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고함량 인슐린 나노입자(NP)는 다양한 제형에 응용되고 있습니다. 본 연구는 동결건조 및 분무건조 공정이 만니톨을 동결보호제로 사용하거나 사용하지 않은 인슐린 함유 키토산 나노입자의 구조에 미치는 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다. 또한, 나노입자를 재용해하여 품질을 평가했습니다. 탈수 전, 키토산/트리폴리인산나트륨/인슐린 가교 나노입자의 입자 크기는 318 nm, 다분산 지수(PDI)는 0.18, 캡슐화 효율은 99.4%, 인슐린 함량은 25.01%로 최적화되었습니다. 재용해 후, 만니톨을 사용하지 않은 동결건조법으로 제조된 나노입자를 제외한 모든 나노입자는 구형 입자 구조를 유지했습니다. 분무건조법으로 탈수된 만니톨 함유 나노입자와 비교했을 때, 만니톨을 사용하지 않은 분무건조 나노입자는 가장 작은 크기를 나타냈습니다. 건조 또는 동결건조 기술을 통해 얻은 나노입자는 평균 입자 크기(376 nm)와 최대 약물 함량(25.02%)을 나타냈으며, 캡슐화율(98.7%)과 다분산 지수(PDI, 0.20)는 유사했습니다. 만니톨을 첨가하지 않은 분무건조법으로 건조된 나노입자는 인슐린 방출 속도가 가장 빠르고 세포 흡수 효율도 가장 높았습니다. 본 연구는 분무건조법이 기존의 동결건조법에 비해 동결보호제 없이 인슐린 나노입자를 탈수할 수 있어, 약물 함량 증가, 첨가제 사용량 감소, 운영 비용 절감 등의 상당한 이점을 제공함을 보여줍니다.
1922년 발견 이후1,2,3 인슐린과 그 약제는 제1형 당뇨병(T1DM)과 제2형 당뇨병(T2DM) 환자의 생명을 구하는 데 크게 기여해 왔습니다. 그러나 인슐린은 고분자 단백질이라는 특성 때문에 쉽게 응집되고, 단백질 분해 효소에 의해 분해되며, 초회 통과 효과로 인해 체내에서 배설됩니다. 제1형 당뇨병 진단을 받은 환자는 평생 인슐린 주사를 맞아야 하며, 제2형 당뇨병 환자 또한 장기간 인슐린 주사가 필요한 경우가 많습니다. 매일 맞는 인슐린 주사는 이러한 환자들에게 심각한 통증과 불편함을 유발하며, 정신 건강에도 부정적인 영향을 미칩니다. 따라서 경구 인슐린 투여와 같이 불편함을 최소화하는 다른 형태의 인슐린 투여법이 전 세계 약 50억 명의 당뇨병 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 잠재력을 지니고 있어 활발히 연구되고 있습니다.5
나노입자 기술은 경구용 인슐린 투여 시도에 상당한 진전을 가져왔습니다.4,6,7 이 기술은 인슐린을 효과적으로 캡슐화하고 분해로부터 보호하여 특정 신체 부위에 표적 전달할 수 있게 합니다. 그러나 나노입자 제형의 사용에는 몇 가지 한계가 있는데, 주로 입자 현탁액의 안정성 문제 때문입니다. 보관 중 응집이 발생할 수 있으며, 이는 인슐린이 함유된 나노입자의 생체이용률을 감소시킵니다.8 또한, 인슐린 나노입자(NP)의 안정성을 확보하기 위해서는 나노입자와 인슐린의 고분자 매트릭스의 화학적 안정성도 고려해야 합니다. 현재 동결건조 기술은 보관 중 원치 않는 변화를 방지하면서 안정적인 나노입자를 만드는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다.9
그러나 동결건조 과정에서는 나노입자의 구형 구조가 얼음 결정의 기계적 스트레스에 의해 손상되는 것을 방지하기 위해 동결보호제를 첨가해야 합니다. 이로 인해 동결건조 후 인슐린 나노입자의 함량이 크게 감소하는데, 동결보호제가 전체 중량비의 대부분을 차지하기 때문입니다. 따라서 이렇게 제조된 인슐린 나노입자는 인슐린의 치료 효과를 얻기 위해 다량의 건조 나노입자가 필요하기 때문에 경구용 정제나 필름과 같은 건조 분말 제형 제조에 적합하지 않은 경우가 많습니다.
