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먼지 폭풍은 농업, 인간 건강, 교통망 및 사회 기반 시설에 파괴적인 영향을 미치기 때문에 전 세계 여러 국가에 심각한 위협을 가하고 있습니다. 그 결과, 풍식은 지구적인 문제로 여겨지고 있습니다. 풍식을 억제하는 환경 친화적인 방법 중 하나는 미생물 유도 탄산염 침전(MICP)을 이용하는 것입니다. 그러나 요소 분해 기반 MICP는 암모니아와 같은 부산물을 대량으로 생산하기 때문에 바람직하지 않습니다. 본 연구에서는 요소를 생성하지 않고 MICP를 분해할 수 있는 두 가지 포름산칼슘 박테리아 제제를 제시하고, 암모니아를 생성하지 않는 두 가지 아세트산칼슘 박테리아 제제와 성능을 종합적으로 비교했습니다. 사용된 박테리아는 Bacillus subtilis와 Bacillus amyloliquefaciens입니다. 먼저, CaCO3 생성량을 조절하는 인자들의 최적값을 결정했습니다. 그런 다음, 최적화된 제제로 처리한 사구 시료에 대해 풍동 실험을 수행하고 풍식 저항성, 박리 임계 속도 및 모래 충격 저항성을 측정했습니다. 광학 현미경, 주사 전자 현미경(SEM) 및 X선 회절 분석을 이용하여 탄산칼슘(CaCO3) 동질체를 평가하였다. 포름산칼슘 기반 제형은 아세트산칼슘 기반 제형보다 탄산칼슘 생성 측면에서 현저히 우수한 성능을 보였다. 또한, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens)보다 더 많은 탄산칼슘을 생성하였다. SEM 이미지는 침전에 의해 활성 및 비활성 박테리아가 탄산칼슘에 결합 및 각인되는 현상을 명확하게 보여주었다. 모든 제형은 풍식 감소에 유의미한 효과를 나타냈다.
바람 침식은 미국 남서부, 중국 서부, 사하라 사막, 중동 지역 대부분과 같은 건조 및 반건조 지역이 직면한 주요 문제로 오랫동안 인식되어 왔습니다.¹ 건조 및 극건조 기후의 낮은 강수량은 이러한 지역의 상당 부분을 사막, 모래 언덕, 경작되지 않은 땅으로 바꾸어 놓았습니다. 지속적인 바람 침식은 교통망, 농경지, 산업 용지와 같은 기반 시설에 환경적 위협을 가하여 이러한 지역의 생활 환경 악화와 도시 개발 비용 증가로 이어집니다.^2,3,4 더욱 중요한 것은 바람 침식이 발생하는 지역뿐만 아니라, 바람에 의해 입자들이 발생 지점에서 멀리 떨어진 지역으로 운반되어 인근 지역 사회의 건강과 경제적 문제까지 야기한다는 점입니다.^5,6
풍식 방지는 여전히 전 세계적인 문제입니다. 풍식을 제어하기 위해 다양한 토양 안정화 방법이 사용됩니다. 이러한 방법에는 물 살포7, 오일 멀칭8, 바이오폴리머5, 미생물 유도 탄산염 침전(MICP)9,10,11,12 및 효소 유도 탄산염 침전(EICP)1과 같은 재료가 포함됩니다. 토양 습윤은 현장에서 먼지 억제를 위한 표준적인 방법입니다. 그러나 빠른 증발로 인해 건조 및 반건조 지역에서는 효과가 제한적입니다1. 오일 멀칭 화합물을 적용하면 모래의 응집력과 입자 간 마찰력이 증가합니다. 이러한 응집력은 모래 알갱이를 서로 결합시킵니다. 그러나 오일 멀칭은 다른 문제점도 가지고 있습니다. 어두운 색상은 열 흡수를 증가시켜 식물과 미생물의 사멸을 초래할 수 있습니다. 또한 악취와 증기는 호흡기 문제를 일으킬 수 있으며, 가장 큰 문제점은 높은 비용입니다. 바이오폴리머는 최근 풍식 완화를 위해 제안된 친환경적인 방법 중 하나입니다. 바이오폴리머는 식물, 동물, 박테리아와 같은 천연 자원에서 추출됩니다. 잔탄검, 구아검, 키토산, 젤란검은 엔지니어링 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 바이오폴리머입니다.5 그러나 수용성 바이오폴리머는 물에 노출되면 강도가 약해지고 토양에서 용출될 수 있습니다.13,14 EICP(전기화학적 침전)는 비포장 도로, 광미 저수지, 건설 현장 등 다양한 분야에서 효과적인 분진 억제 방법으로 입증되었습니다. EICP의 결과는 고무적이지만, 비용 및 핵 생성 부위 부족(이는 탄산칼슘 결정의 형성 및 침전을 가속화함)과 같은 몇 가지 잠재적인 단점을 고려해야 합니다.15,16
MICP는 19세기 후반 Murray와 Irwin(1890) 및 Steinmann(1901)이 해양 미생물에 의한 요소 분해 연구에서 처음으로 기술했습니다.17 MICP는 다양한 미생물 활동과 화학적 과정을 포함하는 자연 발생적인 생물학적 과정으로, 미생물 대사산물의 탄산 이온이 환경의 칼슘 이온과 반응하여 탄산칼슘이 침전되는 현상입니다.18,19 요소 분해 질소 순환(요소 분해 MICP)을 포함하는 MICP는 미생물 유도 탄산염 침전의 가장 일반적인 유형으로, 박테리아가 생산하는 우레아제가 다음과 같이 요소의 가수분해를 촉매합니다.20,21,22,23,24,25,26,27
유기염 산화의 탄소 순환을 포함하는 MICP(요소 분해 유형이 없는 MICP)에서 종속영양세균은 아세트산, 젖산, 시트르산, 숙신산, 옥살산, 말산 및 글리옥실산과 같은 유기염을 에너지원으로 사용하여 탄산염 광물을 생성합니다.28 탄소원으로 젖산칼슘과 칼슘 이온이 존재할 때 탄산칼슘 형성의 화학 반응은 식 (5)에 나타나 있습니다.
