이 논문은 "콩과 식물의 병원균 및 해충 저항성 향상" 연구 주제의 일부이며, 전체 5개 논문을 보려면 여기를 클릭하십시오.
식물 괴사성 곰팡이병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary는 다양한 숙주 식물을 감염시키기 위해 다단계 전략을 사용합니다. 본 연구에서는 필수 아미노산 합성을 촉진하는 비단백질 아미노산인 디아민 L-오르니틴을 사용하여 Pseudomonas sclerotiorum에 의한 흰곰팡이병에 대한 Phaseolus vulgaris L.의 분자적, 생리적, 생화학적 반응을 향상시키는 대안적 관리 전략을 제안합니다. 시험관 내 실험 결과, L-오르니틴은 S. pyrenoidosa의 균사 생장을 용량 의존적으로 유의하게 억제했습니다. 또한, 온실 조건에서 흰곰팡이병의 심각도를 현저히 감소시켰습니다. 나아가, L-오르니틴은 처리된 식물의 생장을 촉진하여, 시험된 농도의 L-오르니틴이 처리된 식물에 대해 식물독성이 없음을 나타냈습니다. 또한, L-오르니틴은 비효소적 항산화제(총 수용성 페놀류 및 플라보노이드)와 효소적 항산화제(카탈라아제(CAT), 퍼옥시다아제(POX), 폴리페놀 산화효소(PPO))의 발현을 증가시키고, 세 가지 항산화 관련 유전자(PvCAT1, PvSOD, PvGR)의 발현을 증가시켰다. 더 나아가, 생물정보학 분석 결과, S. sclerotiorum 게놈에서 기능 분석, 보존 도메인 및 구조 측면에서 Aspergillus fijiensis(AfOAH) 및 Penicillium sp.(PlOAH)의 옥살로아세테이트 아세틸하이드롤라제(SsOAH) 단백질과 매우 유사한 가상의 SsOAH 단백질이 존재함을 확인하였다. 흥미롭게도, 감자덱스트로스배지(PDB)에 L-오르니틴을 첨가하면 S. sclerotiorum 균사체에서 SsOAH 유전자 발현이 현저히 감소했습니다. 마찬가지로, 외부에서 L-오르니틴을 처리했을 때도 처리된 식물에서 채취한 곰팡이 균사체에서 SsOAH 유전자 발현이 현저히 감소했습니다. 마지막으로, L-오르니틴 처리는 PDB 배지와 감염된 잎 모두에서 옥살산 분비를 현저히 감소시켰습니다. 결론적으로, L-오르니틴은 산화환원 상태를 유지하고 감염된 식물의 방어 반응을 강화하는 데 중요한 역할을 합니다. 본 연구 결과는 흰곰팡이병을 방제하고 콩 생산 및 기타 작물에 미치는 영향을 완화하는 혁신적이고 환경 친화적인 방법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
흰곰팡이병은 괴사성 곰팡이인 Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary에 의해 발생하는 치명적인 수확량 감소 질병으로, 전 세계 콩(Phaseolus vulgaris L.) 생산에 심각한 위협을 가합니다(Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum은 토양 매개성 식물 병원성 곰팡이 중 가장 방제하기 어려운 종 중 하나로, 600종 이상의 식물에 감염되는 광범위한 숙주 범위를 가지고 있으며, 숙주 조직을 비특이적으로 빠르게 파괴하는 능력을 지니고 있습니다(Liang and Rollins, 2018). 불리한 환경 조건에서 이 곰팡이는 생활주기의 중요한 휴면 단계를 거치는데, 이 단계에서는 토양 속에 '균핵'이라고 불리는 검고 단단한 씨앗 모양의 구조물로 오랫동안 존재하거나, 감염된 식물의 균사체 또는 줄기 속 부분에 흰색의 솜털 같은 형태로 존재합니다(Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum은 균핵을 형성할 수 있어 감염된 토양에서 장기간 생존하고 질병 발생 기간 동안 지속될 수 있습니다(Schwartz et al., 2005). 균핵은 영양분이 풍부하고 토양에서 오랫동안 생존할 수 있으며, 후속 감염의 주요 접종원 역할을 합니다(Schwartz et al., 2005). 유리한 조건에서 균핵은 발아하여 공기 중으로 포자를 방출하고, 이 포자는 꽃, 줄기, 꼬투리 등 식물의 지상부 전체를 감염시킬 수 있습니다(Schwartz et al., 2005).
스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)은 숙주 식물을 감염시키기 위해 여러 단계의 전략을 사용하는데, 이는 균핵 발아에서 증상 발현에 이르기까지 일련의 연관된 과정을 포함합니다. 초기에 S. sclerotiorum은 자낭반(apothecia)이라는 버섯 모양의 구조물에서 부유 포자(자낭포자)를 생성하며, 이 포자는 공기 중으로 퍼져 감염된 식물 잔해에서 운동성이 없는 균핵으로 발달합니다(Bolton et al., 2006). 그런 다음 곰팡이는 독성 인자인 옥살산을 분비하여 식물 세포벽의 pH를 조절하고, 효소적 분해 및 조직 침입을 촉진하며(Hegedus and Rimmer, 2005), 숙주 식물의 산화적 폭발을 억제합니다. 이러한 산성화 과정은 식물 세포벽을 약화시켜 곰팡이 세포벽 분해 효소(CWDE)가 정상적이고 효율적으로 작용할 수 있는 유리한 환경을 조성하고, 병원균이 물리적 장벽을 극복하고 숙주 조직을 침투할 수 있도록 합니다(Marciano et al., 1983). 일단 침투하면, S. sclerotiorum은 폴리갈락투로나아제와 셀룰라아제와 같은 여러 가지 세포질 분해 효소(CWDE)를 분비하여 감염된 조직 내에서 확산을 촉진하고 조직 괴사를 유발합니다. 병변과 균사 덩어리의 진행은 흰곰팡이병의 특징적인 증상으로 이어집니다(Hegedus and Rimmer, 2005). 한편, 숙주 식물은 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 인식하고, 일련의 신호 전달 과정을 통해 궁극적으로 방어 반응을 활성화합니다.
수십 년간의 병해 방제 노력에도 불구하고, 병원균의 저항성, 생존력, 적응력 때문에 콩을 비롯한 다른 상업 작물에서는 여전히 적절한 저항성 유전자원이 부족한 실정입니다. 따라서 병해 관리는 매우 어렵고, 재배 방법, 생물학적 방제, 화학 살균제를 조합한 통합적이고 다각적인 전략이 필요합니다(O'Sullivan et al., 2021). 흰곰팡이병에 대한 화학적 방제는 살균제를 적절한 시기에 올바르게 사용하면 병의 확산을 효과적으로 억제하고 감염 정도를 줄이며 수확량 손실을 최소화할 수 있기 때문에 가장 효과적입니다. 그러나 살균제의 과다 사용 및 과도한 의존은 S. sclerotiorum의 저항성 균주 출현으로 이어지고, 비표적 생물, 토양 건강, 수질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다(Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). 따라서 환경 친화적인 대안을 찾는 것이 최우선 과제가 되었습니다.