분무 건조는 제약 산업에서 액상으로부터 건조 분말을 생산하는 데 널리 알려져 있고 저렴한 산업 규모 공정입니다.10,11 입자 형성 공정을 제어함으로써 여러 생리활성 화합물을 적절하게 캡슐화할 수 있습니다.12, 13 또한, 경구 투여용 캡슐화 단백질 제조에 효과적인 기술로 자리 잡았습니다. 분무 건조 과정에서 물이 매우 빠르게 증발하여 입자 핵의 온도를 낮게 유지할 수 있으므로11,14 열에 민감한 성분을 캡슐화하는 데 적용할 수 있습니다. 분무 건조 전에 코팅 재료는 캡슐화할 성분을 포함하는 용액과 완전히 균질화되어야 합니다.11,14 동결 건조와 달리 분무 건조에서는 캡슐화 전 균질화 과정을 통해 탈수 과정 중 캡슐화 효율을 향상시킬 수 있습니다. 분무 건조 캡슐화 공정은 동결 보호제를 필요로 하지 않으므로 고함량 건조 나노입자를 생산하는 데 사용할 수 있습니다.
본 연구에서는 이온 겔화법을 이용하여 키토산과 트리폴리인산나트륨을 가교시켜 인슐린 함유 나노입자를 제조하였다. 이온 겔화는 특정 조건에서 두 개 이상의 이온 종 사이의 정전기적 상호작용을 통해 나노입자를 제조하는 방법이다. 최적화된 키토산/트리폴리인산나트륨/인슐린 가교 나노입자의 탈수를 위해 동결건조와 분무건조법을 모두 사용하였다. 탈수 후, 주사전자현미경(SEM)으로 형태를 분석하였다. 나노입자의 재결합 능력은 크기 분포, 표면 전하, 다분산 지수(PDI), 캡슐화 효율 및 인슐린 함량을 측정하여 평가하였다. 또한, 서로 다른 탈수법으로 제조된 재용해된 나노입자의 인슐린 보호성, 방출 거동 및 세포 흡수 효율을 비교하여 그 품질을 평가하였다.
혼합 용액의 pH와 키토산 및 인슐린의 비율은 이온성 겔화 과정에 직접적인 영향을 미치므로 최종 나노입자의 입자 크기와 캡슐화 효율(EE)에 영향을 주는 두 가지 핵심 요소입니다. 혼합 용액의 pH는 입자 크기 및 캡슐화 효율과 높은 상관관계를 보였습니다(그림 1a). 그림 1a에서 볼 수 있듯이 pH가 4.0에서 6.0으로 증가함에 따라 평균 입자 크기(nm)는 감소하고 EE는 크게 증가했지만, pH가 6.5로 증가했을 때는 평균 입자 크기가 증가하기 시작했고 EE는 변화가 없었습니다. 키토산 대 인슐린의 비율이 증가함에 따라 평균 입자 크기도 증가했습니다. 또한, 키토산/인슐린 질량비가 2.5:1(w/w)보다 높을 때 나노입자를 제조했을 때는 EE의 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 1b). 따라서 본 연구에서 최적의 제조 조건은 pH 6.0, 키토산/인슐린 질량비 (2.5:1)입니다. 추가 연구를 위해 2.5:1의 비율로 인슐린 함유 나노입자를 제조하였다. 이 제조 조건에서 인슐린 나노입자의 평균 입자 크기는 318 nm로 최적화되었고(그림 1c), PDI는 0.18, 봉입 효율은 99.4%, 제타 전위는 9.8 mV, 인슐린 함량은 25.01%(m/m)였다. 투과 전자 현미경(TEM) 분석 결과, 최적화된 나노입자는 대략 구형이며 크기가 비교적 균일한 개별 입자 형태를 나타냈다(그림 1d).