MICP 공정에서 세균 세포는 탄산칼슘 침전에 특히 중요한 핵 생성 부위를 제공합니다. 세균 세포 표면은 음전하를 띠고 있으며 칼슘 이온과 같은 이가 양이온을 흡착할 수 있습니다. 탄산 이온 농도가 충분하면 칼슘 양이온과 탄산 음이온이 반응하여 세균 표면에 탄산칼슘이 침전됩니다.29,30 이 과정은 다음과 같이 요약할 수 있습니다.31,32
생물학적으로 생성된 탄산칼슘 결정은 칼사이트, 바테라이트, 아라고나이트의 세 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 이 중 칼사이트와 바테라이트는 박테리아에 의해 유도되는 가장 흔한 탄산칼슘 동질체입니다.33,34 칼사이트는 열역학적으로 가장 안정한 탄산칼슘 동질체입니다.35 바테라이트는 준안정 상태인 것으로 알려져 있지만, 결국 칼사이트로 변환됩니다.36,37 바테라이트는 이들 결정 중 밀도가 가장 높습니다. 육각형 결정 구조를 가지고 있으며, 크기가 커서 다른 탄산칼슘 결정보다 기공을 채우는 능력이 뛰어납니다.38 요소로 분해된 MICP와 요소로 분해되지 않은 MICP 모두 바테라이트 침전을 유발할 수 있습니다.13,39,40,41
MICP는 문제가 있는 토양이나 풍식에 취약한 토양을 안정화하는 데 유망한 잠재력을 보여주었지만42,43,44,45,46,47,48, 요소 가수분해의 부산물 중 하나인 암모니아는 노출 수준에 따라 경미하거나 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있습니다49. 이러한 부작용 때문에 특히 먼지 억제와 같이 넓은 지역을 처리해야 하는 경우 MICP 기술의 사용에 대한 논란이 있습니다. 또한, 높은 적용률과 대량으로 처리할 경우 암모니아 냄새가 견디기 어려워 실제 적용에 제약이 따릅니다. 최근 연구에서는 암모늄 이온을 스트루바이트와 같은 다른 생성물로 전환하여 줄일 수 있다는 사실이 밝혀졌지만, 이러한 방법으로는 암모늄 이온을 완전히 제거할 수 없습니다50. 따라서 암모늄 이온을 생성하지 않는 대체 솔루션을 모색할 필요가 여전히 있습니다. MICP의 비요소 분해 경로 활용은 풍식 저감 측면에서 아직 충분히 연구되지 않은 잠재적 해결책을 제시할 수 있습니다. Fattahi 등은 아세트산칼슘과 Bacillus megaterium을 이용한 요소 없는 MICP 분해를 연구했고, Mohebbi 등은 아세트산칼슘과 Bacillus amyloliquefaciens를 사용했습니다. 그러나 이들의 연구는 풍식 저항성을 향상시킬 수 있는 다른 칼슘 공급원 및 종속영양세균과의 비교를 포함하지 않았습니다. 또한 풍식 저감 측면에서 요소 없는 분해 경로와 요소 분해 경로를 비교한 연구도 부족합니다.
또한, 대부분의 풍식 및 먼지 제어 연구는 평평한 표면을 가진 토양 샘플을 대상으로 수행되었습니다.1,51,52,53 그러나 자연에서는 평평한 표면보다 언덕이나 움푹 들어간 곳이 더 흔합니다. 이것이 바로 사막 지역에서 모래 언덕이 가장 흔한 지형적 특징인 이유입니다.
앞서 언급한 단점을 극복하기 위해 본 연구에서는 암모니아를 생성하지 않는 새로운 세균 제제를 도입하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 요소 분해를 하지 않는 MICP 경로를 고려했습니다. 두 가지 칼슘 공급원(포름산칼슘과 아세트산칼슘)의 효율성을 조사했습니다. 저자들이 아는 한, 두 가지 칼슘 공급원과 세균 조합(즉, 포름산칼슘-Bacillus subtilis 및 포름산칼슘-Bacillus amyloliquefaciens)을 이용한 탄산염 침전 연구는 이전 연구에서 다루어지지 않았습니다. 이들 세균을 선택한 이유는 포름산칼슘과 아세트산칼슘의 산화 반응을 촉매하여 미생물 탄산염 침전을 생성하는 효소를 생산하기 때문입니다. pH, 세균 및 칼슘 공급원의 종류와 농도, 세균 대 칼슘 공급원 용액의 비율, 양생 시간 등 최적 조건을 찾기 위해 철저한 실험 연구를 설계했습니다. 마지막으로, 탄산칼슘 침전을 통한 풍식 억제에 있어 이러한 박테리아 제제의 효과를 조사하기 위해 모래 언덕에 대한 일련의 풍동 실험을 수행하여 풍식 정도, 임계 파괴 속도 및 모래의 풍압 저항성을 측정하고, 관입계 측정 및 미세구조 연구(예: X선 회절(XRD) 분석 및 주사 전자 현미경(SEM))도 수행하였다.