푸트레신, 스페르미딘, 스페르민, 카다베린과 같은 폴리아민(PA)은 토양 매개 식물 병원균에 대한 유망한 대체재로서, 유해한 화학 살균제의 사용을 완전히 또는 부분적으로 줄일 수 있습니다(Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). 고등 식물에서 폴리아민은 세포 분열, 분화, 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 반응을 포함한 다양한 생리적 과정에 관여합니다(Killiny and Nehela, 2020). 폴리아민은 항산화제 역할을 하고, 활성산소종(ROS)을 제거하며, 산화환원 항상성을 유지하고(Nehela and Killiny, 2023), 방어 관련 유전자 발현을 유도하고(Romero et al., 2018), 다양한 대사 경로를 조절하고(Nehela and Killiny, 2023), 내생 식물 호르몬을 조절하고(Nehela and Killiny, 2019), 전신 획득 저항성(SAR)을 확립하고, 식물-병원체 상호작용을 조절하는 등 다양한 기능을 수행합니다(Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). 폴리아민이 식물 방어에 관여하는 구체적인 메커니즘과 역할은 식물 종, 병원체, 환경 조건에 따라 다양하다는 점에 유의해야 합니다. 식물에서 가장 풍부한 폴리아민은 필수 폴리아민인 L-오르니틴으로부터 생합성됩니다(Killiny and Nehela, 2020).
L-오르니틴은 식물 생장과 발달에 다양한 역할을 합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 벼(Oryza sativa)에서 오르니틴이 질소 순환(Liu et al., 2018), 벼 수확량, 품질 및 향(Lu et al., 2020), 그리고 수분 스트레스 반응(Yang et al., 2000)과 관련이 있을 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 외부에서 L-오르니틴을 처리하면 사탕무(Beta vulgaris)의 가뭄 내성이 크게 향상되고(Hussein et al., 2019), 양파(Allium Cepa)(Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021)와 캐슈(Anacardium occidentale) 식물의 염분 스트레스가 완화되는 것으로 나타났습니다(da Rocha et al., 2012). L-오르니틴이 비생물적 스트레스 방어에 관여하는 것은 처리된 식물에서 프롤린 축적과 관련이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 오르니틴 델타 아미노트랜스퍼라제(delta-OAT) 및 프롤린 탈수소효소(ProDH1 및 ProDH2) 유전자와 같은 프롤린 대사 관련 유전자는 이전에 Nicotiana benthamiana와 Arabidopsis thaliana가 비숙주인 Pseudomonas syringae 균주에 대해 보이는 방어 기작에 관여하는 것으로 보고되었습니다(Senthil-Kumar and Mysore, 2012). 한편, 진균 오르니틴 탈카르복실화효소(ODC)는 병원균의 성장에 필수적입니다(Singh et al., 2020). 숙주 유도 유전자 침묵(HIGS)을 통해 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici의 ODC를 표적으로 삼으면 토마토 식물의 푸사리움 시들음병에 대한 저항성이 크게 향상되었습니다(Singh et al., 2020). 그러나 식물 병원균과 같은 생물학적 스트레스에 대한 외인성 오르니틴 적용의 잠재적 역할은 아직 충분히 연구되지 않았습니다. 더욱 중요한 것은 오르니틴이 질병 저항성에 미치는 영향과 그와 관련된 생화학적 및 생리적 현상에 대한 연구가 아직 충분히 이루어지지 않았다는 점입니다.
콩과 식물의 Sclerotinia sclerotiorum 감염의 복잡성을 이해하는 것은 효과적인 방제 전략 개발에 중요합니다. 본 연구에서는 디아민 L-오르니틴이 콩과 식물의 Sclerotinia sclerotiorum 감염에 대한 방어 기작 및 저항성을 향상시키는 핵심 요소로서 어떤 역할을 하는지 규명하고자 했습니다. 우리는 L-오르니틴이 감염된 식물의 방어 반응을 강화하는 것 외에도 산화환원 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 할 것이라는 가설을 세웠습니다. L-오르니틴의 잠재적 효과는 효소적 및 비효소적 항산화 방어 기작의 조절과 곰팡이 병원성/독성 인자 및 관련 단백질과의 상호작용과 관련이 있다고 제안합니다. L-오르니틴의 이러한 이중 기능은 흰곰팡이병의 영향을 완화하고 이 강력한 곰팡이 병원균에 대한 일반적인 콩과 작물의 저항성을 향상시키는 지속 가능한 전략의 유망한 후보 물질이 될 수 있음을 시사합니다. 본 연구 결과는 흰곰팡이병을 방제하고 콩과 작물 생산에 미치는 영향을 완화하는 혁신적이고 환경 친화적인 방법 개발에 도움이 될 수 있을 것입니다.
본 연구에서는 일반 콩의 대표적인 품종인 기자 3(Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)을 실험 재료로 사용했습니다. 건강한 종자는 이집트 농업연구센터(ARC) 작물연구소(FCRI) 콩과식물연구부에서 제공받았습니다. 내경 35cm, 깊이 50cm의 플라스틱 화분에 S. sclerotiorum에 감염된 토양을 채우고 종자 5개를 파종했습니다. 재배 조건은 온실(25 ± 2 °C, 상대습도 75 ± 1%, 광주기 8시간/암주기 16시간)이었습니다. 파종 후 7~10일(DPS)이 지나면 각 화분에 균일하게 자라고 잎이 완전히 펼쳐진 묘목 2개만 남기고 솎아냈습니다. 모든 화분 식물에는 2주에 한 번씩 물을 주고, 해당 품종에 권장되는 양만큼 매달 시비했습니다.
L-오르니틴디아민((+)-(S)-2,5-디아미노펜탄산이라고도 함; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) 500 mg/L 농도 용액을 제조하기 위해 먼저 50 mg을 멸균 증류수 100 mL에 용해시켰습니다. 이 원액을 희석하여 후속 실험에 사용했습니다. 간단히 설명하면, 6가지 L-오르니틴 농도(12.5, 25, 50, 75, 100, 125 mg/L)를 시험관 내에서 테스트했습니다. 또한, 멸균 증류수를 음성 대조군(Mock)으로 사용했으며, 상업용 살균제 "Rizolex-T" 50% 습윤성 분말(토클로포스-메틸 20% + 티람 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 시판 살균제 "리졸렉스-T"를 5가지 농도(2, 4, 6, 8 및 10 mg/L)에서 시험했습니다.
흰곰팡이병의 전형적인 증상을 보이는 강낭콩 줄기와 꼬투리 샘플(감염률: 10~30%)을 상업 농장에서 수집했습니다. 감염된 식물 재료의 대부분은 종/품종(감수성이 높은 상업용 품종인 Giza 3)이 확인되었지만, 특히 지역 시장에서 구입한 것들은 종이 불분명했습니다. 수집된 감염 재료는 먼저 0.5% 차아염소산나트륨 용액으로 3분간 표면 소독한 후, 멸균 증류수로 여러 번 헹구고 멸균 여과지로 물기를 제거했습니다. 그런 다음 감염된 기관을 건강한 조직과 감염된 조직 사이의 중간 조직에서 작은 조각으로 잘라 감자덱스트로스한천(PDA) 배지에 접종하고 25±2°C에서 12시간 광주기/12시간 암주기 조건으로 5일 동안 배양하여 균핵 형성을 유도했습니다. 혼합 배양액이나 오염된 배양액에서 진균 분리주를 정제하기 위해 균사 끝 채취법도 사용했습니다. 정제된 진균 분리주는 먼저 배양 형태학적 특성을 기반으로 동정되었고, 현미경적 특징을 통해 S. sclerotiorum으로 확인되었다. 마지막으로, 모든 정제된 분리주는 코흐의 가설을 충족시키기 위해 감수성 강낭콩 품종인 기자 3(Giza 3)에 대한 병원성 검사를 실시하였다.