인슐린 나노입자의 매개변수 최적화: (a) pH가 인슐린 나노입자의 평균 직경 및 캡슐화 효율(EE)에 미치는 영향(키토산과 인슐린의 질량비 5:1에서 제조); (b) 키토산과 인슐린의 질량비가 인슐린 나노입자의 평균 직경 및 캡슐화 효율(EE)에 미치는 영향(pH 6에서 제조); (c) 최적화된 인슐린 나노입자의 입자 크기 분포; (d) 최적화된 인슐린 나노입자의 투과 전자 현미경 사진.
키토산은 pKa가 6.5인 약한 고분자 전해질로 잘 알려져 있습니다. 키토산의 주요 아미노기는 수소 이온에 의해 양성자화되어 산성 환경에서 양전하를 띕니다.¹⁵ 따라서 음전하를 띤 고분자를 캡슐화하는 담체로 자주 사용됩니다. 본 연구에서는 등전점이 5.3인 인슐린을 키토산을 이용하여 캡슐화했습니다. 키토산은 코팅 물질로 사용되므로, 키토산의 비율이 증가함에 따라 나노입자의 외층 두께가 증가하여 평균 입자 크기가 커집니다. 또한, 키토산의 함량이 높을수록 더 많은 인슐린을 캡슐화할 수 있습니다. 본 연구에서는 키토산과 인슐린의 비율이 2.5:1일 때 캡슐화 효율(EE)이 가장 높았으며, 이 비율이 더 증가해도 EE에는 큰 변화가 없었습니다.
키토산과 인슐린의 비율 외에도 pH는 나노입자 제조에 중요한 역할을 했습니다. Gan 등¹⁷은 키토산 나노입자의 입자 크기에 대한 pH의 영향을 연구했습니다. 그들은 pH가 6.0에 도달할 때까지 입자 크기가 지속적으로 감소하고 pH > 6.0에서 입자 크기가 크게 증가하는 것을 관찰했는데, 이는 본 연구의 관찰 결과와 일치합니다. 이러한 현상은 pH가 증가함에 따라 인슐린 분자가 음전하를 띠게 되어 키토산/트리폴리인산나트륨(TPP) 복합체와의 정전기적 상호작용이 촉진되어 입자 크기가 작아지고 캡슐화 효율(EE)이 높아지기 때문입니다. 그러나 pH를 6.5로 조절하면 키토산의 아미노기가 탈양성자화되어 키토산이 접히게 됩니다. 따라서 높은 pH에서는 아미노 이온이 TPP 및 인슐린에 노출되는 정도가 줄어들어 가교 결합이 감소하고 최종 평균 입자 크기가 커지며 캡슐화 효율이 낮아집니다.
동결건조 및 분무건조된 나노입자의 형태학적 특성 분석은 최적의 탈수 및 분말 형성 기술 선택에 도움이 될 수 있습니다. 최적의 방법은 약물 안정성, 균일한 입자 형태, 높은 약물 함량 및 원액에서의 우수한 용해도를 제공해야 합니다. 본 연구에서는 두 가지 기술을 보다 효과적으로 비교하기 위해 탈수 과정에서 1% 만니톨을 첨가하거나 첨가하지 않은 인슐린 나노입자를 사용했습니다. 만니톨은 동결건조 및 분무건조를 위한 다양한 건조 분말 제형에서 증량제 또는 동결보호제로 사용됩니다. 만니톨을 첨가하지 않은 동결건조 인슐린 나노입자의 경우, 그림 2a에서 볼 수 있듯이 주사전자현미경(SEM) 관찰 결과 크고 불규칙하며 거친 표면을 가진 고다공성 분말 구조가 관찰되었습니다. 탈수 후 분말에서는 소수의 개별 입자만 검출되었습니다(그림 2e). 이러한 결과는 동결보호제 없이 동결건조하는 동안 대부분의 나노입자가 분해되었음을 시사합니다. 1% 만니톨을 함유한 동결건조 및 분무건조 인슐린 나노입자의 경우, 구형의 표면이 매끄러운 나노입자가 관찰되었다(그림 2b, d, f, h). 만니톨 없이 분무 건조된 인슐린 나노입자는 구형을 유지했지만 표면이 주름져 있었다(그림 2c). 구형 및 주름진 표면은 아래의 방출 거동 및 세포 흡수 시험에서 더 자세히 논의된다. 건조된 나노입자의 외관을 기준으로, 만니톨 없이 분무 건조한 나노입자와 만니톨을 첨가하여 동결 건조 및 분무 건조한 나노입자 모두 미세한 분말을 생성했다(그림 2f, g, h). 입자 표면 사이의 표면적이 클수록 용해도가 높아지고 따라서 방출 속도가 높아진다.
