다양한 식물 방어 이론은 식물의 특수 대사 패턴을 설명하는 데 중요한 이론적 지침을 제공하지만, 핵심 예측은 아직 검증되지 않았습니다. 본 연구에서는 편향되지 않은 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 이용하여 개별 식물부터 개체군, 그리고 근연종에 이르기까지 약독화 담배 품종의 대사체를 체계적으로 탐색하고, 화합물 스펙트럼 기반의 질량 분석 특징 이론을 대량으로 분석하여 최적 방어(OD) 이론과 이동 표적(MT) 이론의 핵심 예측을 검증했습니다. 식물 대사체학의 정보 구성 요소는 OD 이론과 일치하지만, 초식동물에 의한 대사체 역학에 대한 MT 이론의 주요 예측과는 상반됩니다. 미시적 진화 규모에서 거시적 진화 규모에 이르기까지, 자스몬산 신호는 OD의 주요 결정인자로 확인되었으며, 에틸렌 신호는 MS/MS 분자 네트워크에 의해 주석된 초식동물 특이적 반응을 미세 조정하는 역할을 하는 것으로 나타났습니다.
다양한 구조를 가진 특수 대사산물은 식물이 환경에 적응하는 데, 특히 천적 방어에 있어 핵심적인 역할을 합니다(1). 식물에서 발견되는 놀라운 특수 대사의 다양성은 생태학적 기능의 여러 측면에 대한 심층적인 연구를 수십 년 동안 촉진해 왔으며, 식물-곤충 상호작용의 진화적, 생태적 발전을 반영하는 수많은 식물 방어 이론을 형성해 왔습니다. 실증 연구는 중요한 지침을 제공합니다(2). 그러나 이러한 식물 방어 이론들은 핵심 예측이 동일한 분석 수준에 있고(3), 다음 이론 발전 단계를 진행하기 위해 실험적으로 검증되는 가설적 연역 추론이라는 규범적인 경로를 따르지 않았습니다(4). 기술적 한계로 인해 데이터 수집이 특정 대사 범주로 제한되고 특수 대사산물에 대한 포괄적인 분석이 불가능해지면서 이론 발전에 필수적인 범주 간 비교가 어려워졌습니다(5). 포괄적인 대사체학 데이터의 부족과 서로 다른 식물 그룹 간의 대사 공간 처리 워크플로를 비교할 수 있는 공통 기준의 부재는 이 분야의 과학적 성숙도를 저해하고 있습니다.
최근 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 대사체학 분야의 발전은 주어진 계통군 내 종간 및 종내 대사 변화를 종합적으로 특성화할 수 있으며, 이러한 복잡한 혼합물 간의 구조적 유사성을 계산하기 위해 계산 방법과 결합될 수 있습니다. 화학에 대한 사전 지식(5)이 필요합니다. 분석 및 컴퓨팅 분야의 첨단 기술의 결합은 대사 다양성에 대한 생태학적 및 진화론적 이론에서 제시하는 많은 예측을 장기적으로 검증하는 데 필요한 틀을 제공합니다. 섀넌(6)은 1948년 그의 획기적인 논문에서 정보 이론을 처음으로 소개하여 정보의 수학적 분석의 기초를 마련했으며, 이는 원래 응용 분야 외에도 여러 분야에서 활용되었습니다. 유전체학에서는 정보 이론이 서열 보존 정보를 정량화하는 데 성공적으로 적용되었습니다(7). 전사체학 연구에서는 정보 이론이 전사체의 전반적인 변화를 분석합니다(8). 이전 연구에서 우리는 정보 이론의 통계적 틀을 대사체학에 적용하여 식물 조직 수준의 대사 전문성을 설명했습니다(9). 본 연구에서는 MS/MS 기반 워크플로우와 정보 이론의 통계적 틀(공통 통화로서의 대사 다양성을 특징으로 함)을 결합하여 초식동물에 의해 유도된 대사체에 대한 식물 방어 이론의 주요 예측을 비교합니다.
식물 방어의 이론적 틀은 일반적으로 상호 배타적이며 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 하나는 최적 방어(OD)(10), 이동 표적(MT)(11), 출현(12) 이론과 같이 방어 기능을 기반으로 식물 특이적 대사산물의 분포를 설명하려는 것이고, 다른 하나는 탄소-영양 균형 가설(13), 성장률 가설(14), 성장 및 분화 평형 가설(15)과 같이 자원 가용성의 변화가 식물 성장 및 특수 대사산물 축적에 미치는 영향을 기계적으로 설명하려는 것입니다. 이 두 가지 이론은 분석 수준이 다릅니다(4). 그러나 기능적 수준에서 방어 기능을 다루는 두 가지 이론이 식물의 구성적 및 유도적 방어에 대한 논의를 지배합니다. 하나는 OD 이론으로, 식물은 필요할 때, 예를 들어 풀을 먹는 동물이 공격할 때만 값비싼 화학적 방어에 투자한다고 가정합니다. 따라서 미래의 공격 가능성에 따라 방어 기능을 가진 화합물이 할당됩니다(10). MT 가설은 방향성 대사물 변화의 축이 없고 대사물이 무작위로 변화하여 공격하는 초식동물의 대사적 "운동 목표"를 방해할 가능성을 만들어낸다고 제안합니다. 즉, 이 두 이론은 초식동물의 공격 후에 발생하는 대사 재구성에 대해 반대되는 예측을 합니다. 즉, 방어 기능을 가진 대사물의 단방향 축적(OD)과 비방향성 대사 변화(MT) 사이의 관계입니다(11).
OD 가설과 MT 가설은 대사체 변화뿐만 아니라 특정 생태 환경에서 이러한 대사 변화의 적응 비용과 이점과 같은 대사물질 축적의 생태학적 및 진화적 결과까지 포함합니다(16). 두 가설 모두 특수 대사물질의 방어 기능을 인정하지만, 이 기능이 비용을 수반할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 점에서 차이가 있습니다. OD 가설과 MT 가설을 구분하는 핵심 예측은 유도된 대사 변화의 방향성에 있습니다. OD 이론의 예측은 지금까지 가장 많은 실험적 관심을 받아왔습니다. 이러한 실험에는 온실 및 자연 조건에서 특정 화합물의 다양한 조직의 직접적 또는 간접적 방어 기능 연구와 식물 발달 단계의 변화 연구가 포함됩니다(17-19). 그러나 현재까지 모든 유기체의 대사 다양성에 대한 포괄적인 분석을 위한 워크플로 및 통계적 프레임워크가 부족하여 두 이론 간의 주요 차이점 예측(즉, 대사 변화의 방향)은 아직 검증되지 않았습니다. 본 연구에서는 이러한 분석을 제공합니다.
식물 특이적 대사산물의 가장 중요한 특징 중 하나는 단일 식물, 개체군, 유사 종에 이르기까지 모든 수준에서 구조적 다양성이 매우 크다는 점입니다(20). 개체군 규모에서는 특수 대사산물의 양적 변화가 많이 관찰되는 반면, 종 수준에서는 질적 차이가 뚜렷하게 유지됩니다(20). 따라서 식물의 대사 다양성은 기능적 다양성의 핵심 요소이며, 특히 특정 곤충과 일반 초식동물의 침입 가능성이 다른 다양한 생태적 지위에 대한 적응성을 반영합니다(21). 프랭클(Fraenkel)의 식물 특이적 대사산물 존재 이유에 대한 획기적인 논문(22) 이후, 다양한 곤충과의 상호작용은 중요한 선택압으로 여겨져 왔으며, 이러한 상호작용이 식물의 진화 과정에서 대사 경로를 형성해 온 것으로 추정됩니다(23). 특수 대사산물 다양성의 종간 차이는 초식동물에 대한 식물의 구성적 및 유도적 방어 전략과 관련된 생리적 균형을 반영할 수도 있는데, 두 종은 종종 서로 음의 상관관계를 보이기 때문입니다(24). 항상 우수한 방어 체계를 유지하는 것이 유익할 수 있지만, 방어와 관련된 시의적절한 대사 변화는 식물이 귀중한 자원을 다른 생리적 투자에 할당하고 공생에 따른 부수적 피해를 피할 수 있도록 하는 분명한 이점을 제공합니다(19, 24, 25). 또한, 곤충 초식동물에 의해 유발되는 이러한 특수 대사산물의 재조직은 개체군 내에서 파괴적인 분포를 초래할 수 있으며(26), 개체군 내에서 유지될 수 있는 자스몬산(JA) 신호의 상당한 자연적 변화를 직접적으로 반영할 수 있습니다. 높은 JA 신호와 낮은 JA 신호는 초식동물에 대한 방어와 특정 종과의 경쟁 사이의 상충 관계를 나타냅니다(27). 더욱이, 특수 대사산물 생합성 경로는 진화 과정에서 빠르게 소실되고 변형되어 밀접하게 관련된 종들 사이에서 불균일한 대사 분포를 초래합니다(28). 이러한 다형성은 변화하는 초식동물 패턴에 대한 반응으로 빠르게 확립될 수 있으며(29), 이는 초식동물 군집의 변동이 대사 이질성을 유발하는 핵심 요인임을 의미합니다.
본 연구에서는 구체적으로 다음과 같은 문제들을 해결하고자 했습니다. (I) 초식 곤충은 식물의 대사체를 어떻게 재구성하는가? (II) 장기 방어 이론의 예측을 검증하기 위해 정량화할 수 있는 대사 가소성의 주요 정보 구성 요소는 무엇인가? (III) 공격자에 특화된 방식으로 식물의 대사체를 재프로그래밍하는 경우, 식물 호르몬은 특정한 대사 반응을 유도하는 데 어떤 역할을 하며, 어떤 대사산물이 방어의 종 특이성에 기여하는가? (IV) 많은 방어 이론의 예측은 모든 생물 조직 수준에 적용될 수 있으므로, 내부 비교와 종간 비교에서 유발되는 대사 반응의 일관성은 어느 정도인가? 이를 위해 본 연구에서는 특수 대사 작용이 풍부하고 토착 초식 곤충인 나비목 독말벌레(Ms, 매우 공격적이며 주로 가지과 식물을 섭식함)와 갯방풍벌레(Sl, 목화잎벌레)의 유충에 효과적인 담배잎의 니코틴 대사체를 체계적으로 연구하였다. 갯방풍벌레는 가지과 식물을 비롯한 다양한 속과 과의 식물을 기주로 삼는 일종의 "속"에 속한다. 본 연구에서는 MS/MS 대사체 스펙트럼을 분석하고 정보 이론적 통계적 설명자를 추출하여 OD와 MT 이론을 비교하였다. 주요 대사산물의 정체를 밝히기 위해 특이성 지도를 작성하였다. 또한, 본 연구를 토착 목화잎벌레(N. nasi) 개체군 및 근연종 담배로 확장하여 식물 호르몬 신호 전달과 OD 유도 간의 공변성을 추가적으로 분석하였다.