또한, 가장 침습성이 강한 S. sclerotiorum 분리주(분리주 #3)는 White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017에서 설명한 바와 같이 내부 전사 스페이서(ITS) 서열 분석을 통해 추가적으로 확인되었습니다. 간단히 설명하면, 분리주는 감자 포도당 배지(PDB)에서 배양하고 25 ± 2 °C에서 5~7일 동안 배양했습니다. 그런 다음 균사체를 수집하여 거즈로 여과하고 멸균수로 두 번 세척한 후 멸균 여과지로 건조했습니다. 게놈 DNA는 Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit(Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024)를 사용하여 분리했습니다. 이후 ITS rDNA 영역은 특이적 프라이머 쌍 ITS1/ITS4(TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; 예상 크기: 540 bp)를 사용하여 증폭되었습니다(Baturo-Ciesniewska et al., 2017). 정제된 PCR 산물은 시퀀싱을 위해 베이징 아오케 딩성 바이오테크놀로지(Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.)에 의뢰되었습니다. ITS rDNA 서열은 Sanger 시퀀싱 방법을 사용하여 양방향으로 분석되었습니다. 조립된 쿼리 서열은 BLASTn 소프트웨어를 사용하여 GenBank 및 미국 국립생명공학정보센터(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)의 최신 데이터와 비교되었습니다. 질의 서열은 분자 진화 유전학 분석 패키지(MEGA-11; 버전 11)(Kumar et al., 2024)의 ClustalW를 사용하여 NCBI GenBank의 최신 데이터에서 검색된 다른 20개의 S. sclerotiorum 균주/분리주와 비교되었습니다(보충표 S1). 진화 분석은 최대 우도법과 일반 시간 가역 뉴클레오티드 치환 모델(Nei and Kumar, 2000)을 사용하여 수행되었습니다. 가장 높은 로그 우도를 갖는 계통수가 표시됩니다. 휴리스틱 탐색을 위한 초기 계통수는 이웃 결합(NJ) 계통수(Kumar et al., 2024)와 최대 절약(MP) 계통수 중 로그 우도가 더 높은 계통수를 선택하여 설정되었습니다. NJ 계통수는 일반 시간 가역 모델(Nei and Kumar, 2000)을 사용하여 계산된 쌍별 거리 행렬을 이용하여 구축되었습니다.
L-오르니틴과 살균제 "리졸렉스-T"의 항균 활성을 한천 확산법을 이용하여 시험관 내에서 측정하였다. 방법: 적정량의 L-오르니틴 원액(500 mg/L)을 취하여 10 ml의 PDA 배지에 잘 혼합하여 최종 농도가 각각 12.5, 25, 50, 75, 100, 125 mg/L인 용액을 제조하였다. 살균제 "리졸렉스-T"는 5가지 농도(2, 4, 6, 8, 10 mg/L)로 제조하였고, 멸균 증류수를 대조군으로 사용하였다. 배지가 굳어진 후, 직경 4mm의 Sclerotinia sclerotiorum 균사체 조각을 페트리 접시 중앙에 옮기고 균사체가 대조군 페트리 접시 전체를 덮을 때까지 25±2°C에서 배양한 후, 곰팡이 생장을 기록했습니다. 식 1을 사용하여 S. sclerotiorum의 방사형 생장 억제율을 계산하십시오.
본 실험은 각 대조군/실험군에 대해 6개의 생물학적 반복 실험을 수행하고, 각 생물학적 반복 실험마다 5개의 화분(화분당 식물 2개)을 사용하여 두 번 반복 실시하였다. 실험 결과의 정확성, 신뢰성 및 재현성을 확보하기 위해 각 생물학적 반복 실험은 두 번씩 분석하였다(기술적 반복 2회). 또한, 프로빗 회귀 분석을 이용하여 반최대 억제 농도(IC50)와 IC99를 계산하였다(Prentice, 1976).
온실 조건에서 L-오르니틴의 잠재력을 평가하기 위해 두 번의 연속적인 화분 실험을 수행했습니다. 간단히 설명하면, 화분에 멸균된 점토-모래 토양(3:1)을 채우고 새로 준비한 S. sclerotiorum 배양액을 접종했습니다. 먼저, 가장 침습성이 강한 S. sclerotiorum 분리주(분리주 #3)를 배양하기 위해 균핵 하나를 반으로 잘라 PDA 배지에 뒤집어 놓고 25°C에서 4일 동안 암조건(24시간)으로 배양하여 균사 생장을 유도했습니다. 그런 다음, 배양액의 앞쪽 가장자리에서 직경 5mm의 한천 조각 4개를 채취하여 멸균된 밀기울과 쌀겨 혼합물(1:1, v/v) 100g을 접종하고 모든 플라스크를 25 ± 2°C에서 5일 동안 12시간 광주기/12시간 암주기 조건으로 배양하여 균핵 형성을 유도했습니다. 모든 플라스크의 내용물을 흙을 넣기 전에 균일하게 섞었습니다. 그런 다음, 병원균 농도를 일정하게 유지하기 위해 각 화분에 배양용 밀기울 혼합물 100g을 첨가했습니다. 접종된 화분에 물을 주어 곰팡이 성장을 촉진하고 7일 동안 온실에 두었습니다.
기자 3 품종의 씨앗 5개를 각 화분에 파종했습니다. L-오르니틴과 살균제 리졸렉스-T로 처리한 화분의 경우, 멸균된 씨앗을 먼저 두 화합물의 수용액에 각각 최종 IC99 농도가 약 250mg/L와 50mg/L가 되도록 2시간 동안 담근 후, 파종 전에 1시간 동안 공기 건조했습니다. 반면, 음성 대조군으로는 씨앗을 멸균 증류수에 담갔습니다. 10일 후, 첫 물주기 전에 각 화분에 두 개의 건강한 묘목만 남기고 솎아냈습니다. 또한, S. sclerotiorum 감염을 확인하기 위해 동일한 발달 단계(10일)의 콩 줄기를 멸균된 메스를 사용하여 서로 다른 두 곳에서 자르고, 각 상처에 약 0.5g의 배양용 겨 혼합물을 넣은 후, 높은 습도를 유지하여 접종된 모든 식물에서 감염 및 병 발생을 유도했습니다. 대조군 식물에도 유사한 방식으로 상처를 내고, 동일한 양(0.5g)의 멸균된, 미생물이 증식하지 않은 밀기울 혼합물을 상처 부위에 넣은 후 높은 습도를 유지하여 질병 발생 환경을 모방하고 처리군 간의 일관성을 확보하였다.