다양한 탈수 인슐린 나노입자의 형태학적 특징: (a) 만니톨을 첨가하지 않은 동결건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (b) 만니톨을 첨가한 동결건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (c) 만니톨을 첨가하지 않은 분무건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (d) 만니톨을 첨가하여 분무건조한 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (e) 만니톨을 첨가하지 않은 동결건조 인슐린 나노입자 분말 이미지; (f) 만니톨을 첨가한 동결건조 인슐린 나노입자 이미지; (g) 만니톨을 첨가하지 않은 분무건조 인슐린 나노입자 분말 이미지; (h) 만니톨을 첨가하여 분무건조한 인슐린 나노입자 분말 이미지.
동결건조 과정에서 만니톨은 동결보호제 역할을 하여 나노입자를 비정질 형태로 유지하고 얼음 결정에 의한 손상을 방지합니다.19 반면, 분무건조 과정에서는 동결 단계가 없으므로 만니톨이 필요하지 않습니다. 실제로, 앞서 설명한 바와 같이 만니톨을 첨가하지 않고 분무건조한 나노입자는 더 미세한 입자를 생성했습니다. 그러나 만니톨은 분무건조 과정에서 충전제 역할을 하여 나노입자에 보다 구형의 구조를 부여할 수 있으며20(그림 2d), 이는 캡슐화된 나노입자의 균일한 방출 거동을 얻는 데 도움이 됩니다. 또한, 만니톨을 함유한 동결건조 및 분무건조 인슐린 나노입자 모두에서 일부 큰 입자가 검출되는 것을 확인할 수 있는데(그림 2b,d), 이는 캡슐화된 인슐린과 함께 입자 핵에 만니톨이 축적되었기 때문일 수 있습니다. 키토산 층에 관하여. 본 연구에서는 탈수 후 구형 구조가 온전하게 유지되도록 만니톨과 키토산의 비율을 5:1로 유지함으로써, 다량의 충전제가 건조된 나노입자의 입자 크기를 증가시킬 수 있음을 주목할 필요가 있다.
푸리에 변환 적외선 감쇠 전반사(FTIR-ATR) 분광법을 이용하여 유리 인슐린, 키토산, 키토산, TPP 및 인슐린의 물리적 혼합물을 분석하였다. 모든 탈수된 나노입자는 FTIR-ATR 분광법을 사용하여 분석하였다. 특히, 만니톨을 사용하여 동결건조한 캡슐화된 나노입자와 만니톨을 사용하거나 사용하지 않고 분무건조한 나노입자에서 1641, 1543 및 1412 cm⁻¹ 밴드의 강도가 관찰되었다(그림 3). 이전에 보고된 바와 같이, 이러한 강도 증가는 키토산, TPP 및 인슐린 사이의 가교 결합과 관련이 있다. 키토산과 인슐린 사이의 상호작용을 조사한 결과, 인슐린이 로딩된 키토산 나노입자의 FTIR 스펙트럼에서 키토산 밴드가 인슐린 밴드와 겹쳐 카르보닐(1641 cm⁻¹) 및 아민(1543 cm⁻¹) 밴드의 강도가 증가하는 것을 확인하였다. TPP의 트리폴리포스페이트 그룹은 다음과 연결되어 있다. 키토산의 암모늄기는 1412 cm⁻¹에서 밴드를 형성합니다.
