변량 분석 결과, 삼칠근의 CAT 활성과 MDA 활성은 옥살산 또는 석회 살포량 및 두 가지 처리 모두와 유의미한 상관관계를 보였다(표 3). 뿌리의 SOD 활성은 석회 및 옥살산 처리 또는 옥살산 살포 농도와 유의미한 상관관계를 보였다. 뿌리의 POD 활성은 석회 살포량 또는 석회 및 옥살산 처리에 유의미한 의존성을 나타냈다.
뿌리의 가용성 당 함량은 석회 시비량과 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 감소했다. 석회를 시비하지 않은 경우와 750 kg/h/m²의 석회를 시비한 경우의 삼칠근 가용성 당 함량에는 유의미한 차이가 없었다. 2250 kg/m²의 석회를 시비했을 때, 0.2 mol/L의 옥살산을 처리한 경우 가용성 당 함량이 옥살산을 살포하지 않은 경우보다 22.81% 유의하게 높았다. 3750 kg/h/m²의 석회를 시비했을 때는 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 가용성 당 함량이 유의하게 감소했다. 0.2 mol/L의 옥살산을 처리한 경우 가용성 당 함량이 옥살산을 살포하지 않은 경우보다 38.77% 감소했다. 또한, 0.2 mol·L⁻¹ 옥살산 분무 처리에서 가용성 당 함량이 205.80 mg·g⁻¹로 가장 낮았다(그림 3).
카드뮴 스트레스 조건에서 옥살산 엽면 살포가 삼칠 뿌리의 가용성 총당 및 가용성 단백질 함량에 미치는 영향
석회 시비량과 옥살산 분무 처리량이 증가함에 따라 뿌리의 가용성 단백질 함량이 감소했다. 석회를 첨가하지 않은 경우, 0.2 mol L⁻¹ 농도의 옥살산을 분무 처리했을 때 가용성 단백질 함량이 대조군에 비해 16.20% 유의하게 감소했다. 석회를 750 kg/h 시비했을 때는 삼칠근의 가용성 단백질 함량에 유의한 차이가 없었다. 석회 시비량이 2250 kg/h/m²일 때는 0.2 mol L⁻¹ 옥살산을 분무 처리했을 때 가용성 단백질 함량이 무처리군보다 35.11% 유의하게 높았다. 석회 시비량이 3750 kg·h/m²일 때는 옥살산 분무 농도가 증가함에 따라 가용성 단백질 함량이 유의하게 감소했으며, 옥살산 분무 농도가 0.2 mol·L⁻¹일 때 가용성 단백질 함량이 269.84 μg·g⁻¹로 가장 낮았다. 치료(그림 3).
석회를 처리하지 않은 경우, 삼칠근의 유리 아미노산 함량에는 유의미한 차이가 없었다. 옥살산 살포 농도가 증가하고 석회 시비량이 750kg/h/m2로 증가함에 따라 유리 아미노산 함량은 처음에는 감소하다가 이후 증가했다. 옥살산을 살포하지 않은 처리구와 비교했을 때, 석회 시비량 2250kg/h/m2와 0.2mol/l 옥살산을 함께 살포한 경우 유리 아미노산 함량이 33.58% 유의하게 증가했다. 옥살산 살포 농도가 증가하고 석회 시비량이 3750kg/m2로 증가함에 따라 유리 아미노산 함량은 유의하게 감소했다. 0.2mol/l 옥살산 살포 처리구의 유리 아미노산 함량은 옥살산을 살포하지 않은 처리구에 비해 49.76% 감소했다. 유리 아미노산 함량은 옥살산을 살포하지 않은 경우 2.09mg/g으로 가장 높았다. 0.2 mol/L 옥살산 분무 처리에서 유리 아미노산 함량이 가장 낮았다(1.05 mg/g)(그림 4).