탄산칼슘 생산에는 칼슘 이온과 탄산 이온이 필요합니다. 칼슘 이온은 염화칼슘, 수산화칼슘, 탈지분유 등 다양한 칼슘 공급원으로부터 얻을 수 있습니다.54,55 탄산 이온은 요소 가수분해, 유기물의 호기성 또는 혐기성 산화 등 다양한 미생물학적 방법을 통해 생산할 수 있습니다.56 본 연구에서는 포름산염과 아세트산염의 산화 반응을 통해 탄산 이온을 얻었습니다. 또한, 포름산염과 아세트산염의 칼슘염을 사용하여 순수한 탄산칼슘을 생산함으로써 CO2와 H2O만 부산물로 얻었습니다. 이 공정에서는 한 가지 물질만 칼슘 공급원과 탄산 이온 공급원으로 사용되며, 암모니아가 생성되지 않습니다. 이러한 특징들은 본 연구에서 제시한 칼슘 공급원 및 탄산 이온 생산 방법을 매우 유망하게 만듭니다.
포름산칼슘과 아세트산칼슘이 탄산칼슘을 형성하는 반응은 식 (7)-(14)에 나타나 있다. 식 (7)-(11)은 포름산칼슘이 물에 용해되어 포름산 또는 포름산염을 형성함을 보여준다. 따라서 이 용액은 자유 칼슘 이온과 수산화 이온의 공급원이 된다(식 8 및 9). 포름산의 산화 결과로 포름산의 탄소 원자는 이산화탄소로 변환된다(식 10). 최종적으로 탄산칼슘이 형성된다(식 11 및 12).
마찬가지로 탄산칼슘은 아세트산칼슘으로부터 형성됩니다(식 13-15). 단, 포름산 대신 아세트산이나 아세트산이 형성됩니다.
효소가 없으면 아세트산과 포름산은 실온에서 산화될 수 없습니다. FDH(포름산 탈수소효소)와 CoA(보조효소 A)는 각각 포름산과 아세트산을 산화시켜 이산화탄소를 생성하는 반응을 촉매합니다(식 16, 17) 57, 58, 59. 다양한 박테리아가 이러한 효소를 생산할 수 있으며, 본 연구에서는 종속영양 박테리아인 Bacillus subtilis(PTCC #1204(페르시아 유형 배양 컬렉션), NCIMB #13061(국제 박테리아, 효모, 파지, 플라스미드, 식물 종자 및 식물 세포 조직 배양 컬렉션))와 Bacillus amyloliquefaciens(PTCC #1732, NCIMB #12077)를 사용했습니다. 이들 박테리아는 육류 펩톤(5g/L)과 육류 추출물(3g/L)을 함유한 영양 배지(NBR)(105443 Merck)에서 배양되었습니다.
따라서 두 가지 칼슘 공급원과 두 가지 박테리아를 사용하여 탄산칼슘 침전을 유도하기 위해 네 가지 제형을 준비했습니다. 즉, 포름산칼슘과 바실러스 서브틸리스(FS), 포름산칼슘과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(FA), 아세트산칼슘과 바실러스 서브틸리스(AS), 그리고 아세트산칼슘과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(AA)를 사용했습니다.
실험 설계의 첫 번째 단계에서는 탄산칼슘 생산량을 최대화할 수 있는 최적의 조합을 결정하기 위한 시험을 수행했습니다. 토양 시료에 탄산칼슘이 함유되어 있었기 때문에, 다양한 조합에서 생성된 CaCO3의 양을 정확하게 측정하기 위한 예비 평가 시험을 설계하고 배양액과 칼슘 공급원 용액의 혼합물을 평가했습니다. 위에서 정의한 각 칼슘 공급원과 박테리아 용액 조합(FS, FA, AS, AA)에 대해 최적화 인자(칼슘 공급원 농도, 숙성 시간, 용액의 광학 밀도(OD)로 측정한 박테리아 용액 농도, 칼슘 공급원 대 박테리아 용액 비율, pH)를 도출하고, 이를 다음 절에서 설명하는 사구 처리 풍동 시험에 사용했습니다.
각 조합에 대해 150회의 실험을 수행하여 CaCO3 침전의 효과를 연구하고 유기물의 호기성 산화 과정에서 칼슘 공급원 농도, 경화 시간, 세균 OD 값, 칼슘 공급원 대 세균 용액 비율 및 pH와 같은 다양한 요인을 평가했습니다(표 1). 최적화된 공정의 pH 범위는 Bacillus subtilis와 Bacillus amyloliquefaciens의 성장 곡선을 기반으로 하여 더 빠른 성장을 얻을 수 있도록 선정했습니다. 이에 대한 자세한 설명은 결과 섹션에서 확인할 수 있습니다.