유리 인슐린, 키토산, 키토산/TPP/인슐린 물리적 혼합물 및 다양한 방법으로 탈수된 나노입자의 FTIR-ATR 스펙트럼.
또한, 이러한 결과는 SEM 분석 결과와도 일치하는데, SEM 분석에서는 만니톨을 첨가하여 분무 건조 및 동결 건조했을 때 캡슐화된 나노입자가 손상되지 않고 유지되었지만, 만니톨이 없을 경우에는 분무 건조만 했을 때 캡슐화된 입자가 생성되었음을 보여줍니다. 반면, 만니톨 없이 동결 건조한 나노입자의 FTIR-ATR 스펙트럼 결과는 키토산, TPP, 인슐린의 물리적 혼합물과 매우 유사했습니다. 이는 만니톨 없이 동결 건조한 나노입자에서는 키토산, TPP, 인슐린 사이의 가교 결합이 더 이상 존재하지 않음을 나타냅니다. 동결 보호제 없이 동결 건조하는 동안 나노입자의 구조가 파괴되었으며, 이는 SEM 결과(그림 2a)에서 확인할 수 있습니다. 탈수된 인슐린 나노입자의 형태 및 FTIR 분석 결과를 바탕으로, 재구성 실험에는 동결 건조, 분무 건조 및 만니톨이 없는 나노입자만 사용하였으며, 만니톨이 없는 나노입자는 분해로 인해 재구성에 적합하지 않았습니다. 탈수 과정 중 만니톨이 없는 나노입자에 대해 논의하시오.
탈수 공정은 장기 보관 및 다른 제형으로의 재가공에 사용됩니다. 건조된 나노입자가 보관 후 재구성될 수 있는 능력은 정제 및 필름과 같은 다양한 제형에 사용하기 위해 매우 중요합니다. 만니톨이 없는 분무 건조 인슐린 나노입자의 평균 입자 크기는 재구성 후 약간만 증가했습니다. 반면, 만니톨이 첨가된 분무 건조 및 동결 건조 인슐린 나노입자의 입자 크기는 유의하게 증가했습니다(표 1). 본 연구에서 모든 나노입자를 재결합한 후 다분산 지수(PDI)와 캡슐화 효율(EE)은 유의미하게 변화하지 않았습니다(p > 0.05)(표 1). 이 결과는 대부분의 입자가 재용해 후에도 형태를 유지했음을 나타냅니다. 그러나 만니톨을 첨가하면 동결 건조 및 분무 건조된 만니톨 나노입자의 인슐린 함량이 크게 감소했습니다(표 1). 대조적으로, 만니톨 없이 분무 건조된 나노입자의 인슐린 함량은 이전과 동일하게 유지되었습니다(표 1).
약물 전달 목적으로 나노입자를 사용할 때 나노입자의 약물 탑재량은 매우 중요하다는 것은 잘 알려져 있습니다. 탑재량이 낮은 나노입자의 경우, 치료 효과를 얻기 위해서는 매우 많은 양의 물질이 필요합니다. 그러나 이러한 고농도 나노입자는 점도가 높아 경구 투여 및 주사 제형에 불편함과 어려움을 초래합니다.22 또한, 인슐린 나노입자는 정제 및 점성 바이오필름23, 24 제조에도 사용될 수 있는데, 이는 낮은 탑재량으로 많은 양의 나노입자를 필요로 하여 경구 투여에 적합하지 않은 큰 정제와 두꺼운 바이오필름을 생성합니다. 따라서 높은 인슐린 탑재량을 가진 탈수 나노입자가 매우 바람직합니다. 본 연구 결과는 만니톨이 없는 분무 건조 나노입자의 높은 인슐린 탑재량이 이러한 대체 약물 전달 방식에 여러 가지 매력적인 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다.
