우리는 이전에 장에서 유래하는 트립토판 대사산물인 인돌-3-프로피온산(IPA)의 혈청 수치가 간 섬유증 환자에서 낮다는 사실을 보고한 바 있습니다. 본 연구에서는 비만 간에서 IPA 혈청 수치와 관련된 전사체 및 DNA 메틸화 양상을 조사하고, 시험관 내에서 IPA가 간 성상세포(HSC)의 표현형 불활성화를 유도하는 역할을 규명하고자 했습니다.
본 연구에는 쿠오피오 비만수술센터(KOBS)에서 비만수술을 받은 제2형 당뇨병이 없는 비만 환자 116명(평균 연령 46.8 ± 9.3세, 체질량지수(BMI): 42.7 ± 5.0 kg/m²)이 포함되었다. 혈중 IPA 수치는 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)으로 측정하였고, 간 전사체 분석은 총 RNA 시퀀싱을 통해, DNA 메틸화 분석은 Infinium HumanMethylation450 BeadChip을 이용하여 수행하였다. 시험관 내 실험에는 인간 간성상세포(LX-2)를 사용하였다.
혈청 IPA 수치는 간에서 세포사멸, 미토콘드리아 자가포식 및 장수 경로에 관여하는 유전자 발현과 상관관계가 있었습니다. AKT 세린/트레오닌 키나제 1(AKT1) 유전자는 간 전사체 및 DNA 메틸화 프로파일에서 가장 풍부하고 지배적인 상호작용 유전자였습니다. IPA 처리는 LX-2 세포의 섬유화, 세포사멸 및 생존을 조절하는 것으로 알려진 유전자 발현을 조절함으로써 세포사멸을 유도하고, 미토콘드리아 호흡을 감소시키며, 세포 형태 및 미토콘드리아 역동성을 변화시켰습니다.
이러한 데이터들을 종합해 볼 때, IPA는 잠재적인 치료 효과를 가지고 있으며, 세포 사멸을 유도하고 HSC 표현형을 비활성 상태로 전환시켜 HSC 활성화 및 미토콘드리아 대사를 방해함으로써 간 섬유증을 억제할 가능성을 확대할 수 있음을 시사합니다.
비만과 대사증후군의 유병률 증가는 대사 관련 지방간 질환(MASLD)의 발생률 증가와 연관되어 있으며, 이 질환은 일반 인구의 25~30%에 영향을 미칩니다[1]. MASLD의 주요 병인은 간 섬유화이며, 이는 섬유성 세포외 기질(ECM)이 지속적으로 축적되는 역동적인 과정입니다[2]. 간 섬유화에 관여하는 주요 세포는 간 성상세포(HSC)이며, HSC는 휴면, 활성화, 비활성화, 노화의 네 가지 표현형을 나타냅니다[3, 4]. HSC는 활성화되어 휴면 형태에서 증식성 섬유아세포 유사 세포로 형질전환될 수 있으며, 높은 에너지 요구량을 가지며 α-평활근 액틴(α-SMA)과 제1형 콜라겐(Col-I)의 발현이 증가합니다[5, 6]. 간 섬유화가 역전되는 과정에서 활성화된 HSC는 세포사멸 또는 비활성화를 통해 제거됩니다. 이러한 과정에는 섬유형성 유전자의 하향 조절과 생존 촉진 유전자(NF-κB 및 PI3K/Akt 신호 경로 등)의 조절[7, 8]뿐만 아니라 미토콘드리아 역학과 기능의 변화[9]가 포함됩니다.
장에서 생성되는 트립토판 대사산물인 인돌-3-프로피온산(IPA)의 혈청 수치는 MASLD를 포함한 인간 대사 질환에서 감소하는 것으로 나타났습니다[10–13]. IPA는 식이섬유 섭취와 관련이 있으며, 항산화 및 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 생체 내외에서 식이로 유발되는 비알코올성 지방간염(NASH) 표현형을 완화합니다[11–14]. 저희 이전 연구에서도 쿠오피오 비만 수술 연구(KOBS)에서 간 섬유증 환자의 혈청 IPA 수치가 간 섬유증이 없는 비만 환자보다 낮다는 것을 보여주었습니다. 또한, 저희는 IPA 치료가 인간 간 성상세포(LX-2) 모델에서 세포 접착, 세포 이동 및 조혈 줄기세포 활성화의 고전적인 마커인 유전자 발현을 감소시킬 수 있으며, 잠재적인 간 보호 대사산물임을 보여주었습니다[15]. 그러나 IPA가 HSC 세포 사멸 및 미토콘드리아 생체 에너지 활성화를 통해 간 섬유증 퇴행을 유도하는 기전은 아직 불분명하다.
본 연구에서는 혈청 IPA가 비만이지만 제2형 당뇨병이 없는(KOBS) 환자의 간에서 세포사멸, 자가포식 및 장수 관련 유전자 발현과 연관되어 있음을 보여줍니다. 또한, IPA가 불활성화 경로를 통해 활성화된 조혈줄기세포(HSC)의 제거 및 분해를 유도할 수 있음을 발견했습니다. 이러한 결과는 IPA의 새로운 역할을 밝혀내어 간 섬유화 퇴행을 촉진하는 잠재적인 치료 표적으로서의 가능성을 제시합니다.
KOBS 코호트에서 수행된 이전 연구에서는 간 섬유증 환자의 혈중 IPA 수치가 간 섬유증이 없는 환자에 비해 낮다는 결과가 나타났습니다[15]. 제2형 당뇨병의 잠재적 교란 효과를 배제하기 위해, 본 연구에서는 진행 중인 KOBS 연구에서 제2형 당뇨병이 없는 비만 환자 116명(평균 연령 ± 표준편차: 46.8 ± 9.3세, BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2)을 연구 대상으로 선정했습니다[16]. 모든 참가자는 서면 동의서를 제출했으며, 본 연구 프로토콜은 헬싱키 선언(54/2005, 104/2008 및 27/2010)에 따라 북사보 카운티 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
간 생검 표본은 비만 수술 중에 얻었으며 이전에 기술된 기준에 따라 숙련된 병리학자가 조직학적으로 평가했습니다[17, 18]. 평가 기준은 보충표 S1에 요약되어 있으며 이전에 기술되었습니다[19].