최적화 단계에 사용할 시료는 다음과 같은 단계를 거쳐 준비했습니다. 먼저 배양액의 초기 pH를 조절하여 MICP 용액을 제조한 후, 121°C에서 15분간 고압멸균했습니다. 그런 다음, 균주를 층류 기류 하에 접종하고 30°C, 180rpm의 진탕 배양기에서 배양했습니다. 세균의 OD가 목표 수준에 도달하면, 원하는 비율로 칼슘 공급원 용액과 혼합했습니다(그림 1a). MICP 용액을 30°C, 220rpm의 진탕 배양기에서 목표 시간 동안 반응시켜 침전시켰습니다. 생성된 CaCO3 침전물은 6000g에서 5분간 원심분리한 후 40°C에서 건조하여 칼슘계 측정용 시료를 준비했습니다(그림 1b). 이후, 베르나르 탄산칼슘계(Bernard calcimeter)를 이용하여 탄산칼슘(CaCO3) 침전량을 측정하였다. 이 계측기에서 CaCO3 분말은 1.0 N HCl(ASTM-D4373-02)과 반응하여 CO2를 생성하며, 이 기체의 부피가 CaCO3 함량을 나타내는 척도가 된다(그림 1c). CO2의 부피를 CaCO3 함량으로 변환하기 위해, 순수한 CaCO3 분말을 1 N HCl로 세척하고 생성된 CO2의 부피에 대해 그래프를 그려 검량곡선을 작성하였다. 침전된 CaCO3 분말의 형태와 순도는 SEM 이미지와 XRD 분석을 통해 조사하였다. 1000배율의 광학 현미경을 사용하여 박테리아 주변의 탄산칼슘 형성, 형성된 탄산칼슘의 상, 그리고 박테리아의 활성을 관찰하였다.
데제그 분지는 이란 파르스 주 남서부에 위치한, 풍식 작용이 심하게 일어난 지역으로 잘 알려져 있습니다. 연구진은 이 지역에서 풍식된 토양 샘플을 채취했습니다. 샘플은 토양 표면에서 채취했습니다. 토양 샘플에 대한 지표 분석 결과, 토양은 실트가 섞인 불량 입도 사질토로, 통일토양분류체계(USC)에 따라 SP-SM으로 분류되었습니다(그림 2a). X선 회절(XRD) 분석 결과, 데제그 토양은 주로 방해석과 석영으로 구성되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 2b). 또한, 에너지 분산 X선 분광법(EDX) 분석 결과, 알루미늄(Al), 칼륨(K), 철(Fe) 등의 다른 원소들도 소량 존재함을 확인했습니다.
풍식 시험을 위한 실험실 모래 언덕을 제작하기 위해, 170mm 높이에서 직경 10mm의 깔때기를 통해 토양을 단단한 표면까지 분쇄하여 높이 60mm, 직경 210mm의 전형적인 모래 언덕을 만들었습니다. 자연에서 가장 밀도가 낮은 모래 언덕은 풍성 작용에 의해 형성됩니다. 마찬가지로, 위의 절차로 제작된 시료는 가장 낮은 상대 밀도(γ = 14.14 kN/m³)를 가지며, 약 29.7°의 안식각으로 수평면에 놓인 모래 원뿔 형태를 나타냅니다.
이전 절에서 얻은 최적의 MICP 용액을 1, 2, 3 μm⁻²의 적용률로 사구 경사면에 분사한 다음, 시료를 30°C의 인큐베이터(그림 3)에 9일 동안(즉, 최적 경화 시간) 보관한 후 풍동 시험을 위해 꺼냈다.
각 처리 조건에 대해 4개의 시편을 제작했는데, 하나는 관입계를 사용하여 탄산칼슘 함량과 표면 강도를 측정하는 데 사용했고, 나머지 3개는 서로 다른 세 가지 풍속에서 침식 시험에 사용했습니다. 풍동 시험에서는 다양한 풍속에서 침식량을 측정하고, 침식량 대 풍속 그래프를 이용하여 각 처리 시편의 임계 파괴 속도를 결정했습니다. 풍식 시험 외에도, 처리된 시편에 모래 충격 시험(즉, 도약 실험)을 실시했습니다. 이를 위해 2L m⁻² 및 3L m⁻²의 적용량으로 두 개의 추가 시편을 제작했습니다. 모래 충격 시험은 120g m⁻¹의 유량으로 15분 동안 진행했는데, 이는 이전 연구⁶⁰,⁶¹,⁶²에서 선택된 값의 범위 내에 있습니다. 연마제 노즐과 모래언덕 바닥 사이의 수평 거리는 800mm였으며, 노즐은 풍동 바닥에서 100mm 위에 위치했습니다. 이 위치는 도약하는 모래 입자의 거의 전부가 모래언덕에 떨어지도록 설정했습니다.
풍동 실험은 길이 8m, 폭 0.4m, 높이 1m의 개방형 풍동에서 수행되었다(그림 4a). 풍동은 아연 도금 강판으로 제작되었으며 최대 25m/s의 풍속을 발생시킬 수 있다. 또한, 주파수 변환기를 사용하여 팬 주파수를 조절하고 목표 풍속에 도달할 때까지 주파수를 점진적으로 증가시켰다. 그림 4b는 풍식된 모래 언덕의 개략도와 풍동에서 측정된 풍속 분포를 보여준다.