모든 탈수된 나노입자는 3개월 동안 냉장 보관되었습니다. SEM 분석 결과, 모든 탈수된 나노입자의 형태는 3개월 보관 기간 동안 크게 변화하지 않았습니다(그림 4). 물에 재용해한 후, 모든 나노입자는 캡슐화 효율(EE)이 약간 감소했으며, 3개월 보관 기간 동안 약 5% 정도의 소량의 인슐린을 방출했습니다(표 2). 그러나 모든 나노입자의 평균 입자 크기는 증가했습니다. 만니톨을 첨가하지 않고 분무 건조한 나노입자의 입자 크기는 525 nm로 증가한 반면, 만니톨을 첨가하여 분무 건조 및 동결 건조한 나노입자의 입자 크기는 각각 872 nm와 921 nm로 증가했습니다(표 2).
3개월 동안 보관한 다양한 탈수 인슐린 나노입자의 형태: (a) 만니톨을 첨가한 동결건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (b) 만니톨을 첨가하지 않은 분무건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지; (c) 만니톨을 첨가하지 않은 분무건조 인슐린 나노입자의 SEM 이미지.
또한, 만니톨로 분무 건조하고 동결 건조한 재구성된 인슐린 나노입자에서 침전물이 관찰되었습니다(그림 S2). 이는 큰 입자가 물에 제대로 현탁되지 않았기 때문일 수 있습니다. 위의 모든 결과는 분무 건조 기술이 인슐린 나노입자의 탈수를 방지하고, 어떠한 충전제나 동결 보호제 없이도 높은 함량의 인슐린 나노입자를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
탈수 후 효소 분해에 대한 나노입자의 보호 능력을 확인하기 위해 pH 2.5 배지에서 펩신, 트립신 및 α-키모트립신을 사용하여 인슐린 보유량을 측정했습니다. 탈수된 나노입자의 인슐린 보유량을 새로 제조한 나노입자의 인슐린 보유량과 비교했으며, 유리 인슐린을 음성 대조군으로 사용했습니다. 본 연구에서 유리 인슐린은 세 가지 효소 처리 모두에서 4시간 이내에 빠르게 제거되었습니다(그림 5a-c). 반면, 만니톨로 동결건조한 나노입자와 만니톨 유무에 관계없이 분무건조한 나노입자의 인슐린 제거율 측정 결과, 효소 분해에 대한 보호 효과가 유의미하게 높았으며, 이는 새로 제조한 인슐린 나노입자와 유사한 수준이었습니다(그림 5a-c). 펩신, 트립신 및 α-키모트립신 처리 시 나노입자를 사용하면 4시간 이내에 각각 50%, 60%, 75% 이상의 인슐린을 보호할 수 있었습니다. (그림 5a–c). 이러한 인슐린 보호 능력은 혈류로의 인슐린 흡수율을 높일 가능성을 증가시킬 수 있습니다.25 이러한 결과는 만니톨을 사용하거나 사용하지 않은 분무 건조와 만니톨을 사용한 동결 건조가 탈수 후 나노입자의 인슐린 보호 능력을 보존할 수 있음을 시사합니다.
탈수된 인슐린 나노입자의 보호 및 방출 거동: (a) 펩신 용액에서의 인슐린 보호; (b) 트립신 용액에서의 인슐린 보호; (c) α-키모트립신 용액에서의 인슐린 보호; (d) pH 2.5 용액에서의 탈수 나노입자의 방출 거동; (e) pH 6.6 용액에서의 탈수 나노입자의 방출 거동; (f) pH 7.0 용액에서의 탈수 나노입자의 방출 거동.