공복 혈청 샘플은 비표적 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 이용하여 대사체 분석을 위해 분석되었습니다(n = 116). 샘플은 이전에 설명된 바와 같이 UHPLC-qTOF-MS 시스템(1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 분석되었습니다.19 이소프로필 알코올(IPA)의 확인은 유지 시간과 MS/MS 스펙트럼을 순수 표준물질과 비교하여 이루어졌습니다. IPA 신호 강도(피크 면적)는 모든 후속 분석에서 고려되었습니다.[20]
전체 간 RNA 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2500을 사용하여 수행되었으며, 데이터는 이전에 설명된 대로 전처리되었습니다[19, 21, 22]. 우리는 MitoMiner 4.0 데이터베이스에서 선택한 1957개 유전자를 사용하여 미토콘드리아 기능/생합성에 영향을 미치는 전사체의 표적 차등 발현 분석을 수행했습니다[23]. 간 DNA 메틸화 분석은 이전에 설명된 것과 동일한 방법론을 사용하여 Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다[24, 25].
인간 간성상세포(LX-2)는 Stefano Romeo 교수님께서 제공해 주셨으며, DMEM/F12 배지(Biowest, L0093-500, 1% 페니실린/스트렙토마이신; Lonza, DE17-602E, 2% 유당나트륨; Gibco, 10270-106)에서 배양 및 유지하였다. IPA의 적정 농도를 선택하기 위해 LX-2 세포를 DMEM/F12 배지에서 다양한 농도의 IPA(10 μM, 100 μM 및 1 mM; Sigma, 220027)로 24시간 처리하였다. 또한, IPA의 간성상세포 사멸 능력을 조사하기 위해 LX-2 세포를 무혈청 배지에서 5 ng/ml TGF-β1(R&D systems, 240-B-002/CF)과 1 mM IPA로 24시간 동안 동시 처리하였다. 해당 차량 대조군으로는 TGF-β1 처리에는 0.1% BSA를 함유한 4nM HCl을 사용했고, IPA 처리에는 0.05% DMSO를 사용했으며, 병용 처리에는 두 용액을 함께 사용했습니다.
세포 사멸은 제조사의 지침에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD(Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922)를 사용하여 평가했습니다. 간단히 설명하면, LX-2 세포(1 × 10⁵ 세포/웰)를 12웰 플레이트에 하룻밤 배양한 후, IPA 또는 IPA와 TGF-β1을 다양한 농도로 처리했습니다. 다음 날, 부유 세포와 부착 세포를 수집하고, 트립신 처리 후 PBS로 세척하고, Annexin V 결합 완충액에 재현탁하여 FITC-Annexin V 및 7-AAD와 함께 15분 동안 배양했습니다.
생세포 내 미토콘드리아의 산화 활성은 Mitotracker™ Red CMXRos(MTR)(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)을 사용하여 염색하였다. MTR 분석을 위해 LX-2 세포를 IPA 및 TGF-β1과 동일한 밀도로 배양하였다. 24시간 후, 생세포를 트립신 처리하고 PBS로 세척한 다음, 이전에 설명된 바와 같이 [26] 무혈청 배지에서 100 μM MTR과 함께 37 °C에서 20분 동안 배양하였다. 생세포 형태 분석을 위해 세포 크기와 세포질 복잡성은 각각 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC) 매개변수를 사용하여 분석하였다.
모든 데이터(30,000개 이벤트)는 NovoCyte Quanteon(Agilent)을 사용하여 수집되었고 NovoExpress® 1.4.1 또는 FlowJo V.10 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.
산소 소비율(OCR)과 세포외 산성화율(ECAR)은 제조사의 지침에 따라 Seahorse XF Cell Mito Stress가 장착된 Seahorse Extracellular Flux Analyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 실시간으로 측정했습니다. 간단히 설명하면, 2 × 10⁴개의 LX-2 세포를 XF96 세포 배양 플레이트에 접종했습니다. 하룻밤 배양 후, 세포에 이소프로판올(IPA)과 TGF-β1을 처리했습니다(보충 방법 1). 데이터 분석은 Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator가 포함된 Seahorse XF Wave 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다. 이를 통해 생체 에너지 건강 지수(BHI)를 계산했습니다[27].
총 RNA를 cDNA로 전사했습니다. 구체적인 방법은 참고문헌 [15]를 참조하십시오. 인간 60S 리보솜 산성 단백질 P0(RPLP0) 및 사이클로필린 A1(PPIA) mRNA 수준을 구성 유전자 대조군으로 사용했습니다. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR 시스템(Thermo Fisher, Landsmeer, 네덜란드)을 TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit(Applied Biosystems) 또는 Sensifast SYBR Lo-ROX Kit(Bioline, BIO 94050)와 함께 사용했으며, 상대적 유전자 발현 배율은 비교 Ct 값 사이클링 매개변수(ΔΔCt)와 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산했습니다. 프라이머에 대한 자세한 내용은 보충표 S2 및 S3에 제공됩니다.
핵 DNA(ncDNA)와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 이전에 설명된 바와 같이 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 추출했습니다[28]. mtDNA의 상대적 양은 각 표적 mtDNA 영역을 세 가지 핵 DNA 영역의 기하 평균에 대한 비율(mtDNA/ncDNA)로 계산했으며, 자세한 내용은 보충 방법 2에 나와 있습니다. mtDNA 및 ncDNA 프라이머에 대한 자세한 내용은 보충 표 S4에 제공됩니다.
세포 간 및 세포 내 미토콘드리아 네트워크를 시각화하기 위해 살아있는 세포를 Mitotracker™ Red CMXRos(MTR)(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)로 염색했습니다. LX-2 세포(1 × 10⁴ 세포/웰)를 유리 바닥 배양 접시(Ibidi GmbH, Martinsried, Germany)의 유리 슬라이드에 배양했습니다. 24시간 후, 살아있는 LX-2 세포를 37°C에서 20분 동안 100 μM MTR과 함께 배양하고, 세포핵을 DAPI(1 μg/ml, Sigma-Aldrich)로 염색했습니다(이전 연구[29] 참조). 미토콘드리아 네트워크는 Zeiss LSM 800 공초점 모듈이 장착된 Zeiss Axio Observer 도립 현미경(Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany)과 63×NA 1.3 대물렌즈를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 습윤 환경에서 관찰했습니다. 각 샘플 유형에 대해 10개의 Z 시리즈 이미지를 획득했습니다. 각 Z 시리즈에는 30개의 섹션이 포함되어 있으며 각 섹션의 두께는 9.86μm입니다. 각 샘플에 대해 ZEN 2009 소프트웨어(Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany)를 사용하여 10개의 서로 다른 시야 이미지를 획득하고 ImageJ 소프트웨어(v1.54d) [30, 31]를 사용하여 보충 방법 3에 자세히 설명된 매개변수에 따라 미토콘드리아 형태 분석을 수행했습니다.