처리 방법: 콩 묘목에 L-오르니틴(250mg/l) 수용액 또는 살균제 리졸렉스-T(50mg/l) 수용액 500ml를 토양 관수 방식으로 처리하였고, 10일 간격으로 3회 반복 처리하였다. 대조군에는 멸균 증류수 500ml를 처리하였다. 모든 처리는 온실 조건(25±2°C, 상대습도 75±1%, 광주기 8시간 광주기/16시간 암주기)에서 수행하였다. 모든 화분에는 2주 간격으로 물을 주었고, 한 달에 한 번씩 품종별 권장량 및 제조사 지침에 따라 엽면 살포 방식으로 3~4g/l 농도의 균형 잡힌 NPK 비료(20-20-20, 황 3.6% 및 미량원소 함유; 이집트 Zain Seeds사)를 처리하였다. 달리 명시되지 않는 한, 각 생물학적 반복 실험에서 처리 후 72시간(hpt)에 완전히 펼쳐진 성숙한 잎(위에서 두 번째와 세 번째 잎)을 채취하여 균질화하고, 합쳐서 -80°C에서 보관하여 산화 스트레스 지표의 조직화학적 위치 확인, 지질 과산화, 효소적 및 비효소적 항산화제, 유전자 발현 등을 포함한 추가 분석을 수행하였다.
흰곰팡이 감염 강도는 접종 후 21일(dpi) 동안 매주 1~9점 척도(보충표 S2)를 사용하여 평가했으며, 이는 Teran et al.(2006)이 수정한 Petzoldt and Dickson 척도(1996)를 기반으로 합니다. 간단히 설명하면, 접종 지점에서 시작하여 콩 식물의 줄기와 가지를 검사하여 마디와 마디 사이를 따라 병변이 진행되는 양상을 관찰했습니다. 접종 지점에서 줄기 또는 가지의 가장 먼 지점까지의 병변 거리를 측정하고, 병변의 위치에 따라 1~9점의 점수를 부여했습니다. 여기서 (1)은 접종 지점 근처에 눈에 띄는 감염이 없음을 나타내고, (2~9)는 마디/마디 사이를 따라 병변 크기와 진행이 점진적으로 증가함을 나타냅니다(보충표 S2). 흰곰팡이 감염 강도는 다음 공식 2를 사용하여 백분율로 변환했습니다.
또한, 질병 진행 곡선 아래 면적(AUDPC)은 최근 일반 콩의 흰썩음병에 적용하기 위해 수정된 공식(Shaner and Finney, 1977)을 사용하여 계산되었으며(Chauhan et al., 2020), 해당 공식은 방정식 3을 사용합니다.
여기서 Yi는 시점 ti에서의 병해 심각도, Yi+1은 다음 시점 ti+1에서의 병해 심각도, ti는 첫 번째 측정 시점(일), ti+1은 다음 측정 시점(일), n은 전체 시점 또는 관찰 지점 수를 나타냅니다. 콩 식물의 생장 매개변수(식물 높이(cm), 식물당 가지 수, 식물당 잎 수)는 모든 생물학적 반복 실험에서 21일 동안 매주 기록되었습니다.
각 생물학적 반복 실험에서, 처리 후 45일째(마지막 처리 후 15일)에 잎 샘플(위쪽에서 두 번째와 세 번째로 완전히 발달한 잎)을 채취했습니다. 각 생물학적 반복 실험은 5개의 화분(화분당 식물 2개)으로 구성되었습니다. 분쇄된 조직 약 500mg을 사용하여 80% 아세톤 용액으로 4°C의 암조건에서 광합성 색소(엽록소 a, 엽록소 b 및 카로티노이드)를 추출했습니다. 24시간 후, 샘플을 원심분리하고 상등액을 수집하여 UV-160A 분광광도계(Shimadzu Corporation, Japan)를 사용하여 Lichtenthaler(1987)의 방법에 따라 세 가지 다른 파장(A470, A646 및 A663 nm)에서 흡광도를 측정하여 엽록소 a, 엽록소 b 및 카로티노이드 함량을 비색법으로 측정했습니다. 마지막으로, 광합성 색소의 함량은 Lichtenthaler(1987)가 설명한 다음 공식 4~6을 사용하여 계산되었습니다.
처리 후 72시간(hpt)에 각 생물학적 반복 실험에서 잎(위쪽에서 두 번째와 세 번째로 완전히 발달한 잎)을 채취하여 과산화수소(H2O2)와 초산화물 음이온(O2•−)의 생체 내 조직화학적 위치 분석을 수행했습니다. 각 생물학적 반복 실험은 5개의 화분(화분당 식물 2개)으로 구성되었습니다. 방법의 정확성, 신뢰성 및 재현성을 확보하기 위해 각 생물학적 반복 실험은 2회 반복(기술적 반복 2회)하여 분석했습니다. H2O2와 O2•−는 Romero-Puertas et al.(2004) 및 Adam et al.(1989)의 방법을 약간 수정하여 각각 0.1% 3,3′-디아미노벤지딘(DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) 또는 니트로블루 테트라졸륨(NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)을 사용하여 측정했습니다. 조직 내 H2O2의 위치 확인을 위해, 판막 소엽에 10 mM Tris 완충액(pH 7.8)에 0.1% DAB를 첨가한 용액을 진공 침투시킨 후, 실온에서 빛에 60분간 노출시켰습니다. 소엽을 4:1(v/v) 에탄올:클로로포름 혼합 용액(Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt)에 0.15%(v/v) TCA를 첨가한 용액으로 탈색시킨 후, 어두워질 때까지 빛에 노출시켰습니다. 마찬가지로, 조직 내 O2•−의 위치 확인을 위해 판막에 0.1 w/v % HBT를 함유한 10 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.8)을 진공 침투시켰습니다. 소엽을 실온에서 빛에 20분간 노출시킨 후, 위와 같이 탈색시키고 진한 파란색/보라색 반점이 나타날 때까지 빛을 조사했습니다. 생성된 갈색(H2O2 지표) 또는 청자색(O2•− 지표)의 강도는 이미지 처리 패키지 ImageJ의 Fiji 버전(http://fiji.sc; 2024년 3월 7일 접속)을 사용하여 평가했습니다.
말론디알데히드(MDA; 지질 과산화의 지표)는 Du와 Bramlage(1992)의 방법을 약간 수정하여 측정하였다. 각 생물학적 반복 실험에서 위에서 두 번째와 세 번째로 완전히 발달한 잎을 처리 후 72시간(hpt)에 채취하였다. 각 생물학적 반복 실험은 5개의 화분(화분당 식물 2개)으로 구성되었다. 방법의 정확성, 신뢰성 및 재현성을 확보하기 위해 각 생물학적 반복 실험은 2회씩(기술적 반복 2회) 분석하였다. 간단히 설명하면, 분쇄한 잎 조직 0.5g을 0.01% 부틸화히드록시톨루엔(BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 함유된 20% 트리클로로아세트산(TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) 용액으로 MDA를 추출하였다. 상층액의 MDA 함량은 UV-160A 분광광도계(시마즈 주식회사, 일본)를 사용하여 532nm와 600nm에서 흡광도를 측정함으로써 비색법으로 결정하였고, 그 결과를 nmol g−1 FW로 나타냈다.