초식성 담배 잎 대사체의 가소성과 구조에 대한 전반적인 지도를 얻기 위해, 이전에 개발된 분석 및 계산 워크플로우를 사용하여 식물 추출물로부터 고해상도 데이터 독립형 MS/MS 스펙트럼을 종합적으로 수집하고 분해했습니다(9). 이 비분리 방법(MS/MS라고 함)은 중복되지 않는 화합물 스펙트럼을 구성할 수 있으며, 이는 여기에 설명된 모든 화합물 수준 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게 분해된 식물 대사체는 수백에서 수천 개의 대사체(여기서는 약 500-1000개의 MS/MS)로 구성된 다양한 유형입니다. 여기서는 정보 이론의 틀에서 대사 가소성을 고려하고, 대사 빈도 분포의 섀넌 엔트로피를 기반으로 대사체의 다양성과 전문성을 정량화합니다. 이전에 구현된 공식(8)을 사용하여 대사체 다양성(Hj 지표), 대사 프로파일 특수화(δj 지표) 및 단일 대사체의 대사 특이성(Si 지표)을 정량화하는 데 사용할 수 있는 일련의 지표를 계산했습니다. 또한, 우리는 초식동물의 대사체 유도성을 정량화하기 위해 상대 거리 가소성 지수(RDPI)를 적용했습니다(그림 1A)(30). 이 통계적 틀 내에서, 우리는 MS/MS 스펙트럼을 기본 정보 단위로 취급하고, MS/MS의 상대적 풍부도를 빈도 분포 맵으로 처리한 다음, 섀넌 엔트로피를 사용하여 대사체 다양성을 추정합니다. 대사체 특수화는 단일 MS/MS 스펙트럼의 평균 특이성으로 측정됩니다. 따라서 초식동물 유도 후 일부 MS/MS 클래스의 풍부도 증가는 스펙트럼 유도성, RDPI 및 특수화, 즉 δj 지수의 증가로 변환됩니다. 이는 더 많은 특수화된 대사체가 생성되고 높은 Si 지수가 생성되기 때문입니다. Hj 다양성 지수의 감소는 생성된 MS/MS의 수가 감소하거나 프로파일 빈도 분포가 덜 균일한 방향으로 변화하면서 전체적인 불확실성이 감소함을 반영합니다. Si 지수 계산을 통해 특정 초식동물에 의해 유도되는 MS/MS와 유도에 반응하지 않는 MS/MS를 구분할 수 있으며, 이는 MT 및 OD 예측을 구별하는 핵심 지표입니다.
(A) 초식동물(H1~Hx) MS/MS 데이터 유도성(RDPI), 다양성(Hj 지수), 특수화(δj 지수) 및 대사체 특이성(Si 지수)에 사용된 통계적 지표. 특수화 정도(δj)의 증가는 평균적으로 더 많은 초식동물 특이적 대사체가 생성됨을 나타내고, 다양성(Hj)의 감소는 대사체 생성량 감소 또는 분포 지도에서 대사체의 불균등한 분포를 나타낸다. Si 값은 특정 조건(여기서는 초식동물)에 특이적인 대사체인지, 아니면 동일한 수준으로 유지되는지를 평가한다. (B) 정보 이론 축을 이용한 방어 이론 예측 개념도. 방어 이론은 초식동물의 공격이 방어 대사체를 증가시켜 δj를 증가시킬 것이라고 예측한다. 동시에, 대사 정보의 불확실성이 감소하는 방향으로 프로필이 재구성되므로 Hj는 감소한다. MT 이론은 초식동물의 공격이 대사체에 비방향성 변화를 일으켜 대사 정보 불확실성 증가 지표인 Hj를 증가시키고 Si의 무작위 분포를 초래할 것이라고 예측합니다. 또한, 방어 가치가 높은 일부 대사물질은 특히 증가하고(높은 Si 값), 다른 대사물질은 무작위적인 반응을 보이는(낮은 Si 값) 혼합 모델인 최적의 MT 모델을 제안했습니다.
정보 이론의 서술자를 사용하여, 우리는 OD 이론을 해석하여 초식동물에 의해 유도된 비정상적인 상태의 특정 대사산물 변화가 (i) 대사 특이성(Si 지수) 증가로 이어져 대사체 특이성(δj 지수)이 증가하고, (ii) 대사 빈도 분포가 렙틴 생성 부위 분포로 변화함에 따라 대사체 다양성(Hj 지수)이 감소할 것이라고 예측합니다. 단일 대사산물 수준에서는 질서정연한 Si 분포가 예상되며, 각 대사산물은 방어 가치에 따라 Si 값이 증가할 것입니다(그림 1B). 이와 유사하게, 우리는 MT 이론을 설명하여 여기(excitation)가 (i) 대사산물의 비방향성 변화로 이어져 δj 지수가 감소하고, (ii) 대사 불확실성 또는 무작위성 증가로 인해 Hj 지수가 증가할 것이라고 예측합니다. 이러한 대사 불확실성 또는 무작위성은 일반화된 다양성의 형태로 섀넌 엔트로피로 정량화할 수 있습니다. 대사 구성에 관해서는 MT 이론이 Si의 무작위 분포를 예측합니다. 특정 대사산물은 특정한 조건에서만 존재하고, 다른 대사산물은 그렇지 않으며, 그 방어력이 환경에 따라 달라진다는 점을 고려하여, δj와 Hj가 Si 증가의 모든 방향을 따라 두 가지로 분포하는 혼합 방어 모델을 제안했습니다. 이 모델에서는 방어력이 높은 특정 대사산물 그룹만이 Si를 특별히 증가시키고, 나머지는 무작위로 분포합니다(그림 1B).
정보 이론 설명자를 축으로 하는 재정의된 방어 이론 예측을 검증하기 위해, 우리는 네펜테스 팔렌스(Nepenthes pallens) 잎에서 전문가(Ms) 또는 일반주의자(Sl) 초식 곤충 유충을 사육했습니다(그림 2A). MS/MS 분석을 통해 유충이 잎을 섭취한 후 채취한 잎 조직의 메탄올 추출물에서 599개의 중복되지 않는 MS/MS 스펙트럼(데이터 파일 S1)을 얻었습니다. RDPI, Hj, δj 지수를 사용하여 MS/MS 스펙트럼 파일의 정보 내용 재구성을 시각화한 결과 흥미로운 패턴이 나타났습니다(그림 2B). 전반적인 경향은 정보 설명자에 따르면 유충이 잎을 계속 섭취함에 따라 모든 대사 재구성 정도가 시간이 지남에 따라 증가한다는 것입니다. 초식 곤충이 잎을 섭취한 후 72시간이 지나면 RDPI가 유의미하게 증가했습니다. 손상되지 않은 대조군과 비교했을 때 Hj는 유의미하게 감소했는데, 이는 δj 지수로 정량화된 대사 프로필의 전문화 정도가 증가했기 때문입니다. 이러한 명백한 경향은 OD 이론의 예측과 일치하지만, 대사물질 수준의 무작위적(비방향적) 변화가 방어적 위장으로 사용된다고 보는 MT 이론의 주요 예측과는 일치하지 않습니다(그림 1B). 이 두 초식동물의 구강 분비물(OS) 유도물질 함량과 섭식 행동은 다르지만, 직접적인 섭식은 24시간 및 72시간 수확 기간 동안 Hj와 δj의 방향성 변화에서 유사한 결과를 초래했습니다. 유일한 차이점은 RDPI 72시간에서 나타났습니다. Ms 섭식으로 인한 것과 비교했을 때, Sl 섭식으로 유도된 전체 대사량은 더 높았습니다.
(A) 실험 설계: 일반 돼지(S1) 또는 전문가(Ms) 초식동물에게 탈염 처리된 벌레잡이풀 잎을 먹이로 제공하고, 모의 초식의 경우 Ms의 OS(W + OSMs)를 사용하여 표준화된 잎 위치에 구멍을 뚫어 상처를 냈다. S1 유충(W + OSSl) 또는 물(W + W)을 제공했다. 대조군(C)은 손상되지 않은 잎이다. (B) 특수 대사체 지도(599 MS/MS; 데이터 파일 S1)에 대해 유도성(RDPI를 대조군 차트와 비교), 다양성(Hj 지수) 및 특수화(δj 지수) 지수를 계산했다. 별표는 초식동물 직접 먹이 제공군과 대조군 간의 유의미한 차이를 나타낸다(쌍체 t-검정을 사용한 스튜던트 t-검정, *P<0.05 및 ***P<0.001). ns, 유의미하지 않음. (C) 모의 초식 처리 후 주요 대사산물(파란색 상자: 아미노산, 유기산 및 당; 데이터 파일 S2) 및 특수 대사산물 스펙트럼(빨간색 상자: 443 MS/MS; 데이터 파일 S1)의 시간 분해능 지수. 색상 띠는 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 별표는 처리군과 대조군 간의 유의미한 차이를 나타냅니다[이차 분산 분석(ANOVA) 후 사후 다중 비교를 위한 Tukey의 HSD 검정, *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001]. (D) 산점도 및 특수 대사산물 프로파일의 특수화(다른 처리를 적용한 반복 샘플).