카드뮴 스트레스 조건에서 옥살산을 잎에 분무했을 때 삼칠근 뿌리의 유리 아미노산 및 프롤린 함량에 미치는 영향
뿌리의 프롤린 함량은 석회 시비량과 옥살산 살포량이 증가함에 따라 감소했다. 석회를 시비하지 않았을 때는 인삼 뿌리의 프롤린 함량에 유의미한 차이가 없었다. 옥살산 살포 농도가 증가하고 석회 시비량(750kg/m² 또는 2250kg/m²)이 증가함에 따라 프롤린 함량은 처음에는 감소하다가 다시 증가했다. 0.2mol/L 옥살산 살포 처리군의 프롤린 함량은 0.1mol/L 옥살산 살포 처리군보다 유의미하게 높았으며, 각각 19.52%와 44.33% 증가했다. 석회를 3750kg/m² 첨가했을 때는 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 프롤린 함량이 유의미하게 감소했다. 0.2mol/L 옥살산을 살포했을 때 프롤린 함량은 옥살산을 살포하지 않은 경우에 비해 54.68% 감소했다. 가장 낮은 프롤린 함량은 0.2 mol/l 옥살산으로 처리했을 때 나타났으며, 그 값은 11.37 μg/g이었다(그림 4).
삼칠의 총 사포닌 함량은 Rg1>Rb1>R1 순이었다. 옥살산 분무 농도 증가에 따른 세 가지 사포닌 함량과 석회를 사용하지 않은 경우의 농도에는 유의미한 차이가 없었다(표 4).
0.2 mol L⁻¹ 옥살산을 살포한 후의 R1 함량은 옥살산을 살포하지 않고 석회를 750 또는 3750 kg/m² 시비한 경우보다 유의하게 낮았습니다. 살포된 옥살산 농도가 0 또는 0.1 mol/L일 때는 석회 시비량 증가에 따른 R1 함량의 유의한 차이가 없었습니다. 0.2 mol/L 옥살산을 살포했을 때, 석회를 3750 kg/h/m² 시비한 경우의 R1 함량은 석회를 시비하지 않은 경우의 43.84%보다 유의하게 낮았습니다(표 4).
옥살산의 살포 농도가 증가하고 석회 750kg/m2를 첨가함에 따라 Rg1 함량은 처음에는 증가하다가 감소했습니다. 석회 시비량이 2250kg/h와 3750kg/h일 때, 옥살산 살포 농도가 증가함에 따라 Rg1 함량은 감소했습니다. 동일한 옥살산 살포 농도에서 석회 시비량이 증가함에 따라 Rg1 함량은 처음에는 증가하다가 감소했습니다. 대조군과 비교했을 때, 옥살산의 세 가지 농도와 석회 750kg/m2 처리구의 Rg1 함량이 대조군보다 높았던 것을 제외하고는, 다른 처리구의 삼칠근 Rg1 함량은 대조군보다 낮았습니다. Rg1 함량이 최대인 조건은 석회 750kg/h/m2와 옥살산 0.1mol/l를 살포했을 때였으며, 이는 대조군보다 11.54% 높았습니다(표 4).
유속 2250 kg/h에서 옥살산의 분무 농도와 석회 시비량이 증가함에 따라 Rb1 함량은 처음에는 증가하다가 감소했습니다. 0.1 mol L⁻¹ 옥살산을 분무했을 때 Rb1 함량은 최대값인 3.46%에 도달했는데, 이는 옥살산을 분무하지 않은 경우보다 74.75% 높은 수치였습니다. 다른 석회 처리에서는 옥살산 분무 농도에 따른 유의미한 차이가 없었습니다. 0.1 및 0.2 mol L⁻¹ 옥살산을 분무한 후 석회 시비량이 증가함에 따라 Rb1 함량은 처음에는 감소하다가 감소했습니다(표 4).