비효소적 및 효소적 항산화제 평가를 위해, 처리 후 72시간(hpt)에 각 생물학적 반복구에서 잎(위쪽에서 두 번째와 세 번째로 완전히 발달한 잎)을 채취했습니다. 각 생물학적 반복구는 5개의 화분(화분당 식물 2개)으로 구성되었습니다. 각 생물학적 샘플은 두 번씩 분석했습니다(기술 샘플 2개). 채취한 잎 두 장을 액체 질소로 분쇄하여 효소적 및 비효소적 항산화제, 총 아미노산, 프롤린 함량, 유전자 발현 및 옥살산 정량 분석에 직접 사용했습니다.
총 수용성 페놀 함량은 Kahkonen 등(1999)이 기술한 방법을 약간 수정하여 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 약 0.1g의 균질화된 잎 조직을 20ml의 80% 메탄올에 넣고 암실에서 24시간 동안 추출한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 추출액 0.1ml에 Folin-Ciocalteu 시약(10%) 0.5ml를 첨가하고 30초간 흔들어 섞은 후 암실에서 5분간 방치하였다. 그 후 각 튜브에 20% 탄산나트륨 용액(Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) 0.5ml를 첨가하여 충분히 혼합한 후 실온의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 반응 혼합물의 흡광도를 UV-160A 분광광도계(시마즈 주식회사, 일본)를 사용하여 765 nm에서 측정하였다. 시료 추출물에 함유된 총 용해성 페놀의 농도는 갈산 표준 곡선(피셔 사이언티픽, 햄튼, 뉴햄프셔, 미국)을 이용하여 결정하였으며, 생체중 1g당 갈산 등가량(mg GAE g⁻¹ 생체중)으로 나타냈다.
총 수용성 플라보노이드 함량은 Djeridane 등(2006)의 방법을 약간 수정하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 상기 메탄올 추출물 0.3 ml에 5% 염화알루미늄 용액(AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) 0.3 ml를 혼합하고, 격렬하게 교반한 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 이어서 10% 아세트산칼륨 용액(Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.3 ml를 첨가하고, 충분히 혼합한 후 실온의 암실에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, UV-160A 분광광도계(Shimadzu Corporation, Japan)를 사용하여 반응 혼합물의 흡광도를 430 nm에서 측정하였다. 시료 추출물에 함유된 총 수용성 플라보노이드 농도는 루틴 표준곡선(TCI America, Portland, OR, USA)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 생체중 1g당 루틴 상당량(mg RE g-1 생체중)으로 나타냈다.
콩잎의 총 유리 아미노산 함량은 Yokoyama와 Hiramatsu(2003)가 제안하고 Sun 등(2006)이 수정한 방법을 기반으로 변형된 닌히드린 시약(Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 분쇄한 조직 0.1g을 pH 5.4 완충액으로 추출하고, 상등액 200μL에 닌히드린(2%) 200μL와 피리딘(10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) 200μL를 첨가하여 끓는 물 중탕에서 30분간 반응시킨 후 식혀서 UV-160A 분광광도계(Shimadzu Corporation, Japan)를 사용하여 580nm에서 측정하였다. 한편, 프롤린은 Bates 방법(Bates 등, 1973)으로 측정하였다. 프롤린은 3% 설포살리실산(Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)으로 추출하였고, 원심분리 후 상등액 0.5 ml에 빙초산(Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) 1 ml와 닌히드린 시약을 혼합하여 90°C에서 45분간 반응시킨 후 냉각하여 앞서 사용한 것과 동일한 분광광도계를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 잎 추출물 내 총 유리 아미노산과 프롤린 함량은 각각 글리신 및 프롤린 표준곡선(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 이용하여 정량하고, 생체중 1g당 mg으로 나타냈다.
항산화 효소의 효소 활성을 측정하기 위해, 약 500mg의 균질화된 조직을 1mM EDTA-Na2(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 7.5% 폴리비닐피롤리돈(PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유하는 3ml의 50mM Tris 완충액(pH 7.8)으로 추출하고, 냉장(4°C) 상태에서 10,000 × g로 20분간 원심분리한 후, 상층액(조효소 추출물)을 수집하였다(El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). 카탈라아제(CAT)는 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 ml 및 269 mM H2O2 용액 100 μl와 반응시켜 Aebi(1984)의 방법을 약간 수정하여 효소 활성을 측정하였다(El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). 구아이아콜 의존성 과산화효소(POX)의 효소 활성은 Harrach et al.(2009)의 방법을 사용하여 측정하였다. (2008)의 방법을 약간 수정하여(El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) 폴리페놀 산화효소(PPO)의 효소 활성을 측정하였다. 2.2 ml의 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0), 100 μl의 구아이아콜(TCI chemicals, Portland, OR, USA) 및 100 μl의 12 mM H2O2와 반응시켰다. 이 방법은 (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)에서 약간 수정되었다. 분석은 0.1 M 인산 완충액(pH 6.0)에 새로 제조한 3 ml의 카테콜 용액(Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)과 반응시킨 후 수행하였다. CAT 활성은 240nm에서 H2O2 분해를 모니터링하여 측정하였고(A240), POX 활성은 436nm에서 흡광도 증가를 모니터링하여 측정하였고(A436), PPO 활성은 495nm에서 흡광도 변동을 기록하여 측정하였습니다(A495). 모든 측정은 UV-160A 분광광도계(시마즈, 일본)를 사용하여 3분 동안 30초 간격으로 수행하였다.
실시간 RT-PCR을 이용하여 마지막 처리 후 72시간이 지난 콩잎(위에서 두 번째와 세 번째로 완전히 발달한 잎)에서 과산화소체 카탈라아제(PvCAT1; GenBank 접근 번호 KF033307.1), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(PvSOD; GenBank 접근 번호 XM_068639556.1), 글루타티온 환원효소(PvGR; GenBank 접근 번호 KY195009.1)를 포함한 세 가지 항산화 관련 유전자의 전사체 수준을 측정하였다. 간단히 설명하면, 제조사의 프로토콜에 따라 Simply P Total RNA Extraction Kit(제품 번호 BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, 중국)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 TOP script™ cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 위 세 유전자의 프라이머 서열은 Supplementary Table S3에 제시되어 있다. PvActin-3(GenBank 접근 번호: XM_068616709.1)을 하우스키핑 유전자로 사용하고, 상대적 유전자 발현량은 2-ΔΔCT 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하여 계산하였다. 생물학적 스트레스(일반 콩과 식물과 탄저병균 Colletotrichum lindemuthianum 간의 부적합성 상호작용) 및 비생물학적 스트레스(가뭄, 염분, 저온) 조건에서의 액틴 안정성은 이미 입증되었다(Borges et al., 2012).