초식동물에 의해 유도된 대사체 수준의 재구성이 개별 대사물질 수준의 변화에 ​​반영되는지 알아보기 위해, 먼저 초식 저항성이 입증된 네펜테스 팔렌스(Nepenthes pallens) 잎에서 이전에 연구된 대사물질에 초점을 맞추었습니다. 페놀 아미드는 곤충의 섭식 과정에서 축적되는 하이드록시신남아미드-폴리아민 접합체로, 곤충의 생존 능력을 저하시키는 것으로 알려져 있습니다(32). 우리는 해당 MS/MS의 전구체를 검색하고 누적 동역학 곡선을 그렸습니다(그림 S1). 예상대로, 클로로겐산(CGA)과 루틴처럼 초식동물에 대한 방어에 직접적으로 관여하지 않는 페놀 유도체는 초식 후 발현이 감소했습니다. 반면, 초식동물은 페놀 아미드를 매우 강력하게 만들 수 있습니다. 두 초식동물의 지속적인 섭식은 페놀 아미드의 여기 스펙트럼이 거의 동일하게 나타나게 했으며, 이러한 패턴은 특히 페놀 아미드의 de novo 합성에서 두드러지게 나타났습니다. 17-하이드록시게라닐 노난디올 디테르펜 글리코사이드(17-HGL-DTGs) 경로를 탐색할 때도 동일한 현상이 관찰될 것입니다. 이 경로는 효과적인 항초식 기능을 가진 다수의 비환형 디테르펜을 생성하며(33), 그중 Ms Feeding with Sl은 유사한 발현 프로파일을 유발했습니다(그림 S1).
초식동물 직접 섭식 실험의 잠재적인 단점은 초식동물의 잎 섭취 속도와 섭식 시간의 차이로 인해 상처와 초식동물에 의한 초식동물 특이적 효과를 제거하기 어렵다는 점입니다. 유도된 잎 대사 반응의 초식동물 종 특이성을 더 잘 해결하기 위해, 우리는 일정한 잎 위치의 표준 천공 W에 갓 채취한 OS(OSM 및 OSS1)를 즉시 적용하여 Ms 및 Sl 유충의 섭식을 모사했습니다. 이 절차를 W + OS 처리라고 하며, 조직 손실 속도 또는 양의 차이로 인한 혼란 효과를 발생시키지 않고 초식동물에 의해 유발되는 반응의 시작 시점을 정확하게 조절함으로써 유도를 표준화합니다(그림 2A)(34). MS/MS 분석 및 계산 파이프라인을 사용하여 이전에 직접 섭식 실험에서 수집한 스펙트럼과 겹치는 443개의 MS/MS 스펙트럼(데이터 파일 S1)을 얻었습니다. 이 MS/MS 데이터 세트에 대한 정보 이론 분석 결과, 초식동물 모사 실험을 통해 잎 특이적 대사체 재프로그래밍이 OS 특이적 유도 효과를 나타내는 것으로 확인되었습니다(그림 2C). 특히, OSS1 처리와 비교했을 때, OSM 처리는 4시간 후 대사체 특이성을 더욱 강화시켰습니다. 주목할 만한 점은, 직접적인 초식동물 섭식 실험 데이터 세트와 비교했을 때, Hj와 δj를 좌표로 사용하여 2차원 공간에서 시각화한 대사 동역학과 모의 초식동물 처리에 따른 대사체 특이성의 시간 경과에 따른 방향성이 일관되게 증가한다는 것입니다(그림 2D). 동시에, 아미노산, 유기산 및 당류의 함량을 정량화하여(데이터 파일 S2), 이러한 대사체 특이성의 표적화된 증가가 모의 초식동물에 대한 반응으로 중심 탄소 대사의 재구성 때문인지 조사했습니다(그림 S2). 이러한 패턴을 더 자세히 설명하기 위해, 앞서 논의한 페놀아미드 및 17-HGL-DTG 경로의 대사 축적 동역학을 추가로 모니터링했습니다. 초식동물에 대한 OS 특이적 유도는 페놀아미드 대사 내에서 차별적인 재배열 패턴으로 변환됩니다(그림 S3). 쿠마린 및 카페오일 부분을 포함하는 페놀아미드는 OSS1에 의해 우선적으로 유도되는 반면, OSM은 페룰릴 접합체의 특이적 유도를 유발합니다. 17-HGL-DTG 경로의 경우, 하류의 말로닐화 및 디말로닐화 생성물에 의한 차별적인 OS 유도가 감지되었습니다(그림 S3).
다음으로, 우리는 초식동물의 로제트 식물 잎을 처리하기 위해 OSM을 사용하는 것을 시뮬레이션하는 시간 경과 마이크로어레이 데이터 세트를 사용하여 OS 유도 전사체 가소성을 연구했습니다. 샘플링 동역학은 기본적으로 이 대사체학 연구에 사용된 동역학과 겹칩니다(35). 시간이 지남에 따라 대사 가소성이 특히 증가하는 대사체 재구성과 비교하여, 우리는 Ms에 의해 유도된 잎에서 일시적인 전사 폭발을 관찰했습니다. 이 시점에서 전사체 유도성(RDPI)과 특수화(δj)는 1시간에 유의미하게 증가했으며, 다양성(Hj)도 유의미하게 증가했습니다. 이 시점에서 BMP1의 발현이 유의미하게 감소한 후 전사체 특수화가 완화되었습니다(그림 S4). 대사 유전자 패밀리(예: P450, 글리코실트랜스퍼라제, BAHD 아실트랜스퍼라제)는 앞서 언급한 초기 고도 특수화 모델에 따라 1차 대사에서 유래한 구조 단위로부터 특수 대사 산물을 조립하는 과정에 참여합니다. 사례 연구로 페닐알라닌 경로를 분석했습니다. 분석 결과, 페놀아미드 대사의 핵심 유전자들이 초식동물에 의해 유인되지 않은 식물에 비해 OS 유도가 매우 높고, 발현 패턴이 밀접하게 연관되어 있음을 확인했습니다. 이 경로의 상류에 있는 전사 인자 MYB8과 구조 유전자 PAL1, PAL2, C4H, 4CL은 전사 개시가 일찍 나타났습니다. 페놀아미드의 최종 합성에 관여하는 아실전달효소인 AT1, DH29, CV86은 장기간에 걸쳐 상향 조절되는 패턴을 보였습니다(그림 S4). 이러한 관찰 결과는 전사체 특수화의 조기 개시와 이후 대사체 특수화의 강화가 서로 연관되어 있으며, 이는 강력한 방어 반응을 유도하는 동시 조절 시스템 때문일 수 있음을 시사합니다.
식물 호르몬 신호 전달의 재구성은 초식 동물 정보를 통합하여 식물의 생리 기능을 재프로그래밍하는 조절 계층 역할을 합니다. 초식 동물 시뮬레이션 후, 주요 식물 호르몬 범주의 누적 변화를 측정하고 이들 간의 시간적 공동 발현을 시각화했습니다[피어슨 상관 계수(PCC) > 0.4](그림 3A). 예상대로 생합성과 관련된 식물 호르몬들이 식물 호르몬 공동 발현 네트워크 내에서 연결되어 있습니다. 또한, 대사 특이성(Si 지수)을 이 네트워크에 매핑하여 다양한 처리에 의해 유도되는 식물 호르몬을 강조했습니다. 초식 동물 특이적 반응은 크게 두 영역으로 나눌 수 있는데, 하나는 JA(생물학적 활성 형태인 JA-Ile) 및 기타 JA 유도체가 가장 높은 Si 점수를 보이는 JA 클러스터이고, 다른 하나는 에틸렌(ET)입니다. 지베렐린은 초식동물 특이성을 중간 정도로만 증가시킨 반면, 사이토키닌, 옥신, 앱시식산과 같은 다른 식물 호르몬은 초식동물에 대한 유도 특이성이 낮았습니다. W + W 단독 사용과 비교했을 때, OS 적용(W + OS)을 통해 JA 유도체의 피크 값이 증폭되어 JA에 대한 강력한 특이적 지표로 변환될 수 있었습니다. 예상치 못하게, 유도물질 함량이 다른 OSM과 OSS1은 유사한 JA 및 JA-Ile 축적을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. OSS1과 달리 OSM은 OSM에 의해 특이적이고 강력하게 유도되는 반면, OSS1은 기저 상처 반응을 증폭시키지 않습니다(그림 3B).
(A) 초식동물에 의한 식물 호르몬 축적 동역학 시뮬레이션의 PCC 계산 기반 공동 발현 네트워크 분석. 노드는 단일 식물 호르몬을 나타내며, 노드의 크기는 처리 간 식물 호르몬에 대한 Si 지수를 나타냅니다. (B) 서로 다른 색상으로 표시된 각 처리에 따른 잎의 JA, JA-Ile 및 ET 축적량: 살구색, W + OSM; 파란색, W + OSSl; 검은색, W + W; 회색, C(대조군). 별표는 처리와 대조군 간의 유의미한 차이를 나타냅니다(이원 분산 분석 후 Tukey HSD 사후 다중 비교, *** P <0.001). (C) JA 생합성 및 인지 스펙트럼 손상(irAOC 및 irCOI1)에서 (C)697 MS/MS(데이터 파일 S1)의 정보 이론 분석과 ET 신호 손상이 있는 ETR1에서 (D)585 MS/MS(데이터 파일 S1)의 정보 이론 분석. 두 가지 모의 초식동물 처리로 유발된 식물 계통과 빈 차량(EV) 대조 식물. 별표는 W+OS 처리와 손상되지 않은 대조 식물 간의 유의미한 차이를 나타냅니다(이원 분산 분석 후 Tukey HSD 사후 다중 비교, *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001). (E) 특수화에 대한 반대의 산점도. 색상은 서로 다른 유전자 변형 계통을 나타내고, 기호는 서로 다른 처리 방법을 나타냅니다. 삼각형: W + OSS1; 사각형: W + OSM; 원: C
다음으로, JA와 ET 생합성(irAOC 및 irACO) 및 인지(irCOI1 및 sETR1)의 핵심 단계에서 약화된 네펜테스(irCOI1 및 sETR1)의 유전자 변형 균주를 사용하여 초식동물에 의한 이 두 식물 호르몬의 대사 재프로그래밍에 대한 상대적 기여도를 분석했습니다. 이전 실험과 일관되게, 빈 운반체(EV) 식물에서 초식동물-OS 유도를 확인했으며(그림 3, C~D), OSM에 의해 Hj 지수가 전반적으로 감소하는 반면 δj 지수는 증가했습니다. 이러한 반응은 OSS1에 의해 유발된 반응보다 더 두드러졌습니다. Hj와 δj를 좌표로 사용한 이중선 그래프는 특정 조절 이상을 보여줍니다(그림 3E). 가장 분명한 경향은 JA 신호가 없는 균주에서 초식동물에 의한 대사체 다양성 및 특수화 변화가 거의 완전히 제거된다는 것입니다(그림 3C). 반면, sETR1 식물에서 나타나는 무증상 ET 인지는 초식동물 대사 변화에 대한 전반적인 영향은 JA 신호전달보다 훨씬 낮지만, OSM과 OSS1 자극 간의 Hj 및 δj 지수 차이를 완화시킨다(그림 3D 및 그림 S5). 이는 JA 신호전달의 핵심 기능 외에도 ET 신호전달이 초식동물의 종 특이적 대사 반응을 미세 조정하는 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 미세 조정 기능과 일관되게, sETR1 식물에서는 전반적인 대사체 유도성에 변화가 없었다. 한편, sETR1 식물과 비교했을 때, irACO 식물은 초식동물에 의한 대사 변화의 전반적인 진폭은 유사했지만, OSM과 OSS1 자극 간의 Hj 및 δj 점수에서 유의미한 차이를 보였다(그림 S5).