세포는 0.1M 인산 완충액에 2% 글루타르알데히드를 첨가하여 고정시킨 후, 1% 사산화오스뮴 용액(Sigma Aldrich, MO, USA)으로 추가 고정하고, 아세톤(Merck, Darmstadt, Germany)으로 단계적으로 탈수시킨 다음, 에폭시 수지에 포매하였다. 초박절편을 제작하여 1% 아세트산우라닐(Merck, Darmstadt, Germany)과 1% 구연산납(Merck, Darmstadt, Germany)으로 염색하였다. 초미세구조 이미지는 JEM 2100F EXII 투과 전자 현미경(JEOL Ltd, Tokyo, Japan)을 이용하여 80kV의 가속 전압에서 얻었다.
IPA로 24시간 처리한 LX-2 세포의 형태는 Zeiss 역광 현미경(Zeiss Axio Vert.A1 및 AxioCam MRm, Jena, Germany)을 사용하여 50배율의 위상차 현미경으로 분석하였다.
임상 데이터는 평균 ± 표준편차 또는 중앙값(사분위 범위: IQR)으로 나타냈다. 세 연구 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 일원 분산 분석(연속 변수) 또는 χ² 검정(범주형 변수)을 사용했다. 다중 검정을 보정하기 위해 위양성률(FDR)을 사용했으며, FDR < 0.05인 유전자를 통계적으로 유의미한 것으로 간주했다. CpG DNA 메틸화와 IPA 신호 강도 간의 상관관계는 스피어만 상관분석을 통해 분석했으며, 유의수준 p값(p < 0.05)을 제시했다.
순환 혈청 IPA 수치와 연관된 3093개의 간 전사체 중 268개 전사체(명목상 p < 0.01), 119개 미토콘드리아 관련 전사체(명목상 p < 0.05), 그리고 4350개의 CpG 부위에 대해 웹 기반 유전자 세트 분석 도구(WebGestalt)를 사용하여 경로 분석을 수행했습니다. 무료로 제공되는 Venny DB(버전 2.1.0) 도구를 사용하여 중복 유전자를 찾았고, StringDB(버전 11.5)를 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 시각화했습니다.
LX-2 실험의 경우, D'Agostino-Pearson 검정을 사용하여 샘플의 정규성을 검사했습니다. 데이터는 최소 3회 이상의 생물학적 반복 실험에서 얻었으며, Bonferroni 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행했습니다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주했습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시했으며, 각 그림에는 실험 횟수를 표시했습니다. 모든 분석 및 그래프 작성은 Windows용 GraphPad Prism 8 통계 소프트웨어(GraphPad Software Inc., 버전 8.4.3, San Diego, USA)를 사용하여 수행했습니다.
먼저, 혈청 IPA 수치와 간, 전신 및 미토콘드리아 전사체 간의 연관성을 조사했습니다. 전체 전사체 프로파일에서 혈청 IPA 수치와 가장 강하게 연관된 유전자는 MAPKAPK3(FDR = 0.0077; 미토겐 활성화 단백질 키나아제 활성화 단백질 키나아제 3)였으며, 미토콘드리아 관련 전사체 프로파일에서는 AKT1(FDR = 0.7621; AKT 세린/트레오닌 키나아제 1)이었습니다(추가 파일 1 및 추가 파일 2 참조).
우리는 전반적인 전사체(n = 268; p < 0.01)와 미토콘드리아 관련 전사체(n = 119; p < 0.05)를 분석하여 최종적으로 세포사멸이 가장 유의미한 정규 경로임을 확인했습니다(p = 0.0089). 혈청 IPA 수치와 관련된 미토콘드리아 전사체 중에서 우리는 세포사멸(FDR = 0.00001), 미토파지(FDR = 0.00029) 및 TNF 신호 전달 경로(FDR = 0.000006)에 초점을 맞추었습니다(그림 1A, 표 2 및 보충 그림 1A-B).
혈청 IPA 수치와 관련된 인간 간에서 전체 전사체, 미토콘드리아 관련 전사체 및 DNA 메틸화의 중복 분석. A는 혈청 IPA 수치와 관련된 3092개의 CpG 부위에 매핑된 268개의 전체 전사체, 119개의 미토콘드리아 관련 전사체 및 DNA 메틸화 전사체를 나타낸다(전체 전사체 및 DNA 메틸화 전사체의 경우 p값 < 0.01, 미토콘드리아 전사체의 경우 p값 < 0.05). 주요 중복 전사체는 가운데에 표시되어 있다(AKT1 및 YKT6). B는 온라인 도구 StringDB를 사용하여 혈청 IPA 수치와 유의하게 연관된 56개의 중복 유전자(검은색 선 영역)로부터 다른 유전자와의 상호작용 점수가 가장 높은(0.900) 13개 유전자의 상호작용 지도를 구축한 것이다. 녹색: 유전자 온톨로지(GO) 세포 구성 요소: 미토콘드리아(GO:0005739)에 매핑된 유전자. AKT1은 데이터(텍스트 마이닝, 실험, 데이터베이스 및 공동 발현 데이터 기반)를 바탕으로 다른 단백질과의 상호작용 점수가 가장 높은 단백질(0.900)입니다. 네트워크의 노드는 단백질을 나타내고, 엣지는 단백질 간의 연결을 나타냅니다.
장내 미생물 대사산물이 DNA 메틸화를 통해 후성유전적 구성을 조절할 수 있기 때문에[32], 혈청 IPA 수치가 간 DNA 메틸화와 관련이 있는지 조사했습니다. 혈청 IPA 수치와 관련된 두 가지 주요 메틸화 부위는 프롤린-세린 풍부 영역 3(C19orf55)과 열충격 단백질 패밀리 B(소형) 멤버 6(HSPB6) 근처인 것으로 나타났습니다(추가 파일 3). 4350개의 CpG(p < 0.01)의 DNA 메틸화는 혈청 IPA 수치와 상관관계가 있었고, 장수 조절 경로에 풍부하게 존재했습니다(p = 0.006)(그림 1A, 표 2 및 보충 그림 1C).