마지막으로, 본 연구에서 제안한 비요소분해성 MICP 제형의 결과를 요소분해성 MICP 대조 시험 결과와 비교하기 위해, 요소, 염화칼슘 및 Sporosarcina pasteurii(Sporosarcina pasteurii는 우레아제 생성 능력이 뛰어나기 때문63)를 함유한 생물학적 용액으로 사구 시료를 처리하였다. 세균 용액의 광학 밀도는 1.5였고, 요소와 염화칼슘의 농도는 1M이었다(이전 연구36,64,65에서 권장된 값을 기준으로 선택). 배양 배지는 영양 배지(8g/L)와 요소(20g/L)로 구성되었다. 세균 용액을 사구 표면에 분사하고 24시간 동안 세균 부착을 위해 방치하였다. 24시간 부착 후, 접착 용액(염화칼슘과 요소)을 분사하였다. 이 요소분해성 MICP 대조 시험을 이하 UMC로 칭한다. 요소분해 처리 및 비처리 토양 시료의 탄산칼슘 함량은 Choi et al.66이 제안한 절차에 따라 세척하여 얻었다.
그림 5는 초기 pH 범위가 5~10인 배양액(영양액)에서 Bacillus amyloliquefaciens와 Bacillus subtilis의 성장 곡선을 보여준다. 그림에서 볼 수 있듯이, Bacillus amyloliquefaciens는 pH 6~8에서, Bacillus subtilis는 pH 7~9에서 가장 빠르게 성장했다. 따라서 최적화 단계에서는 이 pH 범위를 채택하였다.
(a) 바실러스 아밀로리퀴파시엔스와 (b) 바실러스 서브틸리스의 배양액 초기 pH 값 변화에 따른 성장 곡선.
그림 6은 베르나르 석회계에서 생성된 이산화탄소의 양을 보여주는데, 이는 침전된 탄산칼슘(CaCO₃)을 나타냅니다. 각 조합에서 한 가지 요인은 고정하고 다른 요인들을 변화시켰기 때문에, 그래프의 각 점은 해당 실험에서 생성된 이산화탄소의 최대 부피를 나타냅니다. 그림에서 볼 수 있듯이, 칼슘 공급원의 농도가 증가함에 따라 탄산칼슘 생성량도 증가했습니다. 따라서 칼슘 공급원의 농도는 탄산칼슘 생성량에 직접적인 영향을 미칩니다. 칼슘 공급원과 탄소 공급원이 동일한 경우(즉, 포름산칼슘과 아세트산칼슘), 칼슘 이온이 더 많이 방출될수록 더 많은 탄산칼슘이 생성됩니다(그림 6a). AS 및 AA 조성물에서는 경화 시간이 증가함에 따라 탄산칼슘 생성량이 계속 증가하다가 9일 후에는 침전량이 거의 변화가 없었습니다. FA 조성물에서는 경화 시간이 6일을 초과하면 탄산칼슘 생성 속도가 감소했습니다. 다른 조성물과 비교했을 때, FS 조성물은 3일 후 상대적으로 낮은 탄산칼슘 생성 속도를 보였습니다(그림 6b). FA 및 FS 제형에서는 3일 후 총 탄산칼슘 생성량의 70%와 87%가 얻어진 반면, AA 및 AS 제형에서는 이 비율이 각각 약 46%와 45%에 불과했습니다. 이는 포름산 기반 제형이 아세트산 기반 제형에 비해 초기 단계에서 탄산칼슘 생성 속도가 더 높다는 것을 나타냅니다. 그러나 생성 속도는 경화 시간이 증가함에 따라 느려집니다. 그림 6c에서 알 수 있듯이, 세균 농도가 OD1 이상일지라도 탄산칼슘 생성에 대한 유의미한 기여는 없습니다.
베르나르 석회계로 측정한 CO2 부피 변화(및 이에 상응하는 CaCO3 함량)는 (a) 칼슘 공급원 농도, (b) 응결 시간, (c) OD, (d) 초기 pH, (e) 칼슘 공급원과 박테리아 용액의 비율(각 조성물에 대해)의 함수로 나타냈으며, (f) 각 칼슘 공급원과 박테리아 조합에 대해 생성된 최대 탄산칼슘량을 나타냈다.