초식동물의 종 특이적 반응에 중요한 기여를 하는 특수 대사산물을 식별하고 ET 신호를 통해 이들의 생산을 미세 조정하기 위해, 이전에 개발된 구조적 MS/MS 분석법을 사용했습니다. 이 방법은 MS/MS 단편[정규화된 내적(NDP)]과 중성 손실(NL) 기반 유사성 점수로부터 대사체 패밀리를 재추론하는 이중 클러스터링 방법을 활용합니다. ET 형질전환 계통 분석을 통해 구축된 MS/MS 데이터 세트는 585개의 MS/MS 피크(데이터 파일 S1)를 생성했으며, 이를 클러스터링하여 7개의 주요 MS/MS 모듈(M)로 분류했습니다(그림 4A). 이 모듈 중 일부는 이전에 특성화된 특수 대사산물이 밀집되어 있습니다. 예를 들어, M1, M2, M3, M4 및 M7 모듈은 각각 다양한 페놀 유도체(M1), 플라보노이드 배당체(M2), 아실당(M3 및 M4), 그리고 17-HGL-DTG(M7)가 풍부합니다. 또한, 각 모듈 내 단일 대사산물의 대사 특이적 정보(Si 지수)를 계산하여 Si 분포를 직관적으로 확인할 수 있습니다. 간단히 말해, 초식성 및 유전자형 특이성이 높은 MS/MS 스펙트럼은 높은 Si 값으로 나타나며, 첨도 통계는 오른쪽 꼬리 모서리 부분의 털 분포를 보여줍니다. 이러한 낮은 콜로이드 분포의 한 예로 M1 모듈에서 페놀 아미드가 가장 높은 Si 값을 나타냈습니다(그림 4B). 앞서 언급한 M7 모듈의 초식 유도성 17-HGL-DTG는 중간 정도의 Si 값을 보여 두 OS 유형 간의 중간 정도의 차등 조절을 나타냅니다. 반면, 루틴, CGA, 아실당과 같이 대부분 항상 생성되는 특수 대사산물은 가장 낮은 Si 값을 보입니다. 특수 대사산물 간의 구조적 복잡성과 Si 분포를 더 자세히 분석하기 위해 각 모듈에 대한 분자 네트워크를 구축했습니다(그림 4B). OD 이론의 중요한 예측(그림 1B에 요약됨)은 초식 후 특수 대사산물의 재구성이 특히 방어 가치가 높은 대사산물의 특이성 증가(무작위 분포와는 반대)를 통해 일방향 변화를 초래해야 한다는 것입니다. (MT 이론에서 예측한 방어 대사산물 모드) M1에 축적된 대부분의 페놀 유도체는 곤충의 생존력 저하와 기능적으로 관련되어 있습니다(32). 24시간 후 유도된 잎과 EV 대조 식물의 구성 잎 사이의 M1 대사산물에서 Si 값을 비교했을 때, 초식 곤충에 의한 피해 후 많은 대사산물의 대사 특이성이 유의미하게 증가하는 경향을 보였습니다(그림 4C). Si 값의 특이적 증가는 방어 페놀아미드에서만 감지되었으며, 이 모듈에 공존하는 다른 페놀 및 미지의 대사산물에서는 Si 값의 증가가 감지되지 않았습니다. 이는 OD 이론과 관련된 특수 모델입니다. 초식 곤충에 의한 대사 변화에 대한 주요 예측은 일치합니다. 페놀아미드 스펙트럼의 이러한 특이성이 OS 특이적 ET에 의해 유도되었는지 확인하기 위해, 대사체 Si 지수를 플롯하고 EV 및 sETR1 유전자형에서 OSM과 OSS1 간의 차등 발현 값을 분석했습니다(그림 4D). sETR1에서는 페놀아미드에 의해 유도된 OSM과 OSS1 간의 차이가 크게 감소했습니다. 또한, JA가 부족한 균주에서 수집된 MS/MS 데이터에 이중 클러스터링 방법을 적용하여 JA 조절 대사 특수화와 관련된 주요 MS/MS 모듈을 추론했습니다(그림 S6).
(A) 공유 단편(NDP 유사도) 및 공유 중성 손실(NL 유사도)을 기반으로 한 585개 MS/MS 클러스터링 결과는 모듈(M)이 알려진 화합물 계열 또는 알려지지 않았거나 대사가 불량한 대사산물 구성과 일치함을 보여줍니다. 각 모듈 옆에는 대사산물(MS/MS) 특이도(Si) 분포가 표시됩니다. (B) 모듈형 분자 네트워크: 노드는 MS/MS를 나타내고, 엣지는 NDP(빨간색) 및 NL(파란색) MS/MS 점수(컷오프, > 0.6)를 나타냅니다. 모듈에 따라 색상이 지정된 등급별 대사산물 특이도 지수(Si)(왼쪽)는 분자 네트워크에 매핑됩니다(오른쪽). (C) 24시간 후 정상 상태(대조군) 및 유도 상태(모의 초식동물)의 EV 식물의 모듈 M1: 분자 네트워크 다이어그램(Si 값은 노드 크기이며, 방어 페놀아미드는 파란색으로 강조 표시됨). (D) EV 및 ET 인지가 손상된 스펙트럼 라인 sETR1의 M1 분자 네트워크 다이어그램: 녹색 원형 노드는 페놀 화합물을 나타내고, 노드 크기는 W + OSM과 W + OSS1 처리 간의 유의미한 차이(P 값)를 나타냅니다. CP, N-카페오일-티로신; CS, N-카페오일-스페르미딘; FP, N-페룰산 에스테르-요산; FS, N-페룰릴-스페르미딘; CoP, N', N"-쿠마롤릴-티로신; DCS, N', N"-디카페오일-스페르미딘; CFS, N', N"-카페오일, 페룰로일-스페르미딘; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, O-아실 당.
우리는 분석을 약화된 단일 네펜테스 유전자형에서 자연 개체군으로 확장했는데, 자연 개체군에서는 초식성 JA 수준과 특정 대사산물 수준에서 종내 변화가 강하게 나타나는 것으로 이전에 보고된 바 있다(26). 이 데이터 세트를 사용하여 43개의 유전자원을 분석했다. 이 유전자원은 N. pallens 속의 123종 식물로 구성되어 있다. 이 식물들은 유타, 네바다, 애리조나, 캘리포니아의 다양한 자생지에서 채집한 종자에서 유래했으며(그림 S7), 우리는 대사체 다양성(여기서는 개체군 수준 다양성, β 다양성이라고 함)과 OSM에 의한 특수화를 계산했다. 이전 연구와 일관되게, 우리는 Hj 및 δj 축을 따라 광범위한 대사 변화를 관찰했으며, 이는 유전자원이 초식동물에 대한 대사 반응의 가소성에서 상당한 차이를 보인다는 것을 나타낸다(그림 S7). 이러한 양상은 초식동물에 의한 JA 변화의 동적 범위에 대한 이전 관찰 결과와 유사하며, 단일 개체군에서 매우 높은 값을 유지해왔다(26, 36). JA와 JA-Ile를 사용하여 Hj와 δj 사이의 전반적인 상관관계를 검정한 결과, JA와 대사체 β 다양성 및 특수화 지수 사이에 유의미한 양의 상관관계가 있음을 확인했습니다(그림 S7). 이는 개체군 수준에서 관찰된 초식동물에 의한 JA 유도의 이질성이 곤충 초식동물의 선택에 의해 발생하는 주요 대사 다형성 때문일 수 있음을 시사합니다.
이전 연구에서는 담배 종류가 유도 및 구성적 대사 방어의 유형과 상대적 의존도에서 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 이러한 항초식자 신호 전달 및 방어 능력의 변화는 특정 종이 자라는 생태적 지위에서 곤충 개체군 압력, 식물 생활 주기 및 방어 생산 비용에 의해 조절된다고 여겨집니다. 우리는 북미와 남미 원산의 6개 니코티아나(Nicotiana) 종에 의해 유도된 잎 대사체 재구성의 일관성을 연구했습니다. 이 종들은 북미 네펜테스(Nepenthes North America)와 밀접한 관련이 있으며, 구체적으로는 Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, 선형 담배, 담배(Nicotiana spegazzinii) 및 담배잎 담배(Nicotiana obtusifolia)입니다(그림 5A)(37). 잘 알려진 종인 N. please를 포함한 이들 종 중 6종은 페튜니아 계통의 연간 식물이며, obtusifolia N.은 자매 계통인 Trigonophyllae(38)의 다년생 식물입니다. 이후 곤충 섭식의 종 수준 대사 재배열을 연구하기 위해 이 7종에 대해 W + W, W + OSM 및 W + OSS1 유도를 수행했습니다.
(A) 최대 우도법[핵 글루타민 합성(38)]에 기반한 부트스트랩 계통수와 밀접하게 관련된 7종의 Nicotiana 종의 지리적 분포(서로 다른 색상)(37). (B) 7종의 Nicotiana 종의 대사 프로파일에 대한 특화 다양성의 산점도(939 MS/MS; 데이터 파일 S1). 종 수준에서 대사체 다양성은 특화 정도와 음의 상관관계를 보인다. 대사 다양성과 특화 및 JA 축적 간의 종 수준 상관관계 분석은 그림 2에 나타내었다. S9. 색상은 서로 다른 종류를 나타내며, 삼각형은 W + OSS1, 사각형은 W + OSM을 나타낸다. (C) Nicotiana JA 및 JA-Ile 동역학은 OS 여기 진폭에 따라 순위를 매겼다(이원 분산 분석 및 Tukey HSD 사후 다중 비교, * P <0.05, ** P <0.01 및 ** W + OS와 W + W 비교 시 P <0.001). (D) 다양성 및 (E) 각 종의 특수화에 대한 상자 그림은 초식 동물과 메틸 자스민산(MeJA)을 모사한 결과입니다. 별표는 W + OS와 W + W 또는 라놀린 + W(Lan + W) 또는 Lan + MeJA(Lan + MeJa) 및 Lan 대조군 간의 유의미한 차이를 나타냅니다(이원 분산 분석 후 Tukey의 HSD 사후 다중 비교, *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001).