혈청 IPA 수치, 전체 전사체, 미토콘드리아 관련 전사체 및 인간 간의 DNA 메틸화 사이의 연관성에 내재된 생물학적 메커니즘을 이해하기 위해, 이전 경로 분석에서 확인된 유전자들에 대한 중복 분석을 수행했습니다(그림 1A). 56개의 중복 유전자(그림 1A의 검은색 선 안쪽)에 대한 경로 풍부도 분석 결과, 세포사멸 경로(p = 0.00029)에서 세 가지 분석 모두에서 공통적으로 나타나는 두 유전자, AKT1과 YKT6(YKT6 v-SNARE 동족체)이 강조되었습니다(벤 다이어그램 참조, 보충 그림 2 및 그림 1A). 흥미롭게도, AKT1(cg19831386)과 YKT6(cg24161647)이 혈청 IPA 수치와 양의 상관관계를 나타내는 것을 확인했습니다(추가 파일 3). 유전자 산물 간의 잠재적인 단백질 상호작용을 확인하기 위해, 56개의 중복 유전자 중 공통 영역 점수가 가장 높은(0.900) 13개의 유전자를 입력으로 선택하고 상호작용 지도를 구축했습니다. 신뢰 수준(한계 신뢰도)에 따르면, 가장 높은 점수(0.900)를 받은 AKT1 유전자가 가장 위에 위치했습니다(그림 1B).
경로 분석 결과, 세포사멸이 주요 경로임을 확인했으므로, IPA 처리가 시험관 내에서 HSC의 세포사멸에 영향을 미치는지 조사했습니다. 우리는 이전에 다양한 농도의 IPA(10 μM, 100 μM, 1 mM)가 LX-2 세포에 무독성임을 입증한 바 있습니다[15]. 본 연구에서는 10 μM 및 100 μM의 IPA 처리 시 생존 세포 및 괴사 세포 수가 증가하는 것을 확인했습니다. 그러나 대조군과 비교했을 때, 1 mM IPA 농도에서는 세포 생존율이 감소한 반면, 세포 괴사율은 변화가 없었습니다(그림 2A, B). 다음으로, LX-2 세포에서 세포사멸을 유도하는 최적 농도를 찾기 위해 10 μM, 100 μM, 1 mM의 IPA를 24시간 동안 처리했습니다(그림 2A-E 및 보충 그림 3A-B). 흥미롭게도, IPA 10 μM 및 100 μM은 세포 사멸률(%)을 감소시켰지만, IPA 1 mM은 대조군에 비해 후기 세포 사멸 및 세포 사멸률(%)을 증가시켰으므로 추가 실험을 위해 선택되었습니다(그림 2A–D).
IPA는 LX-2 세포의 세포사멸을 유도합니다. Annexin V와 7-AAD 이중 염색법을 이용하여 유세포 분석법으로 세포사멸률과 세포 형태를 정량화했습니다. BA 세포를 10 μM, 100 μM, 1 mM IPA와 함께 24시간 동안 또는 F-H TGF-β1(5 ng/ml)과 1 mM IPA를 첨가한 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양했습니다. A: 생존 세포(Annexin V -/ 7AAD-); B: 괴사 세포(Annexin V -/ 7AAD+); C, F: 초기 세포사멸(Annexin V +/ 7AAD-); D, G: 후기 세포사멸(Annexin V+/7AAD+); E, H: 세포사멸률에서 초기 및 후기 세포사멸 세포의 비율(%). 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, n = 3회 독립 실험 결과를 사용했습니다. 통계적 비교는 Bonferroni 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. *p < 0.05; ****p < 0.0001
앞서 밝힌 바와 같이, 5 ng/ml TGF-β1은 고전적인 마커 유전자의 발현을 증가시켜 HSC 활성화를 유도할 수 있습니다[15]. LX-2 세포에 5 ng/ml TGF-β1과 1 mM IPA를 병용 처리했습니다(그림 2E–H). TGF-β1 단독 처리는 세포 사멸률에 변화를 주지 않았지만, IPA 병용 처리는 TGF-β1 단독 처리와 비교하여 후기 세포 사멸 및 세포 사멸률(%)을 증가시켰습니다(그림 2E–H). 이러한 결과는 1 mM IPA가 TGF-β1 유도와는 독립적으로 LX-2 세포의 세포 사멸을 촉진할 수 있음을 시사합니다.
우리는 LX-2 세포에서 IPA가 미토콘드리아 호흡에 미치는 영향을 추가로 조사했습니다. 그 결과, 1 mM IPA는 대조군에 비해 산소 소비율(OCR) 매개변수인 비미토콘드리아 호흡, 기저 및 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생성을 감소시켰지만(그림 3A, B), 생체 에너지 건강 지수(BHI)는 변화가 없었습니다.
IPA는 LX-2 세포에서 미토콘드리아 호흡을 감소시킵니다. 미토콘드리아 호흡 곡선(OCR)은 미토콘드리아 호흡 매개변수(비미토콘드리아 호흡, 기저 호흡, 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생성, SRC 및 BHI)로 나타냈습니다. 세포 A와 B는 각각 10 μM, 100 μM 및 1 mM IPA와 함께 24시간 동안 배양했습니다. 세포 C와 D는 각각 TGF-β1(5 ng/ml)과 1 mM IPA를 첨가한 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양했습니다. 모든 측정값은 CyQuant 키트를 사용하여 DNA 함량으로 정규화했습니다. BHI: 생체 에너지 건강 지수; SRC: 호흡 예비 용량; OCR: 산소 소비율. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시되었으며, n = 5개의 독립적인 실험 결과를 사용했습니다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)과 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 수행했습니다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001
TGF-β1으로 활성화된 LX-2 세포의 생체 에너지 프로필에 대한 IPA의 효과를 보다 포괄적으로 이해하기 위해 OCR을 이용하여 미토콘드리아 산화적 인산화를 분석했습니다(그림 3C,D). 그 결과, TGF-β1 처리군은 대조군에 비해 최대 호흡량, 호흡 예비 용량(SRC) 및 BHI가 감소했습니다(그림 3C,D). 또한, 병용 처리군은 기저 호흡량, 양성자 누출 및 ATP 생성량을 감소시켰지만, SRC와 BHI는 TGF-β1 단독 처리군보다 유의하게 높았습니다(그림 3C,D).