새로 제조하고 재구성한 건조 인슐린 나노입자를 위, 십이지장 및 소장 상부의 pH 환경을 모방한 다양한 완충액(pH = 2.5, 6.6, 7.0)에서 37°C로 배양하여 인슐린이 인슐린 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 다양한 환경에서의 방출 거동. 위장관 일부. pH 2.5에서 인슐린 함유 나노입자와 재용해된 건조 인슐린 나노입자는 처음 1시간 이내에 급격한 방출을 보였고, 이후 5시간 동안 서서히 방출되었다(그림 5d). 이러한 초기 급속 방출은 입자 내부 구조에 완전히 고정되지 않은 단백질 분자의 빠른 표면 탈착 때문일 가능성이 높다. pH 6.5에서 인슐린 함유 나노입자와 재구성된 건조 인슐린 나노입자는 시험 용액의 pH가 나노입자 제조 용액의 pH와 유사하여 6시간 동안 부드럽고 서서히 방출되었다(그림 5e). pH 7에서 나노입자는 불안정하여 처음 2시간 이내에 거의 완전히 분해되었다(그림 5f). 이는 높은 pH에서 키토산의 탈양성자화가 일어나 고분자 네트워크가 덜 치밀해지고 함유된 인슐린이 방출되기 때문이다.
또한, 만니톨 없이 분무 건조된 인슐린 나노입자는 다른 탈수된 나노입자보다 더 빠른 방출 양상을 보였다(그림 5d–f). 앞서 설명한 바와 같이, 만니톨 없이 건조된 재구성된 인슐린 나노입자는 가장 작은 입자 크기를 나타냈다. 작은 입자는 더 넓은 표면적을 제공하므로 대부분의 관련 약물이 입자 표면 또는 그 근처에 존재하게 되어 빠른 약물 방출이 이루어진다.26
나노입자의 세포독성은 MTT 분석법을 통해 조사되었다. 그림 S4에서 볼 수 있듯이, 모든 탈수 나노입자는 50~500 μg/ml 농도에서 세포 생존율에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 모든 탈수 나노입자가 치료 범위에 도달하는 데 안전하게 사용될 수 있음을 시사한다.
간은 인슐린이 생리적 기능을 발휘하는 주요 장기입니다. HepG2 세포는 시험관 내 간세포 흡수 모델로 흔히 사용되는 인간 간암 세포주입니다. 본 연구에서는 동결건조 및 분무건조법으로 탈수된 나노입자의 세포 흡수를 평가하기 위해 HepG2 세포를 사용했습니다. FITC-1000 유리 인슐린(25 μg/mL), 새로 제조한 FITC-1000 함유 나노입자, 그리고 동일한 인슐린 농도의 탈수된 FITC-1000 함유 나노입자와 수 시간 동안 배양한 후, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 이용하여 세포 흡수를 정량적으로 관찰했습니다. 만니톨을 첨가하지 않은 동결건조 나노입자는 탈수 과정에서 파괴되었으므로 본 실험에서는 평가하지 않았습니다. 새로 제조한 인슐린 함유 나노입자, 만니톨을 첨가한 동결건조 나노입자, 그리고 만니톨 첨가 및 미첨가 분무건조 나노입자의 세포 내 형광 강도를 측정했습니다(그림 참조). 6a)는 유리 인슐린에 비해 각각 4.3배, 2.6배, 2.4배, 4.1배 더 높았습니다(그림 6b). 이러한 결과는 캡슐화된 인슐린이 유리 인슐린보다 세포 흡수율이 더 높으며, 이는 주로 본 연구에서 제조된 인슐린 함유 나노입자의 크기가 더 작기 때문임을 시사합니다.
새로 제조한 나노입자와 탈수된 나노입자를 4시간 동안 배양한 후 HepG2 세포의 흡수율: (a) HepG2 세포에 의한 FITC-인슐린 흡수 분포. (b) 유세포 분석기로 분석한 형광 강도의 기하 평균(n = 3), *P < 0.05 (유리 인슐린과 비교).