옥살산의 살포 농도를 동일하게 유지했을 때, 첨가된 석회량이 증가함에 따라 플라보노이드 함량은 처음에는 증가하다가 감소했다. 석회를 첨가하지 않은 경우와 3750kg/m²의 석회를 첨가한 경우에 옥살산의 농도를 달리하여 살포했을 때 플라보노이드 함량에는 유의미한 차이가 없었다. 750kg/m²와 2250kg/m²의 석회를 첨가했을 때는 살포된 옥살산의 농도가 증가함에 따라 플라보노이드 함량이 처음에는 증가하다가 감소했다. 750kg/m²의 석회를 첨가하고 0.1mol/l 농도의 옥살산을 살포했을 때 플라보노이드 함량이 최대치인 4.38mg/g에 도달했는데, 이는 동일한 양의 석회를 첨가했을 때보다 18.38% 높은 수치이며, 이 경우에는 옥살산을 추가로 살포할 필요가 없었다. 0.1 mol L-1 옥살산 분무 처리 시 플라보노이드 함량은 옥살산을 처리하지 않은 경우 및 2250 kg/m2 용량의 석회를 처리한 경우에 비해 21.74% 증가했습니다(그림 5).
카드뮴 스트레스 조건에서 옥살산을 잎에 분무했을 때 삼칠근 뿌리의 플라보노이드 함량에 미치는 영향
이변량 분석 결과, 삼칠근의 가용성 당 함량은 석회 시비량과 옥살산 살포 농도에 유의하게 의존하는 것으로 나타났다. 뿌리의 가용성 단백질 함량은 석회 및 옥살산 시비량과 유의한 상관관계를 보였다. 뿌리의 유리 아미노산 및 프롤린 함량은 석회 시비량, 옥살산 살포 농도, 석회 및 옥살산의 동시 처리와 유의한 상관관계를 보였다(표 5).
삼칠근의 R1 함량은 분무된 옥살산의 농도, 석회량, 석회와 옥살산의 동시 처리에 유의미한 영향을 받았다. 플라보노이드 함량은 분무된 옥살산의 농도와 첨가된 석회량에 유의미한 영향을 받았다.
석회와 옥살산30과 같은 여러 개량제가 토양에 카드뮴을 고정시켜 식물의 카드뮴 함량을 줄이는 데 사용되어 왔습니다. 석회는 작물의 카드뮴 함량을 줄이기 위한 토양 개량제로 널리 사용됩니다31. Liang 등32은 옥살산 또한 중금속으로 오염된 토양을 정화하는 데 사용될 수 있다고 보고했습니다. 오염된 토양에 다양한 농도의 옥살산을 첨가한 결과, 토양 유기물 함량이 증가하고 양이온 교환 용량이 감소하며 pH가 증가했습니다33. 옥살산은 토양 내 금속 이온과 반응하기도 합니다. 카드뮴 스트레스 조건에서 삼칠의 카드뮴 함량은 대조군에 비해 유의하게 증가했지만, 석회를 사용하면 유의하게 감소했습니다. 본 연구에서 석회를 750 kg/h/m² 시용한 결과, 뿌리의 카드뮴 함량이 국가 기준(카드뮴 한도: Cd≤0.5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834)에 도달하여 효과가 우수하였다. 최적의 효과는 석회를 2250 kg/m² 시용했을 때 나타났다. 석회 시용은 토양 내 Ca²⁺와 Cd²⁺의 경쟁 부위를 다량 생성하고, 옥살산 시용은 삼칠 뿌리의 카드뮴 함량을 감소시킨다. 석회와 옥살산을 혼합 시용한 결과, 삼칠 뿌리의 카드뮴 함량이 현저히 감소하여 국가 기준에 도달하였다. 토양 내 Ca²⁺는 질량 흐름 과정을 통해 뿌리 표면에 흡착되어 칼슘 채널(Ca²⁺ 채널), 칼슘 펌프(Ca²⁺-AT-Pase), Ca²⁺/H⁺ 역수송체를 통해 뿌리 세포로 흡수된 후, 수평 방향으로 뿌리 목부로 이동한다. 뿌리 내 Ca와 Cd 함량 사이에는 유의미한 음의 상관관계가 있었다(P < 0.05). Ca 함량이 증가함에 따라 Cd 함량은 감소했는데, 이는 Ca와 Cd 사이의 길항 작용에 대한 가설과 일치한다. 분산 분석 결과, 석회 시비량은 삼칠근의 Ca 함량에 유의미한 영향을 미치는 것으로 나타났다. Pongrack 등35은 Cd가 옥살산칼슘 결정 내 옥살산에 결합하여 Ca와 경쟁한다고 보고했다. 그러나 옥살산이 Ca에 미치는 조절 효과는 미미했다. 이는 옥살산과 Ca2+로부터 옥살산칼슘이 침전되는 과정이 단순한 침전이 아니며, 여러 대사 경로에 의해 조절되는 공침전 과정임을 시사한다.