또한 Seahorse 소프트웨어에서 제공하는 "세포 에너지 표현형 테스트"를 수행했습니다(보충 그림 4A–D). 보충 그림 3B에서 볼 수 있듯이, TGF-β1 처리 후 OCR과 ECAR 대사 잠재력이 모두 감소했지만, 병용 요법군과 IPA 요법군에서는 대조군과 차이가 관찰되지 않았습니다. 더욱이, 병용 요법군과 IPA 요법군에서는 대조군에 비해 기저 및 스트레스 수준의 OCR이 모두 감소했습니다(보충 그림 4C). 흥미롭게도, 병용 요법에서도 유사한 양상이 관찰되었는데, TGF-β1 처리와 비교했을 때 기저 및 스트레스 수준의 ECAR에는 변화가 없었습니다(보충 그림 4C). HSC에서 미토콘드리아 산화적 인산화의 감소와 TGF-β1 처리 후 병용 요법이 SCR과 BHI를 회복시키는 능력은 대사 잠재력(OCR 및 ECAR)에 변화를 주지 않았습니다. 이러한 결과들을 종합해 보면, IPA는 HSC의 생체 에너지를 감소시킬 수 있으며, 이는 IPA가 HSC 표현형을 비활성화 방향으로 전환시키는 낮은 에너지 프로필을 유도할 수 있음을 시사합니다(보충 그림 4D).
IPA가 미토콘드리아 역동성에 미치는 영향을 미토콘드리아 형태 및 네트워크 연결의 3차원 정량화와 MTR 염색을 이용하여 조사하였다(그림 4 및 보충 그림 5). 그림 4는 대조군과 비교했을 때 TGF-β1 처리가 평균 표면적, 가지 수, 총 가지 길이, 가지 접합부 수를 감소시키고(그림 4A 및 B), 구형 미토콘드리아의 비율을 중간형으로 변화시켰음을 보여준다(그림 4C). IPA 처리만이 대조군과 비교하여 평균 미토콘드리아 부피를 감소시키고 미토콘드리아의 비율을 구형에서 중간형으로 변화시켰다(그림 4A). 반면, 구형도, 평균 가지 길이, 미토콘드리아 막 전위 의존성 MTR로 평가한 미토콘드리아 활성은 변화가 없었으며(그림 4A 및 E), 이러한 매개변수들은 두 그룹 간에 차이가 없었다. 이러한 결과들을 종합해 보면, TGF-β1과 IPA 처리는 살아있는 LX-2 세포에서 미토콘드리아의 모양과 크기뿐만 아니라 네트워크 복잡성도 조절하는 것으로 보인다.
IPA는 LX-2 세포에서 미토콘드리아 역동성과 미토콘드리아 DNA 양을 변화시킵니다. A. 혈청이 없는 배지에서 TGF-β1(5 ng/ml)과 1 mM IPA를 첨가하여 24시간 배양한 살아있는 LX-2 세포의 대표적인 공초점 현미경 이미지. Mitotracker™ Red CMXRos로 염색된 미토콘드리아 네트워크와 DAPI로 파란색으로 염색된 핵을 보여줍니다. 모든 데이터는 그룹당 최소 15개의 이미지를 포함합니다. 각 샘플 유형에 대해 10개의 Z-스택 이미지를 획득했습니다. 각 Z축 시퀀스는 30개의 슬라이스로 구성되었으며, 각 슬라이스의 두께는 9.86 μm입니다. 스케일 바: 10 μm. B. 이미지에 적응형 임계값 처리를 적용하여 식별된 대표적인 객체(미토콘드리아만 해당). 각 그룹의 모든 세포에 대해 미토콘드리아 형태 네트워크 연결에 대한 정량적 분석 및 비교를 수행했습니다. C. 미토콘드리아 형태 비율의 빈도. 0에 가까운 값은 구형을 나타내고, 1에 가까운 값은 사상형을 나타냅니다. D 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 함량은 재료 및 방법에서 설명한 대로 측정했습니다. E Mitotracker™ Red CMXRos 분석은 재료 및 방법에서 설명한 대로 유세포 분석기(30,000개 이벤트)를 사용하여 수행했습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되며, n = 3개의 독립적인 실험 결과를 나타냅니다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)과 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 수행했습니다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
다음으로, 미토콘드리아 수의 지표로 LX-2 세포의 mtDNA 함량을 분석했습니다. 대조군과 비교했을 때, TGF-β1 처리군에서 mtDNA 함량이 증가했습니다(그림 4D). TGF-β1 처리군과 비교했을 때, 병용 처리군에서는 mtDNA 함량이 감소했습니다(그림 4D). 이는 IPA가 mtDNA 함량을 감소시키고, 미토콘드리아 수 및 미토콘드리아 호흡에도 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다(그림 3C). 또한, IPA는 병용 처리에서 mtDNA 함량을 감소시키는 것으로 나타났지만, MTR 매개 미토콘드리아 활성에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 4A–C).