배지의 초기 pH 영향과 관련하여 그림 6d는 FA와 FS의 경우 pH 7에서 CaCO3 생성량이 최대값을 나타냈음을 보여줍니다. 이는 FDH 효소가 pH 7~6.7에서 가장 안정적이라는 기존 연구 결과와 일치합니다. 그러나 AA와 AS의 경우 pH가 7을 초과하면 CaCO3 침전량이 증가했습니다. 기존 연구에서도 CoA 효소 활성의 최적 pH 범위는 8~9.2~6.8인 것으로 나타났습니다. CoA 효소 활성과 B. amyloliquefaciens 성장의 최적 pH 범위가 각각 (8~9.2)와 (6~8)임을 고려할 때(그림 5a), AA 제제의 최적 pH는 8일 것으로 예상되며, 두 pH 범위는 겹칩니다. 이러한 사실은 그림 6d에 나타낸 실험을 통해 확인되었습니다. B. subtilis의 최적 성장 pH는 7-9(그림 5b)이고 CoA 효소 활성의 최적 pH는 8-9.2이므로, 최대 CaCO3 침전 수율은 pH 8-9 범위에서 나타날 것으로 예상되며, 이는 그림 6d에서 확인됩니다(즉, 최적 침전 pH는 9). 그림 6e의 결과는 아세트산 및 포름산 용액 모두에서 칼슘 공급원 용액과 세균 용액의 최적 비율이 1임을 보여줍니다. 비교를 위해, 다양한 조성(AA, AS, FA, FS)의 성능을 다양한 조건(칼슘 공급원 농도, 경화 시간, OD, 칼슘 공급원 대 세균 용액 비율, 초기 pH)에서 최대 CaCO3 생성량을 기준으로 평가했습니다. 연구된 조성 중 FS 조성이 가장 높은 CaCO3 생성량을 보였으며, 이는 AA 조성의 약 3배에 해당합니다(그림 6f). 두 가지 칼슘 공급원에 대해 세균이 없는 대조 실험을 4회 수행한 결과, 30일 후에도 CaCO3 침전은 관찰되지 않았습니다.
모든 제형의 광학 현미경 이미지에서 탄산칼슘이 형성된 주된 상은 바테라이트(vaterite)인 것으로 나타났습니다(그림 7). 바테라이트 결정은 구형이었습니다.69,70,71 세균 세포 표면이 음전하를 띠고 있어 이가 양이온을 흡착할 수 있기 때문에 탄산칼슘이 세균 세포 표면에 침전되는 것으로 밝혀졌습니다. 본 연구에서 제형 FS를 예로 들면, 24시간 후 일부 세균 세포 표면에 탄산칼슘이 형성되기 시작했고(그림 7a), 48시간 후에는 탄산칼슘으로 코팅된 세균 세포의 수가 현저히 증가했습니다. 또한, 그림 7b에서 볼 수 있듯이 바테라이트 입자도 검출되었습니다. 마지막으로, 72시간 후에는 많은 세균이 바테라이트 결정에 결합된 것으로 보이며, 바테라이트 입자의 수도 크게 증가했습니다(그림 7c).
시간에 따른 FS 조성물 내 CaCO3 침전물의 광학 현미경 관찰: (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간.
침전물의 형태를 더 자세히 조사하기 위해 분말에 대한 X선 회절(XRD) 및 주사전자현미경(SEM) 분석을 수행했습니다. XRD 스펙트럼(그림 8a)과 SEM 미세사진(그림 8b, c)은 양상추 모양을 하고 있는 바테라이트 결정의 존재를 확인시켜 주었으며, 바테라이트 피크와 침전물 피크 사이의 상관관계가 관찰되었습니다.
(a) 생성된 CaCO3와 바테라이트의 X선 회절 스펙트럼 비교. (b) 1 kHz 및 (c) 5.27 kHz 배율에서 촬영한 바테라이트의 SEM 미세사진.
풍동 실험 결과는 그림 9a, b에 나타나 있다. 그림 9a에서 볼 수 있듯이, 처리되지 않은 모래의 임계 침식 속도(TDV)는 약 4.32m/s이다. 1l/m²의 시비량(그림 9a)에서, FA, FS, AA 및 UMC 분획의 토양 유실률 선의 기울기는 처리되지 않은 사구의 기울기와 거의 동일하다. 이는 해당 시비량에서는 처리가 효과적이지 않으며, 풍속이 TDV를 초과하는 순간 얇은 토양 표면층이 사라지고 사구 침식률이 처리되지 않은 사구와 동일해짐을 나타낸다. AS 분획의 침식 기울기 또한 가로축 값(즉, TDV)이 더 낮은 다른 분획보다 낮다(그림 9a). 그림 9b의 화살표는 최대 풍속 25m/s에서 2l/m² 및 3l/m²의 시비량으로 처리된 사구에서는 침식이 발생하지 않았음을 나타낸다. 즉, FS, FA, AS 및 UMC의 경우, CaCO₃ 침전으로 인한 풍식에 대한 저항성은 최대 풍속(즉, 25m/s)에서보다 2 및 3l/m²의 적용률에서 더 높았습니다. 따라서 이 실험에서 얻은 25m/s의 TDV 값은 그림 9b에 나타낸 적용률에 대한 하한값이며, AA의 경우 TDV가 최대 풍동 속도와 거의 같습니다.
풍식 시험 (a) 풍속에 따른 중량 감소 (적재량 1 l/m2), (b) 도포량 및 제형(CA는 아세트산칼슘, CF는 포름산칼슘)에 따른 임계 파괴 속도.
그림 10은 모래 충격 시험 후 다양한 제형과 적용량으로 처리된 사구의 표면 침식을 보여주고, 정량적 결과는 그림 11에 나타나 있습니다. 처리하지 않은 시료는 모래 충격 시험 중 완전히 침식되어(총 질량 손실) 저항성이 없었기 때문에 그림에 나타내지 않았습니다. 그림 11에서 알 수 있듯이, 생물 조성물 AA로 처리한 시료는 2 l/m2의 적용량에서 무게의 83.5%를 손실한 반면, 다른 모든 시료는 모래 충격 과정에서 30% 미만의 침식을 보였습니다. 적용량을 3 l/m2로 증가시켰을 때, 모든 처리 시료는 무게의 25% 미만을 손실했습니다. 두 적용량 모두에서 화합물 FS가 모래 충격에 대한 가장 우수한 저항성을 보였습니다. FS와 AA로 처리한 시료의 최대 및 최소 모래 충격 저항성은 CaCO3 침전량의 최대 및 최소값에 기인합니다(그림 6f).