우리는 먼저 단백질-단백질 BLAST 도구(BLASTp 2.15.0+)(Altschul et al., 1997, 2005)를 사용하여 S. sclerotiorum의 옥살로아세테이트 아세틸하이드롤라제(OAH) 단백질에 대한 게놈 전체의 컴퓨터 분석을 수행했습니다. 간단히 설명하면, Aspergillus fijiensis CBS 313.89의 OAH(AfOAH; taxide: 1191702; GenBank 접근 번호 XP_040799428.1; 342개 아미노산)와 Penicillium lagena의 OAH(PlOAH; taxide: 94218; GenBank 접근 번호 XP_056833920.1; 316개 아미노산)를 쿼리 서열로 사용하여 S. sclerotiorum의 상동 단백질(taxide: 5180)을 매핑했습니다. BLASTp는 미국 국립생명공학정보센터(NCBI) 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)의 GenBank에 있는 가장 최근에 이용 가능한 S. sclerotiorum 게놈 데이터를 대상으로 수행되었습니다.
또한, S. sclerotiorum의 예측된 OAH 유전자(SsOAH)와 A. fijiensis CBS 313.89의 AfOAH 및 P. lagena의 PlOAH의 진화 분석 및 계통수는 MEGA11(Tamura et al., 2021)의 최대 우도법과 JTT 행렬 기반 모델(Jones et al., 1992)을 사용하여 추론되었습니다. 계통수는 S. sclerotiorum의 모든 예측된 OAH 유전자(SsOAH)와 질의 서열의 단백질 서열에 대한 다중 정렬 분석과 함께 제약 기반 정렬 도구(COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi)(Papadopoulos and Agarwala, 2007)를 사용하여 결합되었습니다. 또한, S. sclerotiorum의 SsOAH의 가장 잘 일치하는 아미노산 서열을 ClustalW(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)를 사용하여 쿼리 서열(AfOAH 및 PlOAH)(Larkin et al., 2007)과 정렬하고, ESPript 도구(버전 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)를 사용하여 정렬된 보존 영역을 시각화했습니다.
또한, S. sclerotiorum SsOAH의 예측된 기능적 대표 도메인과 보존 부위는 InterPro 도구(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)를 사용하여 다양한 패밀리로 분류되었습니다(Blum et al., 2021). 마지막으로, 예측된 S. sclerotiorum SsOAH의 3차원(3D) 구조 모델링은 단백질 상동성/유사성 인식 엔진(Phyre2 서버 버전 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)을 사용하여 수행되었고(Kelley et al., 2015), SWISS-MODEL 서버(https://swissmodel.expasy.org/)를 사용하여 검증되었습니다(Biasini et al., 2014). 예측된 3차원 구조(PDB 형식)는 UCSF-Chimera 패키지(버전 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ )를 사용하여 대화형으로 시각화되었습니다(Pettersen et al., 2004).
정량적 실시간 형광 PCR을 이용하여 Sclerotinia sclerotiorum 균사체에서 옥살로아세테이트 아세틸하이드롤라제(SsOAH; GenBank 접근 번호: XM_001590428.1)의 전사 수준을 측정하였다. 간단히 설명하면, S. sclerotiorum을 PDB 배지가 담긴 플라스크에 접종하고 진탕 배양기(모델: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에서 25 ± 2 °C, 150 rpm으로 24시간 동안 배양하여 균사체 생장을 촉진하였다. 그 후, L-오르니틴과 살균제 리졸렉스-T를 최종 IC50 농도(각각 약 40 mg/L 및 3.2 mg/L)로 처리하고 동일한 조건에서 24시간 더 배양하였다. 배양 후, 배양액을 2500 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액(균사체)을 수집하여 유전자 발현 분석을 수행했습니다. 마찬가지로, 감염된 식물 조직 표면에 흰곰팡이와 솜털 모양의 균사체가 형성된 식물에서 감염 후 0, 24, 48, 72, 96, 120시간에 균사체를 채취했습니다. 균사체에서 RNA를 추출한 후, 앞서 설명한 방법으로 cDNA를 합성했습니다. SsOAH의 프라이머 서열은 보충표 S3에 제시되어 있습니다. SsActin(GenBank 접근 번호: XM_001589919.1)을 하우스키핑 유전자로 사용했으며, 상대적 유전자 발현량은 2-ΔΔCT 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하여 계산했습니다.
옥살산 함량은 Xu와 Zhang(2000)의 방법을 약간 수정하여 감자덱스트로스배지(PDB)와 곰팡이 병원균인 Sclerotinia sclerotiorum을 함유한 식물 시료에서 측정하였다. 간단히 설명하면, S. sclerotiorum 분리균을 PDB가 담긴 플라스크에 접종한 후, 진탕 배양기(모델 I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에서 25 ± 2 °C, 150 rpm으로 3~5일 동안 암조건(24시간) 하에 배양하여 균사 생장을 촉진하였다. 배양 후, 배양액을 Whatman #1 여과지로 여과한 다음, 2500 rpm에서 5분간 원심분리하여 잔류 균사를 제거하였다. 상등액을 수집하여 4 °C에서 보관한 후, 옥살산 정량 분석에 사용하였다. 식물 시료 준비를 위해 약 0.1g의 식물 조직 조각을 증류수(각 2ml)로 세 번 추출했습니다. 그런 다음 시료를 2500rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 Whatman No. 1 필터 페이퍼로 건식 여과하여 추가 분석을 위해 수집했습니다.
옥살산의 정량 분석을 위해, 유리 마개 튜브에 다음과 같은 순서로 반응 혼합물을 제조하였다: 시료(또는 PDB 배양 여과액 또는 옥살산 표준 용액) 0.2 ml, 브로모페놀 블루(BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA) 0.11 ml, 1 M 황산(H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.198 ml, 100 mM 이크롬산칼륨(K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) 0.176 ml를 넣고, 증류수로 4.8 ml까지 희석한 후, 격렬하게 혼합하고 즉시 60 °C 수조에 넣었다. 10분 후, 수산화나트륨 용액(NaOH; 0.75 M) 0.5 ml를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물의 흡광도(A600)는 UV-160 분광광도계(시마즈 주식회사, 일본)를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 배양 여과액과 식물 시료의 정량 분석을 위한 대조군으로는 각각 PDB 배지와 증류수를 사용하였다. 배양 여과액의 옥살산 농도는 PDB 배지 1 ml당 옥살산 마이크로그램(μg·mL⁻¹)으로, 잎 추출물의 옥살산 농도는 생체중 1 g당 옥살산 마이크로그램(μg·g⁻¹ FW)으로 나타냈으며, 옥살산 표준곡선(Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)을 이용하여 측정하였다.
본 연구 전반에 걸쳐 모든 실험은 별도의 언급이 없는 한 처리당 6개의 생물학적 반복과 생물학적 반복당 5개의 화분(화분당 식물 2개)을 사용하는 완전 무작위 설계(CRD)로 설계되었습니다. 생물학적 반복은 2회씩 분석되었습니다(기술적 반복 2회). 기술적 반복은 동일 실험의 재현성을 확인하기 위해 사용되었지만, 허위 반복을 방지하기 위해 통계 분석에는 사용되지 않았습니다. 데이터는 분산 분석(ANOVA) 후 Tukey-Kramer 사후 검정(HSD, p ≤ 0.05)을 사용하여 통계적으로 분석했습니다. 시험관 내 실험의 경우, IC50 및 IC99 값은 프로빗 모델을 사용하여 계산하고 95% 신뢰 구간을 산출했습니다.