이중 클러스터링 방법을 사용하여 939개의 MS/MS(데이터 파일 S1)에서 9개의 모듈을 식별했습니다. 다양한 처리에 의해 재구성된 MS/MS의 구성은 종에 따라 모듈별로 크게 다릅니다(그림 S8). Hj(여기서는 종 수준의 γ-다양성으로 지칭)와 δj를 시각화한 결과, 서로 다른 종들이 대사 공간에서 매우 다른 그룹으로 집합되는 것을 알 수 있으며, 일반적으로 종 수준의 구분이 여기보다 더 두드러집니다. N. linear와 N. obliquus를 제외하고는, 이들은 유도 효과의 넓은 동적 범위를 나타냅니다(그림 5B). 대조적으로, N. purpurea와 N. obtusifolia와 같은 종은 처리에 대한 대사 반응이 덜 분명하지만, 대사체는 더 다양합니다. 유도된 대사 반응의 종별 분포는 특화와 감마 다양성 사이에 유의미한 음의 상관관계(PCC = -0.46, P = 4.9×10⁻⁸)를 나타냈습니다. OS에 의해 유도된 JA 수준 변화는 대사체 특이성과 양의 상관관계를 보였으며, 각 종이 나타내는 대사 감마 다양성과는 음의 상관관계를 보였다(그림 5B 및 그림 S9). 그림 5C에서 흔히 "신호 반응" 종으로 불리는 Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, Nepenthes attenuated와 같은 종들은 30분 만에 유의미한 변화를 보였다는 점에 주목할 필요가 있다. 최근 OS 특이적인 JA 및 JA-Ile 발현이 관찰된 반면, Nepenthes mills, Nepenthes powdery, N. obtusifolia와 같이 "신호 비반응"으로 불리는 다른 세균들은 OS 특이성 없이 JA-Ile Edge 유도만 나타냈다(그림 5C). 대사 수준에서, 앞서 언급했듯이, Nepenthes attenuated의 경우 신호 반응 물질은 OS 특이성을 보였으며 δj를 유의미하게 증가시키고 Hj를 감소시켰다. 이러한 OS 특이적 프라이밍 효과는 신호 비반응성 종으로 분류된 종에서는 관찰되지 않았습니다(그림 5, D 및 E). OS 특이적 대사산물은 신호 반응성 종들 사이에서 더 빈번하게 공유되며, 이러한 신호 클러스터는 신호 반응이 약한 종들과 함께 군집을 이루는 반면, 신호 반응이 약한 종들은 상호 의존성이 더 낮습니다(그림 S8). 이 결과는 JA의 OS 특이적 유도와 하위 대사체의 OS 특이적 재구성이 종 수준에서 서로 연관되어 있음을 시사합니다.
다음으로, 메틸 자스민산(MeJA)을 함유한 라놀린 페이스트를 식물에 처리하여 이러한 결합 방식이 식물 세포질에 존재하는 외인성 자스민산(JA)의 가용성에 의해 제한되는지 여부를 조사했습니다. 빠른 탈에스테르화는 JA에 의해 발생합니다. 우리는 JA의 지속적인 공급으로 인해 신호 반응성 종에서 신호 비반응성 종으로 점진적으로 변화하는 동일한 경향을 발견했습니다(그림 5, D 및 E). 요컨대, MeJA 처리는 선형 선충인 N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens 및 N. mikimotoi의 대사체를 강력하게 재구성하여 δj의显著한 증가와 Hj의 감소를 초래했습니다. N. purpurea는 δj만 증가하고 Hj는 증가하지 않았습니다. 이전에 극히 낮은 수준의 JA를 축적하는 것으로 나타난 N. obtusifolia 또한 대사체 재구성 측면에서 MeJA 처리에 대한 반응이 미미했습니다. 이러한 결과는 신호에 반응하지 않는 종에서 JA 생성 또는 신호 전달이 생리적으로 제한됨을 나타냅니다. 이 가설을 검증하기 위해 W + W, W + OSMs 및 W + OSS1 전사체(39)에 의해 유도된 네 종(N. pallens, N. mills, N. pink 및 N. microphylla)을 연구했습니다. 대사체 재구성 패턴과 일관되게, 종들은 전사체 공간에서 잘 분리되었으며, 그중 N. attenuated는 OS 유도 RDPI가 가장 높았고, N. gracilis는 가장 낮았습니다(그림 6A). 그러나 N. oblonga에 의해 유도된 전사체 다양성은 네 종 중에서 가장 낮았는데, 이는 이전에 7종에서 나타난 N. oblonga의 가장 높은 대사체 다양성과는 상반되는 결과입니다. 이전 연구에서는 JA 신호를 포함한 초기 방어 신호와 관련된 유전자 세트가 Nicotiana 종에서 초식동물 관련 유도인자에 의해 유도되는 초기 방어 반응의 특이성을 설명한다는 것을 보여주었습니다(39). 이 네 종의 JA 신호 전달 경로를 비교한 결과 흥미로운 패턴이 나타났습니다(그림 6B). AOC, OPR3, ACX, COI1과 같은 이 경로의 대부분 유전자는 이 네 종 모두에서 비교적 높은 수준으로 유도되었습니다. 그러나 JA를 생물학적으로 활성 형태인 JA-Ile 축적 전사체로 전환하는 핵심 유전자 JAR4의 전사 수준은 특히 N. mills, Nepenthes pieris, N. microphylla에서 매우 낮았습니다. 또한, N. bifidum에서는 또 다른 유전자 AOS의 전사체만 검출되지 않았습니다. 이러한 유전자 발현의 변화는 신호 전달에 반응하지 않는 종에서 낮은 JA 생산으로 인해 나타나는 극단적인 표현형과 N. gracilis의 유도 현상의 원인이 될 수 있습니다.
(A) 초식 유도 30분 후 채취한 네 가지 근연 담배 종의 ​​초기 전사 반응 재프로그래밍에 대한 정보 이론 분석. RDPI는 초식 곤충 OS에 의해 유도된 잎과 상처 대조군을 비교하여 계산하였다. 색상은 서로 다른 종을 나타내고, 기호는 서로 다른 처리 방법을 나타낸다. (B) 네 종 간의 JA 신호 전달 경로 유전자 발현 분석. 단순화된 JA 경로가 상자 그림 옆에 표시되어 있다. 서로 다른 색상은 서로 다른 처리 방법을 나타낸다. 별표는 W + OS 처리와 W + W 대조군 간에 유의미한 차이가 있음을 나타낸다(쌍별 차이에 대한 Student's t-검정, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). OPDA: 12-옥소피토디에노산; OPC-8: 0,3-옥소-2(2′(Z)-펜테닐)-시클로펜탄-1-옥탄산.
마지막 부분에서는 다양한 식물 종의 대사체에 대한 곤충 종 특이적 재구성이 초식 곤충에 대한 저항성에 어떻게 영향을 미치는지 연구했습니다. 이전 연구에서는 Nicotiana 속을 강조했습니다. 이들의 Ms와 유충에 대한 저항성은 크게 다릅니다(40). 여기서는 이 모델과 대사 가소성 사이의 연관성을 연구했습니다. 위의 네 가지 담배 종을 사용하여 초식 곤충에 의해 유발된 대사체의 다양성과 특수화, 그리고 식물의 Ms 및 Sl에 대한 저항성 사이의 상관관계를 검증한 결과, 일반 곤충인 Sl에 대한 저항성, 다양성 및 특수화는 모두 양의 상관관계를 보였습니다. 반면, 전문 곤충인 Sl에 대한 저항성과 특수화 사이의 상관관계는 약했고, 다양성과의 상관관계는 유의미하지 않았습니다(그림 S10). Sl에 대한 저항성과 관련하여, 이전에 JA 신호 전달 수준과 대사체 가소성을 모두 나타내는 것으로 밝혀진 약화된 N. chinensis와 N. gracilis는 초식 곤충 유도에 대해 매우 다른 반응을 보였으며, 유사하게 높은 저항성을 나타냈습니다.
지난 60년간 식물 방어 이론은 연구자들이 식물 특수 대사산물의 진화와 기능에 대해 상당수의 가설을 예측할 수 있도록 이론적 틀을 제공해 왔습니다. 이러한 이론들 대부분은 일반적인 강력한 추론 절차를 따르지 않습니다(41). 이들은 동일한 분석 수준에서 핵심 예측(3)을 제시합니다. 핵심 예측 검증을 통해 특정 이론을 분석할 수 있게 되면, 해당 분야는 발전하게 됩니다. 이 분야는 계속 발전하고 있습니다. 새로운 이론은 서로 다른 분석 수준에서 예측을 제시하고 새로운 차원의 설명적 고려 사항을 추가합니다(42). 그러나 기능적 수준에서 제시된 두 가지 이론인 MT와 OD는 초식동물에 의해 발생하는 특수 대사 변화에 대한 중요한 예측으로 쉽게 설명될 수 있습니다. OD 이론은 특수 대사 "공간"의 변화가 매우 방향성을 띤다고 주장합니다. MT 이론은 이러한 변화가 비방향성을 띠고 대사 공간에 무작위로 위치하며, 방어 가치가 높은 대사산물을 생성하는 경향이 있다고 주장합니다. 이전의 OD 및 MT 예측 검증은 사전에 정의된 제한된 수의 "방어" 화합물을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 대사체 중심적 검증은 초식 활동 중 대사체 재구성의 범위와 궤적을 분석하는 것을 불가능하게 하며, 식물 대사체의 변화를 전체적으로 정량화할 수 있는 핵심 예측을 요구하는 일관된 통계적 틀 내에서 검증하는 것을 허용하지 않습니다. 본 연구에서는 계산 질량 분석(MS) 기반의 대사체학 혁신 기술을 활용하여 정보 이론 기술자의 일반적인 관점에서 디컨볼루션 MS 분석을 수행하고, 전역적 대사체학 수준에서 제안된 두 가지 예측 간의 차이를 검증했습니다. 정보 이론은 생물 다양성 및 영양소 흐름 연구(43)를 비롯한 여러 분야에 적용되어 왔습니다. 그러나 우리가 아는 한, 이는 식물의 대사 정보 공간을 설명하고 환경 신호에 대한 반응으로 발생하는 일시적인 대사 변화와 관련된 생태학적 문제를 해결하기 위해 사용된 최초의 응용 사례입니다. 특히, 이 방법의 강점은 식물 종 내 및 종간 패턴을 비교하여 초식동물이 어떻게 다른 종에서 종간 거시진화 패턴으로 진화해 왔는지, 그리고 이러한 진화적 수준에서의 대사 과정을 살펴볼 수 있다는 점입니다.