우리는 LX-2 세포에서 섬유화, 세포사멸, 생존 및 미토콘드리아 역동성과 관련된 유전자 mRNA 수준과 IPA의 연관성을 조사했습니다(그림 5A–D). 대조군과 비교했을 때, TGF-β1 처리군은 콜라겐 유형 I α2 사슬(COL1A2), α-평활근 액틴(αSMA), 매트릭스 메탈로프로테이나제 2(MMP2), 조직 메탈로프로테이나제 억제제 1(TIMP1) 및 다이나민 1 유사 유전자(DRP1)와 같은 유전자의 발현이 증가하여 섬유화 및 활성화가 증가했음을 보여주었습니다. 또한, 대조군과 비교했을 때, TGF-β1 처리는 핵 프레그난 X 수용체(PXR), 카스파제 8(CASP8), MAPKAPK3, B세포 α 억제제, 핵인자 κ 유전자 경펩타이드 증강인자(NFκB1A), 핵인자 κB 키나제 β 소단위 억제제(IKBKB)의 mRNA 수준을 감소시켰다(그림 5A–D). TGF-β1 처리와 비교했을 때, TGF-β1과 IPA 병용 처리는 COL1A2와 MMP2의 발현을 감소시켰지만, PXR, TIMP1, B세포 림프종-2(BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, IKBKB의 mRNA 수준은 증가시켰다. IPA 처리는 MMP2, Bcl-2 관련 단백질 X(BAX), AKT1, 시신경 위축 단백질 1(OPA1), 미토콘드리아 융합 단백질 2(MFN2)의 발현을 유의하게 감소시킨 반면, CASP8, NFκB1A, NFκB1B, IKBKB의 발현은 대조군에 비해 증가시켰습니다. 그러나 카스파제-3(CASP3), 세포사멸 펩티다제 활성화 인자 1(APAF1), 미토콘드리아 융합 단백질 1(MFN1), 분열 단백질 1(FIS1)의 발현에는 차이가 없었습니다. 종합적으로 이러한 결과는 IPA 처리가 섬유화, 세포사멸, 세포 생존 및 미토콘드리아 역동성과 관련된 유전자 발현을 조절함을 시사합니다. 본 연구 결과는 IPA 처리가 LX-2 세포에서 섬유화를 감소시키는 동시에, 세포 표현형을 불활성화 방향으로 전환시켜 세포 생존을 촉진함을 보여줍니다.
IPA는 LX-2 세포에서 섬유아세포, 세포사멸, 세포 생존 및 미토콘드리아 역동성 관련 유전자의 발현을 조절합니다. 히스토그램은 LX-2 세포를 무혈청 배지에서 TGF-β1과 IPA로 24시간 처리한 후, 내인성 대조군(RPLP0 또는 PPIA)에 대한 mRNA 발현량을 나타냅니다. A는 섬유아세포, B는 세포사멸 세포, C는 생존 세포, D는 미토콘드리아 역동성 관련 유전자 발현을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시되었으며, n = 3개의 독립적인 실험 결과를 사용했습니다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)과 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 수행했습니다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
이후, 세포 크기(FSC-H) 및 세포질 복잡성(SSC-H)의 변화를 유세포 분석법으로 평가하였고(그림 6A,B), IPA 처리 후 세포 형태 변화는 투과 전자 현미경(TEM) 및 위상차 현미경으로 관찰하였다(보충 그림 6A-B). 예상대로, TGF-β1 처리군의 세포는 대조군에 비해 크기가 증가하였으며(그림 6A,B), 조면소포체(ER*)와 식세포소체(P)의 전형적인 확장이 관찰되어 조혈줄기세포(HSC) 활성화를 나타냈다(보충 그림 6A). 그러나 TGF-β1과 IPA 병용 처리군에서는 TGF-β1 처리군에 비해 세포 크기, 세포질 복잡성(그림 6A,B) 및 ER* 함량이 감소하였다(보충 그림 6A). 또한, IPA 처리는 대조군에 비해 세포 크기, 세포질 복잡성(그림 6A,B), P 및 ER* 함량(보충 그림 6A)을 감소시켰습니다. 더불어, IPA 처리 24시간 후 세포 사멸 세포 함량이 대조군에 비해 증가했습니다(흰색 화살표, 보충 그림 6B). 종합적으로 이러한 결과는 1 mM IPA가 HSC 세포 사멸을 유도하고 TGF-β1에 의해 유발된 세포 형태학적 변화를 되돌려 세포 크기와 복잡성을 조절함으로써 HSC 비활성화와 관련될 수 있음을 시사합니다.
IPA는 LX-2 세포의 세포 크기와 세포질 복잡성을 변화시킵니다. 유세포 분석의 대표적인 이미지를 제시합니다. 분석에는 LX-2 세포에 특화된 게이팅 전략이 사용되었습니다. 세포 집단을 정의하기 위해 SSC-A/FSC-A를, 이중체를 식별하기 위해 FSC-H/FSC-A를, 그리고 세포 크기 및 복잡성 분석을 위해 SSC-H/FSC-H를 사용했습니다. 세포를 무혈청 배지에서 TGF-β1(5 ng/ml)과 1 mM IPA와 함께 24시간 동안 배양했습니다. LX-2 세포는 세포 크기 및 세포질 복잡성 분석을 위해 좌측 하사분면(SSC-H-/FSC-H-), 좌측 상사분면(SSC-H+/FSC-H-), 우측 하사분면(SSC-H-/FSC-H+), 그리고 우측 상사분면(SSC-H+/FSC-H+)으로 분류되었습니다. B. 세포 형태는 FSC-H(전방 산란, 세포 크기) 및 SSC-H(측방 산란, 세포질 복잡성)를 이용한 유세포 분석법으로 분석하였다(30,000개 이벤트). 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되었으며, n = 3개의 독립적인 실험 결과를 나타낸다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(ANOVA) 및 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001
IPA와 같은 장내 대사산물은 최근 연구의 주요 주제로 떠오르고 있으며, 장내 미생물총에서 새로운 표적을 발견할 수 있음을 시사합니다. 특히, 인간에서 간 섬유증과 연관된 대사산물인 IPA가 동물 모델에서 항섬유화 효과를 나타낼 수 있다는 연구 결과[15, 13, 14]는 주목할 만합니다. 본 연구에서는 제2형 당뇨병이 없는 비만 환자에서 혈청 IPA와 간 전사체 및 DNA 메틸화 사이의 연관성을 최초로 규명하고, 세포 사멸, 미토콘드리아 자가포식, 수명 연장, 그리고 간 항상성을 조절하는 후보 유전자 AKT1을 제시합니다. 또한, 본 연구의 또 다른 중요한 점은 LX-2 세포에서 IPA 처리가 세포 사멸, 세포 형태, 미토콘드리아 생체 에너지 및 역동성에 미치는 영향을 규명한 것입니다. 이는 IPA가 낮은 에너지 스펙트럼을 나타내어 간성 세포(HSC) 표현형을 불활성화 방향으로 전환시켜 간 섬유증 개선에 잠재적인 효과를 가질 수 있음을 시사합니다.