이집트 엘 가비야 주에 있는 여러 콩밭에서 총 4개의 균주를 분리했습니다. 모든 균주는 PDA 배지에서 크림색을 띤 흰색 균사를 생성했으며, 이 균사는 빠르게 솜털 같은 흰색으로 변한 후(그림 1A), 균핵 단계에서는 베이지색 또는 갈색을 띠었습니다. 균핵은 일반적으로 조밀하고 검은색이며 구형 또는 불규칙한 모양이고, 길이는 5.2~7.7mm, 지름은 3.4~5.3mm입니다(그림 1B). 4개의 균주 모두 25±2°C에서 10~12일 동안 배양 후 배양액 가장자리에 균핵이 형성되는 양상을 보였지만(그림 1A), 배지당 균핵 수는 균주 간에 유의미한 차이를 보였습니다(P < 0.001). 균주 3이 가장 많은 균핵(배양판당 32.33±1.53개; 그림 1C)을 생성했습니다. 마찬가지로, 분리균주 #3은 다른 분리균주들에 비해 PDB 배지에서 더 많은 옥살산을 생성했습니다(3.33 ± 0.49 μg·mL⁻¹; 그림 1D). 분리균주 #3은 식물 병원성 곰팡이인 Sclerotinia sclerotiorum의 전형적인 형태학적 및 현미경적 특징을 보였습니다. 예를 들어, PDA 배지에서 분리균주 #3의 콜로니는 빠르게 자랐고, 크림색을 띤 흰색(그림 1A), 뒷면은 베이지색 또는 연한 연어색을 띠었으며, 직경 9cm 배지 표면을 완전히 덮는 데 25 ± 2°C에서 6-7일이 소요되었습니다. 위의 형태학적 및 현미경적 특징을 바탕으로 분리균주 #3은 Sclerotinia sclerotiorum으로 동정되었습니다.
그림 1. 일반적인 콩과 작물에서 분리된 S. sclerotiorum 균주의 특성 및 병원성. (A) PDA 배지에서 4개 S. sclerotiorum 균주의 균사 생장, (B) 4개 S. sclerotiorum 균주의 균핵, (C) 균핵 수(배양 접시당), (D) PDB 배지에서의 옥살산 분비량(μg·mL⁻¹), (E) 온실 조건에서 감수성 상업용 콩과 작물 품종인 Giza 3에 대한 4개 S. sclerotiorum 균주의 병해 심각도(%). 값은 5개의 생물학적 반복 실험(n=5)의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 서로 다른 문자는 처리 간 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(p < 0.05). (F–H) 균주 #3 접종 후 10일(dpi)에 각각 지상 줄기와 꼬투리에 전형적인 흰곰팡이병 증상이 나타났다. (I) S. sclerotiorum 분리주 #3의 내부 전사 스페이서(ITS) 영역에 대한 진화 분석을 최대 우도법을 사용하여 수행하고, 미국 국립생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻은 20개의 참조 분리주/균주와 비교하였다. 클러스터링 선 위의 숫자는 영역 포함률(%)을 나타내고, 클러스터링 선 아래의 숫자는 분기 길이를 나타낸다.
또한, 병원성을 확인하기 위해 얻은 4개의 S. sclerotiorum 분리균을 온실 조건에서 감수성 상업용 콩 품종인 기자 3(Giza 3)에 접종하였으며, 이는 코흐의 가설과 일치합니다(그림 1E). 모든 분리균은 병원성을 나타냈으며, 접종 후 10일(dpi)에 콩(기자 3 품종)의 지상부 전체, 특히 줄기(그림 1G)와 꼬투리(그림 1H)에 전형적인 흰곰팡이병 증상을 유발했습니다(그림 1F). 두 번의 독립적인 실험에서 분리균 3이 가장 공격적인 것으로 나타났습니다. 분리균 3은 콩 식물에서 가장 높은 병해 심각도(%)를 보였습니다(접종 후 7일, 14일, 21일에 각각 24.0 ± 4.0%, 58.0 ± 2.0%, 76.7 ± 3.1%, 그림 1F).
가장 침습성이 강한 S. sclerotiorum 분리주 #3의 동정은 내부 전사 스페이서(ITS) 서열 분석을 통해 추가적으로 확인되었다(그림 1I). 분리주 #3과 20개의 참조 분리주/균주 간의 계통 발생 분석 결과, 이들 간에 99% 이상의 높은 유사성이 나타났다. 특히, S. sclerotiorum 분리주 #3(533 bp)은 건조 완두콩 종자에서 분리된 미국 S. sclerotiorum 분리주 LPM36(GenBank 접근 번호 MK896659.1; 540 bp) 및 제비꽃(Matthiola incana) 줄기썩음병을 일으키는 중국 S. sclerotiorum 분리주 YKY211(GenBank 접근 번호 OR206374.1; 548 bp)과 높은 유사성을 보였으며, 이들 모두 계통수(그림 1I)의 상단에서 각각 분리되어 군집을 이루고 있다. 새로운 염기서열은 NCBI 데이터베이스에 “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25”로 명명되어 등록되었습니다(GenBank 접근 번호 PV202792). 분리주 3이 가장 침습성이 강한 분리주임을 알 수 있으므로, 이후 모든 실험에서 이 분리주를 연구 대상으로 선택했습니다.
다양한 농도(12.5, 25, 50, 75, 100 및 125 mg/L)에서 디아민 L-오르니틴(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)의 S. sclerotiorum 분리주 3에 대한 항균 활성을 시험관 내에서 조사하였다. L-오르니틴은 농도 의존적으로 항균 효과를 나타내며 S. sclerotiorum 균사의 방사형 생장을 점진적으로 억제하였다(그림 2A, B). 가장 높은 농도(125 mg/L)에서 L-오르니틴은 가장 높은 균사 생장 억제율(99.62 ± 0.27%; 그림 2B)을 보였으며, 이는 가장 높은 농도(10 mg/L)에서 시판되는 살균제 Rizolex-T(억제율 99.45 ± 0.39%; 그림 2C)와 유사한 효능을 나타냈다.
그림 2. L-오르니틴의 Sclerotinia sclerotiorum에 대한 시험관 내 항균 활성. (A) 다양한 농도의 L-오르니틴과 시판 살균제 리졸렉스-T(10 mg/L)의 S. sclerotiorum에 대한 항균 활성 비교. (B, C) 다양한 농도의 L-오르니틴(12.5, 25, 50, 75, 100 및 125 mg/L) 또는 리졸렉스-T(2, 4, 6, 8 및 10 mg/L) 처리 후 S. sclerotiorum 균사 생장 억제율(%). 값은 5회 반복 실험의 평균 ± 표준편차(n = 5)를 나타낸다. 서로 다른 문자는 처리 간 통계적 유의성을 나타낸다(p < 0.05). (D, E) 각각 L-오르니틴과 상업용 살균제 리졸렉스-T에 대한 프로빗 모델 회귀 분석 결과. 프로빗 모델 회귀선은 파란색 실선으로, 95% 신뢰구간은 빨간색 점선으로 나타냈다.