주성분 분석(PCA)은 다변량 데이터 세트를 차원 축소 공간으로 변환하여 데이터의 주요 경향을 설명할 수 있도록 해주므로, 일반적으로 대사체 분해와 같은 데이터 세트 분석에 탐색적 기법으로 사용됩니다. 그러나 차원 축소 과정에서 데이터 세트의 정보 내용 일부가 손실될 수 있으며, PCA는 생태 이론과 특히 관련된 특성에 대한 정량적 정보를 제공하지 못합니다. 예를 들어, 초식동물이 특정 분야(예: 종 풍부도, 분포, 개체수)에서 대사물질의 다양성을 어떻게 재구성하는지, 또는 어떤 대사물질이 특정 초식동물의 유도 상태를 예측하는지 등에 대한 정보를 제공하지 못합니다. 본 연구에서는 특이성, 다양성, 유도성 관점에서 잎 특이적 대사물질 프로파일의 정보 내용을 분해하여 초식동물의 섭식이 특정 대사를 활성화시킬 수 있음을 밝혀냈습니다. 예상치 못하게, 구현된 정보 이론 지표에 설명된 대로, 두 초식동물(야간 섭식 잡식성 Sl과 가지과 식물 전문가 Ms)의 공격 후 결과적인 대사 상황이 크게 겹치는 것을 관찰했습니다. 이들의 섭식 행동과 농도는 상당히 다르지만 말입니다. 지방산-아미노산 접합체(FAC) 개시제인 OS(31)를 사용하여 표준화된 자상 치료를 시행한 결과, 모의 초식동물 치료에서도 유사한 경향이 나타났습니다. 초식동물의 공격에 대한 식물의 반응을 모의하는 이 표준화된 절차는 초식동물의 섭식 행동 변화로 인해 발생하는 다양한 정도의 손상 요인을 제거합니다(34). OSM의 주요 원인으로 알려진 FAC는 OSS1에서 JAS 및 기타 식물 호르몬 반응을 감소시키는 반면, OSS1은 수백 배 감소시킵니다(31). 그러나 OSS1은 OSM과 유사한 수준의 JA 축적을 유발했습니다. 약화된 네펜테스에서 JA 반응은 OSM에 매우 민감하며, FAC는 물에 1:1000으로 희석해도 활성을 유지할 수 있음이 이전에 입증되었습니다(44). 따라서 OSM과 비교했을 때 OSS1의 FAC 농도는 매우 낮지만 충분한 JA 생성을 유도하기에 충분합니다. 이전 연구에서는 포린 유사 단백질(45)과 올리고당(46)이 OSS1에서 식물 방어 반응을 유발하는 분자적 단서로 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 OSS1의 이러한 유도 물질이 본 연구에서 관찰된 JA 축적의 원인인지는 아직 불분명합니다.
다양한 초식동물이나 외인성 JA 또는 SA(살리실산)의 적용으로 인한 차별적인 대사적 특징을 기술한 연구는 소수에 불과하지만(47), 초식동물 종 특이적 교란이 식물-풀 네트워크에서 어떻게 작용하는지, 그리고 그것이 특정 개인 정보에 미치는 영향에 대해서는 체계적으로 연구된 바가 없다. 본 분석에서는 JA 이외의 다른 식물 호르몬과의 내부 호르몬 네트워크 연결이 초식동물에 의한 대사 재구성의 특이성을 형성한다는 것을 추가로 확인했다. 특히, OSM에 의해 유발된 ET가 OSS1에 의해 유발된 ET보다 유의미하게 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 양상은 OSM에 FAC 함량이 더 많다는 사실과 일치하며, 이는 ET 급증을 유발하는 필요충분조건이다(48). 식물과 초식동물 간의 상호작용 맥락에서, 식물 특이적 대사물질 역학에 대한 ET의 신호 전달 기능은 여전히 ​​단편적이며 단일 화합물 그룹만을 대상으로 한다. 또한, 대부분의 연구에서는 ET 조절을 연구하기 위해 ET 또는 그 전구체, 혹은 다양한 억제제를 외부에서 적용했는데, 이러한 외부 화학물질 적용은 많은 비특이적 부작용을 유발합니다. 본 연구는 ET를 이용하여 형질전환 식물의 기능 장애를 유발하고 식물 대사체 역학을 조절하는 데 있어 ET의 역할을 체계적으로 대규모로 조사한 최초의 연구입니다. 초식동물 특이적 ET 유도는 궁극적으로 대사체 반응을 조절할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 ET 생합성(ACO) 및 인지(ETR1) 유전자의 형질전환 조작을 통해 초식동물 특이적인 페놀아미드의 신규 축적을 밝혀낸 것입니다. 이전에 ET가 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제(49)를 조절함으로써 JA 유도 니코틴 축적을 미세하게 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나 기계적인 관점에서 ET가 페놀아미드 유도를 어떻게 미세하게 조절하는지는 명확하지 않습니다. ET의 신호 전달 기능 외에도, 대사 흐름은 S-아데노실-1-메티오닌으로 우회되어 폴리아미노페놀 아미드 생성을 조절할 수 있다. S-아데노실-1-메티오닌은 ET와 폴리아민 생합성 경로의 공통 중간체이다. ET 신호가 페놀아미드 수준을 조절하는 기전은 추가적인 연구가 필요하다.
오랫동안 구조가 알려지지 않은 특수 대사산물이 많아 특정 대사 범주에 대한 집중적인 연구에도 불구하고 생물학적 상호작용 후 대사 다양성의 시간적 변화를 엄밀하게 평가하는 데 어려움이 있었습니다. 현재 정보 이론 분석에 따르면, 편향되지 않은 대사산물을 기반으로 한 MS/MS 스펙트럼 획득의 주요 결과는 초식동물이 잎 대사체의 전체적인 다양성을 감소시키는 동시에 특화도를 증가시킨다는 것입니다. 초식동물에 의해 유발되는 이러한 일시적인 대사체 특이성 증가는 전사체 특이성의 상승적 증가와 연관됩니다. 이러한 대사체 특이성 증가에 가장 크게 기여하는 특징(더 높은 Si 값을 갖는 특징)은 이전에 초식 기능이 규명된 특수 대사산물입니다. 이 모델은 OD 이론의 예측과 일치하지만, 대사체 재프로그래밍의 무작위성과 관련된 MT 이론의 예측과는 일치하지 않습니다. 하지만 이 데이터는 혼합 모델(최적 MT, 그림 1B)의 예측과도 일치하는데, 이는 방어 기능이 알려지지 않은 다른 특성화되지 않은 대사산물들이 여전히 무작위적인 Si 분포를 따를 수 있기 때문입니다.
이 연구에서 더욱 주목할 만한 패턴은 미시 진화 수준(단일 식물 및 담배 개체군)에서 더 큰 진화 규모(밀접하게 관련된 담배 종)에 이르기까지 다양한 진화적 조직 수준이 "최선의 방어"에 있어 초식 동물의 능력에 상당한 차이를 보인다는 것입니다. Moore et al.(20)과 Kessler and Kalske(1)는 Whittaker(50)가 원래 구분한 생물 다양성의 세 가지 기능적 수준을 화학적 다양성의 구성적 및 유도적 시간적 변화로 변환하는 것을 독립적으로 제안했습니다. 그러나 이들 저자는 대규모 대사체 데이터 수집 절차를 요약하지 않았으며, 이러한 데이터로부터 대사 다양성을 계산하는 방법도 제시하지 않았습니다. 본 연구에서는 Whittaker의 기능적 분류를 약간 수정하여 α-대사 다양성을 특정 식물의 MS/MS 스펙트럼 다양성으로, β-대사 다양성을 개체군 집단의 기본 종내 대사 공간으로, γ-대사 다양성을 유사종 분석의 확장으로 간주할 것입니다.
JA 신호는 다양한 초식동물의 대사 반응에 필수적입니다. 그러나 종내 JA 생합성 조절이 대사체 다양성에 미치는 영향을 정량적으로 엄밀하게 검증한 연구는 부족하며, JA 신호가 더 높은 거시진화적 규모에서 스트레스 유발 대사 다양화의 일반적인 부위인지 여부도 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 네펜테스 초식성 식물의 초식성이 대사체 특수화를 유도하고, 니코티아나 종 개체군 내 및 근연 니코티아나 종들 간의 대사체 특수화 변이가 JA 신호와 체계적으로 양의 상관관계를 나타낸다는 것을 관찰했습니다. 또한, JA 신호가 손상되면 단일 유전자형 초식동물에 의해 유도된 대사 특이성이 사라집니다(그림 3, C 및 E). 자연적으로 약화된 네펜테스 개체군의 대사 스펙트럼 변화는 대부분 양적인 변화이므로, 본 분석에서 나타난 대사 β 다양성과 특이성의 변화는 대사산물이 풍부한 화합물 범주의 강한 활성화에 기인하는 것으로 추정됩니다. 이러한 화합물 종류는 대사체 프로필의 일부를 지배하며 JA 신호와 양의 상관관계를 나타냅니다.