우리는 순환 혈청 IPA와 관련된 간 유전자에서 풍부하게 나타나는 가장 중요한 정규 경로가 세포사멸, 미토파지 및 장수임을 발견했습니다. 미토콘드리아 품질 관리(MQC) 시스템의 교란은 미토콘드리아 기능 장애, 미토파지 및 세포사멸을 유발하여 MASLD 발생을 촉진할 수 있습니다[33, 34]. 따라서 IPA는 간에서 세포사멸, 미토파지 및 장수를 통해 세포 역동성과 미토콘드리아 완전성을 유지하는 데 관여할 수 있다고 추측할 수 있습니다. 우리의 데이터는 세 가지 분석에서 공통적으로 나타나는 두 유전자, 즉 YKT6와 AKT1을 보여주었습니다. YKT6는 세포막 융합 과정에 관여하는 SNARE 단백질이라는 점에 주목할 필요가 있습니다. YKT6는 자가포식소에서 STX17 및 SNAP29와 개시 복합체를 형성하여 자가포식소와 리소좀의 융합을 촉진함으로써 자가포식 및 미토콘드리아 자가포식에 관여합니다[35]. 또한, YKT6 기능 상실은 미토콘드리아 자가포식 장애를 초래하는 반면[36], YKT6 발현 증가는 간세포암(HCC) 진행과 관련되어 세포 생존율 증가를 나타냅니다[37]. 한편, AKT1은 가장 중요한 상호작용 유전자로서 PI3K/AKT 신호전달 경로, 세포 주기, 세포 이동, 증식, 세포 접착, 미토콘드리아 기능 및 콜라겐 분비 등 간 질환에서 중요한 역할을 합니다[38–40]. 활성화된 PI3K/AKT 신호전달 경로는 세포외기질(ECM) 생성을 담당하는 조혈줄기세포(HSC)를 활성화시킬 수 있으며, 이 경로의 조절 이상은 간 섬유증의 발생 및 진행에 기여할 수 있다[40]. 또한, AKT는 p53 의존성 세포 사멸을 억제하는 주요 세포 생존 인자 중 하나이며, AKT 활성화는 간세포 사멸 억제와 관련될 수 있다[41, 42]. 이러한 결과는 IPA가 간세포의 사멸 또는 생존 선택에 영향을 미침으로써 간 미토콘드리아 관련 세포 사멸에 관여할 수 있음을 시사한다. 이러한 효과는 간 항상성 유지에 중요한 AKT 및/또는 YKT6 후보 유전자에 의해 조절될 수 있다.
본 연구 결과는 1 mM IPA가 TGF-β1 처리 여부와 관계없이 LX-2 세포에서 세포사멸을 유도하고 미토콘드리아 호흡을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 세포사멸은 섬유증 해소 및 조혈줄기세포(HSC) 활성화의 주요 경로이며, 간 섬유증의 가역적인 생리적 반응에서 중요한 역할을 한다는 점에 주목할 필요가 있습니다[4, 43]. 더욱이, 병용 치료 후 LX-2 세포에서 BHI가 회복된 것은 미토콘드리아 생체 에너지 조절에서 IPA의 잠재적 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 휴식 및 비활성 상태에서 조혈 세포는 일반적으로 미토콘드리아 산화적 인산화를 이용하여 ATP를 생성하며 대사 활동이 낮습니다. 반면, HSC 활성화는 해당 과정 상태로 진입하는 데 필요한 에너지 요구량을 보상하기 위해 미토콘드리아 호흡 및 생합성을 증가시킵니다[44]. IPA가 대사 잠재력 및 ECAR에 영향을 미치지 않았다는 사실은 해당 경로가 덜 중요하게 작용함을 시사합니다. 마찬가지로, 다른 연구에서는 1 mM IPA가 심근세포, 인간 간세포주(Huh7) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 미토콘드리아 호흡 사슬 활성을 조절할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 심근세포의 해당 과정에는 IPA의 영향이 발견되지 않아 IPA가 다른 세포 유형의 생체 에너지에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다[45]. 따라서 우리는 1 mM IPA가 mtDNA 양을 변화시키지 않고 섬유화 유전자 발현, 세포 형태 및 미토콘드리아 생체 에너지를 현저하게 감소시킬 수 있으므로 약한 화학적 탈공역제로 작용할 수 있다고 추측합니다[46]. 미토콘드리아 탈공역제는 배양 유도 섬유증 및 HSC 활성화를 억제하고[47] 탈공역 단백질(UCP) 또는 아데닌 뉴클레오티드 전위효소(ANT)와 같은 특정 단백질에 의해 조절되거나 유도되는 미토콘드리아 ATP 생산을 감소시킬 수 있습니다. 세포 유형에 따라 이 현상은 세포를 세포사멸로부터 보호하거나 세포사멸을 촉진할 수 있습니다[46]. 그러나 조혈 줄기세포 불활성화에서 미토콘드리아 탈공역제로서 IPA의 역할을 규명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
우리는 LX-2 세포에서 미토콘드리아 호흡의 변화가 미토콘드리아 형태에 반영되는지 조사했습니다. 흥미롭게도, TGF-β1 처리는 미토콘드리아의 형태를 구형에서 중간형으로 변화시키고, 미토콘드리아 분지를 감소시키며, 미토콘드리아 분열의 핵심 인자인 DRP1의 발현을 증가시켰습니다[48]. 더욱이, 미토콘드리아 분열은 전체 네트워크 복잡성과 관련이 있으며, 융합에서 분열로의 전환은 조혈 줄기 세포(HSC) 활성화에 중요하고, 미토콘드리아 분열 억제는 HSC 세포사멸을 유발합니다[49]. 따라서, 우리의 결과는 TGF-β1 처리가 미토콘드리아 네트워크 복잡성의 감소와 분지 감소를 유도할 수 있으며, 이는 활성화된 조혈 줄기 세포(HSC)와 관련된 미토콘드리아 분열에서 더 흔히 나타나는 현상임을 시사합니다. 또한, 우리의 데이터는 IPA가 미토콘드리아의 형태를 구형에서 중간형으로 변화시켜 OPA1과 MFN2의 발현을 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. 연구에 따르면 OPA1의 하향 조절은 미토콘드리아 막 전위를 감소시키고 세포 사멸을 유발할 수 있습니다[50]. MFN2는 미토콘드리아 융합과 세포 사멸을 매개하는 것으로 알려져 있습니다[51]. 이러한 결과는 TGF-β1 및/또는 IPA에 의한 LX-2 세포 유도가 미토콘드리아의 형태와 크기뿐만 아니라 활성화 상태 및 네트워크 복잡성을 조절하는 것으로 보인다는 것을 시사합니다.