또한, 프로빗 회귀 분석을 수행했으며 해당 그래프는 표 1과 그림 2D,E에 나타나 있습니다. 간단히 말하면, L-오르니틴의 적절한 기울기 값(y = 2.92x − 4.67)과 관련된 유의 통계량(Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998, p < 0.0001; 그림 2D)은 상업용 살균제 리졸렉스-T(y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708, p < 0.0001)에 비해 S. sclerotiorum에 대한 향상된 항진균 활성을 나타냅니다(표 1).
표 1. L-오르니틴과 시판 살균제 "리졸렉스-T"의 S. sclerotiorum에 대한 반최대 억제 농도(IC50) 및 IC99 값(mg/l).
전반적으로, L-오르니틴(250mg/L)은 처리하지 않은 S. sclerotiorum 감염 식물(대조군)에 비해 처리한 강낭콩 식물에서 흰곰팡이병의 발생 및 심각도를 유의하게 감소시켰습니다(그림 3A). 간단히 말하면, 처리하지 않은 감염 대조군 식물의 질병 심각도는 점차 증가했지만(52.67 ± 1.53%, 83.21 ± 2.61%, 92.33 ± 3.06%), L-오르니틴은 실험 기간 동안 질병 심각도를 유의하게 감소시켰습니다(처리 후 7일, 14일, 21일째 각각 8.97 ± 0.15%, 18.00 ± 1.00%, 26.36 ± 3.07%)(그림 3A). 마찬가지로, S. sclerotiorum에 감염된 콩 식물에 250 mg/L L-오르니틴을 처리했을 때, 병 진행 곡선 아래 면적(AUDPC)은 무처리 대조군의 1274.33 ± 33.13에서 281.03 ± 7.95로 감소했는데, 이는 양성 대조군인 50 mg/L 리졸렉스-T 살균제(183.61 ± 7.71)보다 약간 낮은 수치였다(그림 3B). 두 번째 실험에서도 동일한 경향이 관찰되었다.
그림 3. 온실 조건에서 L-오르니틴의 외인성 처리가 Sclerotinia sclerotiorum에 의한 강낭콩 흰곰팡이병 발생에 미치는 영향. (A) 250 mg/L L-오르니틴 처리 후 강낭콩 흰곰팡이병 진행 곡선. (B) L-오르니틴 처리 후 강낭콩 흰곰팡이병 진행 곡선 아래 면적(AUDPC). 값은 5개의 생물학적 반복 실험(n = 5)의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 서로 다른 문자는 처리 간 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.05).
250mg/L의 L-오르니틴을 외부에서 처리한 결과, 42일 후 식물 높이(그림 4A), 식물당 가지 수(그림 4B), 식물당 잎 수(그림 4C)가 점진적으로 증가했습니다. 상업용 살균제인 리졸렉스-T(50mg/L)가 연구된 모든 영양 매개변수에 가장 큰 영향을 미쳤지만, 250mg/L의 L-오르니틴을 외부에서 처리했을 때는 무처리 대조군에 비해 두 번째로 큰 효과를 나타냈습니다(그림 4A~C). 반면, L-오르니틴 처리는 광합성 색소인 엽록소 a(그림 4D)와 엽록소 b(그림 4E) 함량에는 유의미한 영향을 미치지 않았지만, 총 카로티노이드 함량은 음성 대조군(0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) 및 양성 대조군(0.46 ± 0.02 mg/g fr wt)에 비해 약간 증가시켰다(0.56 ± 0.03 mg/g fr wt; 그림 4F). 종합적으로 이러한 결과는 L-오르니틴이 처리된 콩과 식물에 대해 식물독성이 없으며 오히려 생장을 촉진할 수 있음을 시사한다.
그림 4. 온실 조건에서 Sclerotinia sclerotiorum에 감염된 콩잎의 생장 특성 및 광합성 색소에 대한 외인성 L-오르니틴 처리의 효과. (A) 식물 높이(cm), (B) 식물당 가지 수, (C) 식물당 잎 수, (D) 엽록소 a 함량(mg g⁻¹ fr wt), (E) 엽록소 b 함량(mg g⁻¹ fr wt), (F) 총 카로티노이드 함량(mg g⁻¹ fr wt). 값은 5개의 생물학적 반복 실험(n = 5)의 평균 ± 표준편차이다. 서로 다른 문자는 처리 간 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.05).
활성산소종(ROS; 과산화수소[H2O2]로 표현) 및 자유 라디칼(초산화물 음이온[O2•−]으로 표현)의 생체 내 조직화학적 국소화학적 분석 결과, L-오르니틴(250 mg/L)을 외부에서 처리했을 때 H2O2(96.05 ± 5.33 nmol·g−1 ​​FW; 그림 5A) 및 O2•−(32.69 ± 8.56 nmol·g−1 ​​FW; 그림 5B)의 축적이 무처리 감염 식물(각각 173.31 ± 12.06 및 149.35 ± 7.94 nmol·g−1 ​​FW)과 상업용 살균제 리졸렉스-T 50 mg/L로 처리한 식물(각각 170.12 ± 9.50 및 157.00 ± 7.81 nmol·g−1 ​​fr wt)에 비해 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 각각 72시간 후 높은 수준의 H2O2와 O2•−가 hpt 조건에서 축적되었다(그림 5A, B). 마찬가지로, TCA 기반 말론디알데히드(MDA) 분석 결과, S. sclerotiorum에 감염된 콩 식물의 잎에서 더 높은 수준의 MDA(113.48 ± 10.02 nmol·g fr wt)가 축적된 것으로 나타났다(그림 5C). 그러나 L-오르니틴을 외부에서 처리했을 때, 처리 식물의 MDA 함량이 감소(33.08 ± 4.00 nmol·g fr wt)하는 것으로 나타나 지질 과산화가 현저히 감소했음을 알 수 있었다.
그림 5. 온실 조건에서 S. sclerotiorum에 감염된 콩잎에 외인성 L-오르니틴을 처리했을 때 감염 후 72시간에 나타나는 산화 스트레스의 주요 지표 및 비효소적 항산화 방어 기전에 미치는 영향. (A) 과산화수소(H2O2; nmol g−1 FW) (감염 후 72시간), (B) 초산화물 음이온(O2•−; nmol g−1 FW) (감염 후 72시간), (C) 말론디알데히드(MDA; nmol g−1 FW) (감염 후 72시간), (D) 총 수용성 페놀(mg GAE g−1 FW) (감염 후 72시간), (E) 총 수용성 플라보노이드(mg RE g−1 FW) (감염 후 72시간), (F) 총 유리 아미노산(mg g−1 FW) (감염 후 72시간), (G) 프롤린 함량(mg g−1 FW) (감염 후 72시간). 수치는 5개의 생물학적 반복 실험(n = 5)의 평균 ± 표준편차(평균 ± SD)를 나타냅니다. 서로 다른 문자는 처리 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타냅니다(p < 0.05).