밀접하게 관련된 담배 종들의 생화학적 메커니즘이 매우 다르기 때문에, 대사산물은 정성적인 측면에서 구체적으로 식별되므로 분석적 접근이 더 용이합니다. 포착된 대사 프로파일에 대한 정보 이론 처리는 초식 동물에 의한 유도가 대사 감마 다양성과 특화 사이의 상충 관계를 악화시킨다는 것을 보여줍니다. JA 신호는 이러한 상충 관계에서 중심적인 역할을 합니다. 대사체 특화의 증가는 주요 OD 예측과 일치하며 JA 신호와 양의 상관관계를 보이는 반면, JA 신호는 대사 감마 다양성과 음의 상관관계를 보입니다. 이러한 모델은 식물의 OD 능력이 미시진화적 규모든 더 큰 진화적 규모든 JA의 가소성에 의해 주로 결정된다는 것을 시사합니다. JA 생합성 결함을 우회하는 외인성 JA 적용 실험은 밀접하게 관련된 담배 종들이 초식 동물에 의해 유도되는 JA 및 대사체 가소성 방식처럼 신호 반응성 종과 비반응성 종으로 구분될 수 있음을 추가로 보여줍니다. 신호에 반응하지 않는 종은 내인성 JA를 생성할 수 없기 때문에 반응하지 못하고 생리적 한계에 직면합니다. 이는 JA 신호 전달 경로의 주요 유전자(N. crescens의 AOS 및 JAR4)의 돌연변이로 인해 발생할 수 있습니다. 이 결과는 이러한 종간 거시진화 패턴이 주로 내부 호르몬 인지 및 반응성의 변화에 ​​의해 좌우될 수 있음을 시사합니다.
식물과 초식동물 간의 상호작용 외에도, 대사 다양성 탐구는 환경에 대한 생물학적 적응 및 복잡한 표현형 형질의 진화 연구에서 중요한 이론적 발전과 밀접하게 관련되어 있습니다. 현대 질량분석기(MS)를 통해 획득되는 데이터 양이 증가함에 따라, 대사 다양성에 대한 가설 검증은 이제 개별/범주별 대사물질의 차이를 넘어 전역적 분석을 수행하여 예상치 못한 패턴을 밝혀낼 수 있게 되었습니다. 대규모 분석 과정에서 중요한 비유는 데이터를 탐색하는 데 사용할 수 있는 의미 있는 지도를 구상하는 것입니다. 따라서, 편향되지 않은 MS/MS 대사체학과 정보 이론의 결합이 가져온 중요한 결과는 다양한 분류학적 규모에서 대사 다양성을 탐색하는 지도를 구축하는 데 사용할 수 있는 간단한 측정 기준을 제공한다는 것입니다. 이는 미시/거시 진화 및 군집 생태학 연구에 있어 이 방법의 기본 요건입니다.
거시진화적 수준에서, Ehrlich와 Raven(51)의 식물-곤충 공진화 이론의 핵심은 종간 대사 다양성의 변이가 식물 계통의 다양화 원인이라는 예측입니다. 그러나 이 선구적인 연구가 발표된 지 50년이 지났지만, 이 가설은 거의 검증되지 않았습니다(52). 이는 주로 장거리 식물 계통에서 유사한 대사 특성을 보이는 계통발생학적 특성 때문입니다. 이러한 희소성은 표적 분석 방법을 고정하는 데 활용될 수 있습니다. 정보 이론에 의해 처리되는 현재의 MS/MS 워크플로는 미지의 대사산물(사전 대사산물 선택 없이)의 MS/MS 구조적 유사성을 정량화하고, 이러한 MS/MS들을 MS/MS 세트로 변환하여 전문적인 대사 분류 체계에서 이러한 거시진화 모델을 비교합니다. 간단한 통계적 지표를 사용하는 이 과정은 사전 예측 없이 서열 정렬을 이용하여 다양화 속도 또는 형질 진화 속도를 정량화할 수 있는 계통발생학적 분석과 유사합니다.
생화학적 수준에서 Firn과 Jones(53)의 스크리닝 가설은 대사 다양성이 이전에 관련이 없거나 대체된 대사 산물의 생물학적 활동을 발휘하기 위한 원료를 제공하기 위해 다양한 수준에서 유지된다는 것을 보여줍니다. 정보 이론 방법은 대사 산물 특수화 중에 발생하는 이러한 대사 산물 특이적 진화적 전환을 제안된 진화적 스크리닝 과정의 일부로 정량화할 수 있는 프레임워크를 제공합니다. 즉, 주어진 환경의 억제된 대사 산물의 낮은 특이성에서 높은 특이성으로의 생물학적 활성 적응입니다.
전반적으로 분자생물학 초기에는 중요한 식물 방어 이론들이 개발되었고, 연역적 가설 기반 방법론이 과학적 진보의 유일한 수단으로 널리 여겨졌습니다. 이는 주로 전체 대사체를 측정하는 기술적 한계 때문입니다. 가설 기반 방법론은 다른 인과 메커니즘을 선택하는 데 특히 유용하지만, 생화학적 네트워크에 대한 이해를 증진시키는 능력은 현대 데이터 집약적 과학에서 사용 가능한 계산 방법론에 비해 제한적입니다. 따라서 예측할 수 없는 이론은 가용 데이터의 범위를 훨씬 벗어나므로 연구 분야의 진보를 위한 가설 공식/검증 주기는 없앨 수 없습니다(4). 본 논문에서 소개하는 대사체학의 계산 워크플로는 대사 다양성의 최근(방법) 및 최종(이유) 문제에 대한 관심을 다시 불러일으키고, 이론에 기반한 데이터 과학의 새로운 시대를 여는 데 기여할 것으로 예상합니다. 이 시대는 이전 세대에 영감을 준 중요한 이론들을 재검토할 것입니다.
초식동물 직접 섭식 실험은 2령 유충 또는 Sl 유충을 꽃이 핀 장미 한 그루의 옅은 색 벌레잡이풀 잎 한 장에 기르는 방식으로 진행되었으며, 각 장미 한 그루당 10개의 반복 실험을 수행했습니다. 곤충 유충은 집게로 고정했고, 감염 후 24시간과 72시간 후에 남은 잎 조직을 채취하여 급속 냉동한 후 대사 물질을 추출했습니다.
고도로 동기화된 방식으로 초식 처리를 시뮬레이션합니다. 이 방법은 직물 화환의 성장 단계에서 식물의 완전히 펼쳐진 세 잎의 중앙맥 양쪽에 세 줄의 가시를 직물 패턴 휠을 사용하여 뚫고 즉시 1:5 희석된 Ms를 적용하거나 장갑을 낀 손가락으로 S1 OS를 뚫은 상처에 삽입하는 것입니다. 위에서 설명한 대로 잎을 수확하고 처리합니다. 이전에 설명한 방법을 사용하여 1차 대사산물과 식물 호르몬을 추출합니다(54).
외인성 JA 적용을 위해 각 종의 장미 개화 식물 6개체에서 잎자루 3개를 채취하여 150μg의 MeJA를 함유한 라놀린 페이스트 20μl(Lan + MeJA), 라놀린과 상처 치료제를 함께 처리한 용액 20μl(Lan + W), 또는 순수 라놀린 20μl를 대조군으로 사용하였다. 잎은 처리 후 72시간 후에 채취하여 액체 질소에 급속 냉동시킨 후 사용 전까지 -80°C에서 보관하였다.
본 연구 그룹에서는 4가지 JA 및 ET 형질전환 라인, 즉 irAOC(36), irCOI1(55), irACO 및 sETR1(48)을 확인했습니다. irAOC는 JA 및 JA-Ile 수준의 감소를 강하게 나타낸 반면, irCOI1은 JA에 민감하지 않았습니다. EV와 비교했을 때 JA-Ile 축적이 증가했습니다. 마찬가지로 irACO는 ET 생성을 감소시키고, EV와 비교했을 때 ET에 민감하지 않은 sETR1은 ET 생성을 증가시킵니다.
광음향 레이저 분광기(Sensor Sense ETD-300 실시간 ET 센서)를 사용하여 비침습적으로 증발산량(ET)을 측정했습니다. 처리 직후 잎의 절반을 잘라 4ml 밀폐 유리병에 옮기고 5시간 동안 공기가 축적되도록 했습니다. 측정하는 동안 각 병에 Sensor Sense에서 제공한 촉매를 통과시켜 이산화탄소와 수분을 제거한 순수 공기를 시간당 2리터의 속도로 8분 동안 주입했습니다.
마이크로어레이 데이터는 원래 (35)에 게시되었으며 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 발현 종합 데이터베이스(접근 번호 GSE30287)에 저장되었습니다. 본 연구에서는 W + OSMs 처리로 인한 잎과 손상되지 않은 대조군에 해당하는 데이터를 추출했습니다. 원시 강도는 log2입니다. 통계 분석 전에 R 소프트웨어 패키지를 사용하여 기준선을 변환하고 75번째 백분위수로 정규화했습니다.
Nicotiana 종의 원본 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 데이터는 NCBI Short Reading Archives(SRA)에서 가져왔으며, 프로젝트 번호는 PRJNA301787이고, Zhou et al.(39)이 보고했으며, (56)에 설명된 대로 진행했습니다. 본 연구에서는 Nicotiana 종에 해당하는 W+W, W+OSM 및 W+OSS1로 처리된 원시 데이터를 분석 대상으로 선택하고 다음과 같이 처리했습니다. 먼저, 원시 RNA-seq 판독값을 FASTQ 형식으로 변환했습니다. HISAT2는 FASTQ를 SAM으로 변환하고, SAMtools는 SAM 파일을 정렬된 BAM 파일로 변환합니다. StringTie를 사용하여 유전자 발현량을 계산했으며, 발현량 계산 방법은 백만 개의 시퀀싱된 전사 조각당 천 개의 염기 조각이 존재한다는 것입니다.
분석에 사용된 Acclaim 크로마토그래피 컬럼(150 mm x 2.1 mm; 입자 크기 2.2 μm)과 4 mm x 4 mm 가드 컬럼은 동일한 재질로 구성되어 있습니다. Dionex UltiMate 3000 UHPLC(초고성능 액체 크로마토그래피) 시스템에서 다음과 같은 이진 그래디언트 조건을 사용했습니다: 0~0.5분, 90% A [탈이온수, 0.1% (v/v) 아세토니트릴 및 0.05% 포름산], 10% B (아세토니트릴 및 0.05% 포름산)의 등용매 조건; 0.5~23.5분, 10% A 및 90% B의 그래디언트 조건; 23.5~25분, 10% A 및 90% B의 등용매 조건. 유속은 400 μl/min입니다. 모든 MS 분석의 경우, 컬럼 용리액을 양이온화 모드(모세관 전압 4500V, 모세관 출구 130V, 건조 온도 200°C, 건조 공기 유량 10리터/분)로 작동하는 전기분무 소스가 장착된 사중극자-시간 비행(qTOF) 분석기에 주입하십시오.