카드뮴 스트레스 하에서 식물은 다량의 활성산소종(ROS)을 생성하여 세포막 구조를 손상시킵니다.36 말론디알데히드(MDA) 함량은 ROS 수준과 식물 세포막 손상 정도를 판단하는 지표로 사용될 수 있습니다.37 항산화 시스템은 활성산소종을 제거하는 중요한 보호 메커니즘입니다.38 항산화 효소(POD, SOD, CAT 포함)의 활성은 카드뮴 스트레스에 의해 일반적으로 변화합니다. 연구 결과, MDA 함량은 카드뮴 농도와 양의 상관관계를 보였으며, 이는 카드뮴 농도가 증가함에 따라 식물 세포막 지질 과산화 정도가 심화됨을 나타냅니다.37 이는 Ouyang 등의 연구 결과와 일치합니다.39 본 연구는 MDA 함량이 석회, 옥살산, 석회와 옥살산의 혼합 처리에 의해 유의미하게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다. 0.1 mol L⁻¹ 옥살산을 분무 처리한 후, 삼칠의 MDA 함량이 감소했는데, 이는 옥살산이 삼칠 내 카드뮴의 생체 이용률과 활성산소종(ROS) 수준을 감소시킬 수 있음을 나타냅니다. 항산화 효소 시스템은 식물의 해독 기능이 일어나는 핵심입니다. SOD는 식물 세포에 함유된 O₂⁻를 제거하고 무독성 O₂와 저독성 H₂O₂를 생성합니다. POD와 CAT는 식물 조직에서 H₂O₂를 제거하고 H₂O₂를 H₂O로 분해하는 반응을 촉매합니다. iTRAQ 프로테옴 분석 결과, Cd₄₀ 스트레스 조건에서 석회를 처리한 후 SOD와 PAL의 단백질 발현 수준은 감소하고 POD의 발현 수준은 증가한 것으로 나타났습니다. 삼칠 뿌리에서 CAT, SOD, POD의 활성은 옥살산과 석회 처리량에 의해 유의하게 영향을 받았습니다. 0.1 mol L⁻¹ 옥살산 분무 처리는 SOD와 CAT 활성을 유의하게 증가시켰지만, POD 활성에 대한 조절 효과는 뚜렷하지 않았다. 이는 옥살산이 카드뮴 스트레스 하에서 ROS 분해를 촉진하고 주로 CAT 활성 조절을 통해 H₂O₂ 제거를 완료함을 보여주며, 이는 삼칠(Panax notoginseng)의 항산화 효소에 대한 Guo 등⁴¹의 연구 결과와 유사하다. 750 kg/h/m²의 석회를 첨가했을 때 항산화 효소 활성 및 말론디알데히드 함량에 미치는 영향은 옥살산 분무 처리의 효과와 유사했다. 따라서 옥살산 분무 처리는 삼칠의 SOD와 CAT 활성을 더욱 효과적으로 향상시키고 삼칠의 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있음을 알 수 있다. 0.2 mol L-1 옥살산과 3750 kg hm-2 석회 처리에 의해 SOD와 POD의 활성이 감소되었는데, 이는 고농도의 옥살산과 Ca2+를 과도하게 살포하면 식물에 스트레스를 줄 수 있음을 나타내며, 이는 Luo 등의 연구와 일치합니다. Wait 42.