유량 2 및 3 l/m2에서 서로 다른 조성의 모래 언덕에 대한 풍향 충격 결과 (화살표는 풍향을 나타내고, 십자 표시는 그림 평면에 수직인 풍향을 나타냅니다).
그림 12에서 볼 수 있듯이, 모든 제형의 탄산칼슘 함량은 시비량이 1 L/m²에서 3 L/m²로 증가함에 따라 증가했습니다. 또한, 모든 시비량에서 탄산칼슘 함량이 가장 높은 제형은 FS였고, 그 다음으로 FA, UMC 순이었습니다. 이는 이러한 제형들이 더 높은 표면 저항성을 가질 수 있음을 시사합니다.
그림 13a는 투수계 측정법으로 측정한 미처리, 대조군 및 처리 토양 시료의 표면 저항 변화를 보여줍니다. 이 그림에서 UMC, AS, FA 및 FS 제형의 표면 저항은 시비량이 증가함에 따라 유의하게 증가했음을 알 수 있습니다. 그러나 AA 제형의 경우 표면 강도 증가는 상대적으로 미미했습니다. 그림에서 볼 수 있듯이, 요소 분해되지 않은 MICP의 FA 및 FS 제형은 요소 분해된 MICP에 비해 표면 투수성이 더 우수합니다. 그림 13b는 토양 표면 저항에 따른 TDV(총 탈착 속도)의 변화를 보여줍니다. 이 그림에서 표면 저항이 100kPa보다 큰 사구의 경우, 임계 탈착 속도가 25m/s를 초과함을 분명히 알 수 있습니다. 현장 표면 저항은 투수계를 이용하여 쉽게 측정할 수 있으므로, 이러한 정보는 풍동 실험 없이도 TDV를 추정하는 데 도움이 되어 현장 적용의 품질 관리 지표로 활용될 수 있습니다.
SEM 분석 결과는 그림 14에 나타나 있다. 그림 14a-b는 처리되지 않은 토양 시료의 확대된 입자를 보여주는데, 이는 시료가 응집성을 가지며 자연적인 결합이나 시멘트화 작용이 없음을 명확히 보여준다. 그림 14c는 요소 분해 MICP로 처리한 대조 시료의 SEM 미세사진이다. 이 이미지에서는 방해석 동질체 형태의 CaCO₃ 침전물이 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 그림 14d-o에서 볼 수 있듯이, 침전된 CaCO₃는 입자들을 서로 결합시키고 있으며, SEM 미세사진에서 구형의 바테라이트 결정도 확인할 수 있다. 본 연구와 이전 연구 결과들은 바테라이트 동질체 형태로 형성된 CaCO₃ 결합이 상당한 기계적 강도를 제공할 수 있음을 보여준다. 본 연구 결과에 따르면 표면 저항은 350 kPa까지 증가하고, 임계 분리 속도는 4.32 m/s에서 25 m/s 이상으로 증가했다. 이 결과는 MICP 침전 CaCO3의 매트릭스가 적절한 기계적 강도와 풍식 저항성을 지닌 바테라이트라는 이전 연구 결과와 일치하며, 현장 환경 조건에 180일 동안 노출된 후에도 적절한 풍식 저항성을 유지할 수 있습니다.13,40
(a, b) 미처리 토양의 SEM 미세사진, (c) MICP 요소 분해 대조군, (df) AA 처리 시료, (gi) AS 처리 시료, (jl) FA 처리 시료, (mo) FS 처리 시료 (시행률 3 L/m2)를 다양한 배율로 촬영한 사진.
그림 14d-f는 AA 화합물로 처리한 후 모래 알갱이 표면과 알갱이 사이에 탄산칼슘이 침전되었으며, 코팅되지 않은 모래 알갱이도 일부 관찰되었음을 보여줍니다. AS 성분의 경우, 생성된 CaCO3의 양은 크게 증가하지 않았지만(그림 6f), CaCO3로 인한 모래 알갱이 사이의 접촉량은 AA 화합물에 비해 현저히 증가했습니다(그림 14g-i).
그림 14j-l과 14m-o에서 알 수 있듯이, 칼슘 공급원으로 포름산칼슘을 사용하면 AS 화합물에 비해 CaCO3 침전량이 더욱 증가하며, 이는 그림 6f의 칼슘 측정 결과와 일치합니다. 이렇게 추가된 CaCO3는 주로 모래 입자에 침전되며 접촉 품질을 반드시 개선하는 것은 아닙니다. 이는 이전에 관찰된 결과, 즉 CaCO3 침전량의 차이(그림 6f)에도 불구하고 세 가지 조성물(AS, FA 및 FS)이 풍성 저항성(그림 11) 및 표면 저항성(그림 13a) 측면에서 큰 차이를 보이지 않는다는 것을 확인시켜 줍니다.