전체 검출 가능한 대사 프로파일에 대한 구조 정보를 얻기 위해 데이터와 관련이 없거나 구별할 수 없는 MS/MS 단편 분석(이하 MS/MS)을 수행합니다. 무차별 MS/MS 방법의 개념은 사중극자가 매우 넓은 질량 분리 창을 가지고 있다는 사실에 기반합니다[따라서 모든 질량 대 전하비(m/z) 신호를 단편으로 간주합니다]. 이러한 이유로 Impact II 장비는 CE 기울기를 생성할 수 없었기 때문에 충돌 유도 분해(CE) 값을 높여 여러 번 독립적인 분석을 수행했습니다. 요약하면, 먼저 단일 질량 분석 모드(소스 내 단편화에 의해 생성된 낮은 단편화 조건)를 사용하여 UHPLC-전기분무 이온화/qTOF-MS로 시료를 분석하고, m/z 50에서 1500까지 5Hz의 반복 주파수로 스캔합니다. MS/MS 분석 시 충돌 가스로 질소를 사용하고, 20, 30, 40, 50 eV의 네 가지 충돌 유도 분해 전압에서 각각 독립적인 측정을 수행합니다. 측정 과정 전반에 걸쳐 사중극자는 m/z 50에서 1500까지의 가장 넓은 질량 분리 범위를 갖습니다. 전면부 m/z 및 분리 폭 실험을 200으로 설정하면 기기 작동 소프트웨어에 의해 질량 범위가 자동으로 활성화되고 0 Da가 설정됩니다. 단일 질량 모드와 동일하게 질량 조각을 스캔합니다. 질량 교정에는 포름산나트륨(이소프로판올 50ml, 포름산 200μl, 1M 수산화나트륨 수용액 1ml)을 사용합니다. Bruker의 고정밀 교정 알고리즘을 사용하여 주어진 시간 간격 동안 평균 스펙트럼을 계산한 후 데이터 파일을 교정합니다. Data Analysis v4.0 소프트웨어(Brook Dalton, Bremen, Germany)의 내보내기 기능을 사용하여 원시 데이터 파일을 NetCDF 형식으로 변환합니다. MS/MS 데이터 세트는 공개 대사체학 데이터베이스인 MetaboLights(www.ebi.ac.uk)에 접근 번호 MTBLS1471로 저장되었습니다.
MS/MS 어셈블리는 낮은 충돌 에너지와 높은 충돌 에너지에 대한 MS1과 MS/MS 품질 신호 간의 상관 분석 및 새롭게 구현된 규칙을 통해 실현될 수 있습니다. R 스크립트는 전구체에서 생성물까지의 분포에 대한 상관 분석을 수행하는 데 사용되며, C# 스크립트(https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline)는 규칙을 구현하는 데 사용됩니다.
배경 잡음으로 인한 오탐 오류와 소수의 샘플에서만 특정 m/z 특징이 검출되어 발생하는 잘못된 상관관계 오류를 줄이기 위해, R 패키지 XCMS의 "filled peak" 함수(배경 잡음 보정용)를 사용하여 "NA"(검출되지 않은 피크) 강도 값을 대체했습니다. 하지만 fill peak 함수를 사용하더라도 데이터 세트에는 여전히 많은 "0" 강도 값이 존재하여 상관관계 계산에 영향을 미칩니다. 따라서 fill peak 함수를 사용했을 때와 사용하지 않았을 때의 데이터 처리 결과를 비교하고, 평균 보정값을 기준으로 배경 잡음 값을 계산한 후, 이러한 0 강도 값을 계산된 배경 잡음 값으로 대체했습니다. 또한, 강도가 배경 잡음 값의 세 배 이상인 특징만을 "참 피크"로 간주했습니다. PCC 계산에는 최소 8개 이상의 참 피크를 포함하는 샘플 전구체(MS1) 및 단편 데이터 세트의 m/z 신호만 사용했습니다.
전체 시료에서 전구체 특성의 강도가 낮은 또는 높은 충돌 에너지에 노출된 동일한 특성의 감소된 강도와 유의미한 상관관계를 보이고, CAMERA에서 해당 특성이 동위원소 피크로 분류되지 않은 경우, 해당 특성을 추가적으로 정의할 수 있습니다. 그런 다음, 3초(피크 유지 시간으로 추정되는 시간 범위) 내의 모든 가능한 전구체-생성물 쌍을 계산하여 상관 분석을 수행합니다. m/z 값이 전구체 값보다 낮고, MS/MS 단편화가 해당 전구체로부터 유래된 데이터 세트 내의 동일한 시료 위치에서 발생할 때만 단편으로 간주합니다.
이 두 가지 간단한 규칙에 따라, 식별된 전구체의 m/z 값보다 큰 m/z 값을 갖는 지정된 조각들을 제외하고, 전구체가 나타나는 시료 위치와 지정된 조각을 기준으로 판단합니다. 또한 MS1 모드에서 생성된 여러 인소스 조각에서 생성된 품질 특징을 후보 전구체로 선택하여 중복된 MS/MS 화합물을 생성할 수도 있습니다. 이러한 데이터 중복을 줄이기 위해, 스펙트럼의 NDP 유사도가 0.6을 초과하고 CAMERA에서 주석 처리된 "pcgroup" 크로마토그램에 속하는 경우, 해당 스펙트럼들을 병합합니다. 마지막으로, 전구체 및 조각과 관련된 네 가지 CE 결과를 모두 병합하여 최종 분해된 합성 스펙트럼을 생성합니다. 이때, 서로 다른 충돌 에너지에서 동일한 m/z 값을 갖는 모든 후보 피크 중에서 가장 높은 강도의 피크를 선택합니다. 이후의 처리 단계는 합성 스펙트럼의 개념을 기반으로 하며, 일부 조각은 특정 충돌 에너지에서만 검출될 수 있으므로, 단편화 확률을 최대화하는 데 필요한 다양한 CE 조건을 고려합니다.
RDPI(30)는 대사 프로파일의 유도 가능성을 계산하는 데 사용되었습니다. 대사 스펙트럼 다양성(Hj 지수)은 Martínez et al.(8)이 설명한 다음 방정식을 사용하여 MS/MS 빈도 분포의 Shannon 엔트로피를 사용하여 MS/MS 전구체의 풍부도에서 파생됩니다. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) 여기서 Pij는 j번째 샘플에서 i번째 MS/MS의 상대 빈도에 해당합니다(j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
대사 특이성(Si 지수)은 고려되는 샘플 간의 빈도에 대한 특정 MS/MS의 발현 동일성으로 정의됩니다. MS/MS 특이성은 Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)로 계산됩니다.
다음 공식을 사용하여 각 j 샘플의 대사체 특이적 δj 지수를 측정하고 MS/MS 특이성의 평균 δj = ∑i = 1mPijSi를 계산하십시오.
MS/MS 스펙트럼은 쌍으로 정렬되고, 두 점수를 기반으로 유사도가 계산됩니다. 먼저, 표준 NDP(코사인 상관 방법이라고도 함)를 사용하여 다음 방정식으로 스펙트럼 간의 세그먼트 유사도를 계산합니다. NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 여기서 S1과 S2는 각각 스펙트럼 1과 스펙트럼 2에 해당하며, WS1, i, WS2는 각각 스펙트럼 1과 스펙트럼 2에 해당합니다. 여기서 i는 두 스펙트럼 간의 i번째 공통 피크의 차이가 0.01 Da 미만일 때 피크 강도를 기준으로 하는 가중치를 나타냅니다. 가중치는 MassBank에서 제안한 대로 W = [피크 강도] m [품질] n (m = 0.5, n = 2)으로 계산됩니다.
두 번째 점수 계산 방법은 MS/MS 간의 공유 NL을 분석하는 것이었습니다. 이를 위해 MS 단편화 과정에서 자주 발견되는 52개의 NL 목록과 약화된 네펜테스 종의 이차 대사산물의 MS/MS 스펙트럼에 대해 이전에 주석이 달린 보다 구체적인 NL(데이터 파일 S1)을 사용했습니다(9, 26). 각 MS/MS에 대해 특정 NL의 존재 여부에 따라 1과 0으로 이루어진 이진 벡터를 생성했습니다. 유클리드 거리 유사도를 기반으로 각 이진 NL 벡터 쌍에 대한 NL 유사도 점수를 계산했습니다.
이중 클러스터링을 수행하기 위해, 우리는 가중 유전자 공동 발현 분석(WGCNA)의 확장을 기반으로 하는 R 패키지 DiffCoEx를 사용했습니다. MS/MS 스펙트럼의 NDP 및 NL 스코어링 행렬을 사용하여 DiffCoEx로 비교 상관 행렬을 계산했습니다. 이진 클러스터링은 "cutreeDynamic" 매개변수를 method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, minClusterSize = 10으로 설정하여 수행했습니다. DiffCoEx의 R 소스 코드는 Tesson et al.(57)의 추가 파일 1에서 다운로드했습니다. 필요한 R WGCNA 소프트웨어 패키지는 https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA에서 찾을 수 있습니다.
MS/MS 분자 네트워크 분석을 수행하기 위해 NDP 및 NL 유사성 유형을 기반으로 쌍별 스펙트럼 연결성을 계산하고, Cytoscape 소프트웨어의 CyFilescape yFiles 레이아웃 알고리즘 확장 프로그램에서 유기적 레이아웃을 사용하여 네트워크 토폴로지를 시각화했습니다.
데이터에 대한 통계 분석은 R 버전 3.0.1을 사용하여 수행했습니다. 통계적 유의성은 이원 분산 분석(ANOVA)을 통해 평가했으며, 사후 검정으로 Tukey의 HSD 검정을 실시했습니다. 초식 동물 처리군과 대조군 간의 차이를 분석하기 위해, 동일한 분산을 갖는 두 집단의 표본에 대한 양측 분포를 Student t 검정을 사용하여 분석했습니다.
본 논문의 추가 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 에서 확인하실 수 있습니다.
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