본 연구 결과는 TGFβ-1과 IPA의 병용 치료가 세포사멸 회피 세포에서 섬유화, 세포사멸 및 생존 관련 유전자의 mRNA 발현을 조절함으로써 미토콘드리아 DNA(mtDNA)와 세포 형태학적 매개변수를 감소시킬 수 있음을 시사합니다. 실제로 IPA는 AKT1 및 COL1A2, MMP2와 같은 주요 섬유화 유전자의 mRNA 발현 수준을 감소시키는 반면, 세포사멸과 관련된 CASP8의 발현 수준은 증가시켰습니다. 또한, IPA 처리 후 BAX 발현은 감소하고 TIMP1 계열 소단위, BCL-2 및 NF-κB의 mRNA 발현은 증가하는 것을 확인하여, IPA가 세포사멸을 회피하는 조혈줄기세포(HSC)에서 생존 신호를 자극할 수 있음을 시사합니다. 이러한 분자들은 활성화된 조혈 줄기세포에서 생존 촉진 신호로 작용할 수 있으며, 이는 항세포사멸 단백질(예: Bcl-2)의 발현 증가, 세포사멸 촉진 단백질 BAX의 발현 감소, 그리고 TIMP와 NF-κB 사이의 복잡한 상호작용과 관련될 수 있습니다[5, 7]. IPA는 PXR을 통해 효과를 발휘하며, TGF-β1과 IPA를 병용 투여했을 때 PXR mRNA 발현 수준이 증가하는 것을 확인하여 HSC 활성화 억제를 확인했습니다. 활성화된 PXR 신호전달은 생체 내외에서 HSC 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있습니다[52, 53]. 본 연구 결과는 IPA가 세포사멸 촉진, 섬유화 및 미토콘드리아 대사 감소, 그리고 생존 신호 강화를 통해 활성화된 HSC를 비활성화 상태로 전환시키는 데 관여할 수 있음을 시사합니다. IPA가 세포사멸에 관여하는 잠재적 기전 및 역할에 대한 또 다른 가능한 설명은 IPA가 주로 미토파지(내재적 경로)와 외재적 TNF 신호 전달 경로(표 1)를 통해 기능 장애가 있는 미토콘드리아를 제거한다는 것입니다. 이 경로는 NF-κB 생존 신호 전달 경로와 직접적으로 연결되어 있습니다(보충 그림 7). 흥미롭게도, IPA 관련 풍부 유전자들은 세포사멸 경로에서 세포사멸 촉진 신호와 생존 촉진 신호를 모두 유도할 수 있습니다[54]. 이는 IPA가 이러한 유전자들과 상호작용하여 세포사멸 경로 또는 생존을 유도할 수 있음을 시사합니다. 그러나 IPA가 HSC 활성화 과정에서 세포사멸 또는 생존을 유도하는 기전과 그 메커니즘은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다.
IPA는 장내 미생물총을 통해 식이 트립토판으로부터 생성되는 미생물 대사산물입니다. 연구에 따르면 IPA는 장내 환경에서 항염증, 항산화 및 후성유전적 조절 특성을 가지고 있습니다.[55] 또한 IPA는 장벽 기능을 조절하고 산화 스트레스를 감소시켜 국소적인 생리적 효과를 나타낼 수 있다는 연구 결과도 있습니다.[56] 실제로 IPA는 혈액 순환을 통해 표적 장기로 운반되며, 트립토판, 세로토닌 및 인돌 유도체와 유사한 주요 대사산물 구조를 공유하기 때문에 경쟁적인 대사 경로를 통해 대사 작용을 나타냅니다.[52] IPA는 효소 또는 수용체의 결합 부위를 놓고 트립토판 유래 대사산물과 경쟁하여 정상적인 대사 경로를 방해할 가능성이 있습니다. 따라서 IPA의 치료적 유효 범위(therapeutic window)를 더 잘 이해하기 위해 약동학 및 약력학에 대한 추가 연구가 필요합니다.[57] 이러한 현상이 조혈 줄기세포(HSC)에서도 발생하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있음을 인정합니다. IPA와 관련된 연관성을 구체적으로 조사하기 위해 제2형 당뇨병(T2DM) 환자를 제외했습니다. 따라서 본 연구 결과의 적용 범위가 제2형 당뇨병 및 진행성 간 질환 환자에게까지 확대되는 데에는 한계가 있음을 인지하고 있습니다. 인체 혈청 내 IPA의 생리적 농도는 1~10 μM이지만[11, 20], 본 연구에서는 독성이 없는 최고 농도[15]와 세포 사멸률이 가장 높은 농도를 기준으로 1 mM의 IPA 농도를 선택했으며, 괴사 세포 비율에는 차이가 없었습니다. 본 연구에서는 생리적 농도보다 높은 IPA를 사용했지만, IPA의 유효 용량에 대해서는 아직 합의된 바가 없습니다[52]. 본 연구 결과는 유의미하지만, IPA의 광범위한 대사 경로에 대해서는 여전히 연구가 활발히 진행되고 있습니다. 또한, 혈청 IPA 농도와 간 전사체의 DNA 메틸화 사이의 연관성에 대한 본 연구 결과는 조혈 줄기 세포(HSC)뿐만 아니라 간 조직에서도 얻은 데이터를 기반으로 합니다. 우리는 IPA가 조혈 줄기 세포(HSC) 활성화와 관련이 있다는 이전의 전사체 분석 결과를 바탕으로 인간 LX-2 세포를 사용하기로 결정했으며[15], HSC는 간 섬유증 진행에 관여하는 주요 세포입니다. 간은 여러 유형의 세포로 구성되어 있으므로, IPA의 역할과 다른 간세포 유형과의 상호작용을 연구하기 위해서는 카스파제 활성화 및 DNA 단편화와 결합된 간세포-HSC-면역 세포 공동 배양 시스템과 같은 다른 세포 모델과 단백질 수준을 포함한 작용 메커니즘을 고려해야 합니다.