CaCO3로 코팅된 세균 세포와 침전된 결정에 남은 세균의 흔적을 더 잘 시각화하기 위해 고배율 SEM 이미지를 촬영했으며, 그 결과는 그림 15에 나타나 있습니다. 그림에서 볼 수 있듯이, 탄산칼슘은 세균 세포 표면에 침전되어 침전에 필요한 핵을 제공합니다. 또한 이 그림은 CaCO3에 의해 유도된 활성 및 비활성 결합을 보여줍니다. 비활성 결합의 증가가 기계적 특성의 추가적인 향상으로 이어지는 것은 아니라는 결론을 내릴 수 있습니다. 따라서 CaCO3 침전량 증가가 반드시 기계적 강도 증가로 이어지는 것은 아니며, 침전 패턴이 중요한 역할을 합니다. 이 점은 Terzis와 Laloui72, 그리고 Soghi와 Al-Kabani45,73의 연구에서도 다루어졌습니다. 침전 패턴과 기계적 강도 사이의 관계를 더 자세히 알아보기 위해서는 µCT 이미징을 이용한 MICP 연구가 권장되지만, 이는 본 연구의 범위를 벗어납니다(즉, 암모니아가 없는 MICP를 위해 다양한 칼슘 공급원과 세균 조합을 도입하는 것).
CaCO3는 (a) AS 조성물 및 (b) FS 조성물로 처리된 시료에서 활성 및 비활성 결합을 유도했으며 침전물에 박테리아 세포의 흔적을 남겼습니다.
그림 14j-o 및 15b에서 볼 수 있듯이, CaCO₃ 막이 존재합니다(EDX 분석 결과, 막의 각 원소 구성 비율은 탄소 11%, 산소 46.62%, 칼슘 42.39%이며, 이는 그림 16의 CaCO₃ 비율과 매우 유사합니다). 이 막은 바테라이트 결정과 토양 입자를 덮어 토양-퇴적물 시스템의 안정성을 유지하는 데 도움을 줍니다. 이러한 막은 포름산염 기반 제형으로 처리한 시료에서만 관찰되었습니다.
표 2는 이전 연구와 본 연구에서 요소 분해 및 비요소 분해 MICP 경로로 처리한 토양의 표면 강도, 임계 박리 속도 및 생물학적으로 유도된 CaCO3 함량을 비교합니다. MICP 처리된 사구 시료의 풍식 저항성에 대한 연구는 제한적입니다. Meng 등은 낙엽 송풍기를 사용하여 MICP 처리된 요소 분해 사구 시료의 풍식 저항성을 조사했지만,¹³ 본 연구에서는 비요소 분해 사구 시료(및 요소 분해 대조군)를 풍동에서 테스트하고 네 가지 다른 박테리아 및 물질 조합으로 처리했습니다.
보시다시피, 일부 이전 연구에서는 4 L/m2를 초과하는 높은 살포량을 고려했습니다.13,41,74 높은 살포량은 물 공급, 운송 및 대량 살포와 관련된 비용 때문에 경제적인 관점에서 현장 적용이 용이하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 1.62~2 L/m2와 같은 낮은 살포량에서도 최대 190 kPa의 상당히 우수한 표면 강도와 25 m/s를 초과하는 TDV를 얻을 수 있었습니다. 본 연구에서는 요소 분해 없이 포름산염 기반 MICP로 처리한 사구가 동일한 살포량 범위에서 요소 분해 경로를 통해 얻은 것과 유사한 높은 표면 강도를 달성했습니다(즉, 요소 ​​분해 없이 포름산염 기반 MICP로 처리한 샘플은 Meng et al.13이 보고한 것과 동일한 범위의 표면 강도 값을 더 높은 살포량에서도 달성할 수 있었습니다. 그림 13a). 또한, 2L/m2의 시비량에서, 요소 분해를 거치지 않은 포름산염 기반 MICP의 경우 풍속 25m/s 조건에서 풍식 완화를 위한 탄산칼슘 생성량이 2.25%로 나타났는데, 이는 동일한 시비량과 풍속(25m/s)에서 요소 분해를 거친 대조군 MICP로 처리한 사구의 필요량(즉, 2.41%)에 매우 근접한 수치임을 알 수 있다.
따라서 이 표를 통해 요소 분해 경로와 요소 비분해 경로 모두 표면 저항 및 TDV 측면에서 상당히 만족스러운 성능을 제공한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 주요 차이점은 요소 비분해 경로는 암모니아를 포함하지 않으므로 환경에 미치는 영향이 더 적다는 것입니다. 또한, 본 연구에서 제안한 요소 분해를 거치지 않은 포름산염 기반 MICP 방법은 요소 분해를 거치지 않은 아세트산염 기반 MICP 방법보다 더 나은 성능을 보이는 것으로 나타났습니다. Mohebbi 등은 요소 분해를 거치지 않은 아세트산염 기반 MICP 방법을 연구했지만, 그들의 연구는 평평한 표면의 시료를 대상으로 했습니다.9 사구 시료 주변의 와류 형성으로 인한 침식 정도가 더 크고 그 결과 전단력이 발생하여 TDV가 낮아지기 때문에, 동일한 풍속에서 사구 시료의 풍식은 평평한 표면보다 더 두드러질 것으로 예상됩니다.