마찬가지로, CLSM 이미지에서 새로 제조한 FITC-인슐린 함유 나노입자와 FITC-인슐린 함유 분무건조 나노입자(만니톨 미첨가)의 FITC 형광 강도가 다른 샘플보다 훨씬 강한 것으로 나타났습니다(그림 6a). 또한, 만니톨을 첨가하면 용액의 점도가 높아져 세포 흡수 저항이 증가하고, 결과적으로 인슐린 증식이 감소합니다. 이러한 결과는 만니톨이 없는 분무건조 나노입자가 재용해 후 동결건조 나노입자보다 입자 크기가 작기 때문에 가장 높은 세포 흡수 효율을 나타낸다는 것을 시사합니다.
키토산(평균 분자량 100 kDa, 탈아세틸화율 75–85%)은 Sigma-Aldrich(캐나다 온타리오주 오크빌)에서 구입했습니다. 삼폴리인산나트륨(TPP)은 VWR(미국 펜실베이니아주 래드너)에서 구입했습니다. 본 연구에 사용된 재조합 인간 인슐린은 Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)에서 구입했습니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 인간 인슐린과 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)는 Sigma-Aldrich(캐나다 온타리오주 오크빌)에서 구입했습니다. HepG2 세포주는 ATCC(미국 버지니아주 매너서스)에서 분양받았습니다. 그 외 모든 시약은 분석용 또는 크로마토그래피 등급을 사용했습니다.
0.1% 아세트산을 함유한 이중 증류수(DD water)에 CS를 용해시켜 1 mg/ml 농도의 CS 용액을 제조합니다. 이중 증류수와 0.1% 아세트산에 각각 TPP와 인슐린을 용해시켜 1 mg/ml 농도의 TPP 용액을 제조합니다. 프리에멀젼은 폴리트론 PCU-2-110 고속 균질기(Brinkmann Ind., Westbury, NY, USA)를 사용하여 제조했습니다. 제조 과정은 다음과 같습니다. 먼저, 인슐린 용액 4ml에 TPP 용액 2ml를 첨가하고 30분 동안 교반하여 완전히 혼합합니다. 그런 다음, 혼합 용액을 고속 교반(10,000 rpm)하면서 주사기를 이용하여 CS 용액에 한 방울씩 첨가합니다. 혼합물을 얼음 욕조에서 30분 동안 고속 교반(15,000 rpm)하면서 유지하고, 특정 pH로 조정하여 가교된 인슐린 나노입자를 얻습니다. 인슐린의 입자 크기를 더욱 균일하게 하고 입자 크기를 줄이기 위해 추가적인 처리를 진행합니다. 나노입자는 프로브형 초음파 발생기(UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany)를 사용하여 얼음 욕조에서 30분 동안 추가로 초음파 처리했습니다.
인슐린 나노입자(NPs)는 25°C의 증류수에 희석하여 Litesizer 500(Anton Paar, Graz, Austria)을 이용한 동적 광산란(DLS) 측정법으로 Z-평균 직경, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위를 측정하였다. 형태 및 크기 분포는 Hitachi H7600 투과 전자 현미경(TEM)(Hitachi, Tokyo, Japan)으로 분석하였고, 이미지는 Hitachi 이미징 소프트웨어(Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 인슐린 나노입자의 캡슐화 효율(EE) 및 로딩 용량(LC)을 평가하기 위해, 나노입자를 분자량 차단값이 100 kDa인 한외여과 튜브에 넣고 500 xg에서 30분간 원심분리하였다. 여과액에 남아 있는 캡슐화되지 않은 인슐린은 Agilent 1100 Series HPLC 시스템(Agilent, Santa Clara, California, USA)을 이용하여 정량하였다. 4중 펌프, 자동 샘플러, 컬럼 히터 및 DAD 검출기를 사용했습니다. 인슐린은 C18 컬럼(Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA)을 사용하여 분석하고 214 nm에서 검출했습니다. 이동상은 0.1% TFA를 함유한 아세토니트릴과 물이었고, 10/90에서 100/0까지의 그라디언트 비율로 10분 동안 분석했습니다. 이동상은 1.0 ml/min의 유속으로 펌핑했습니다. 컬럼 온도는 20 °C로 설정했습니다. 식 (1)과 식 (2)를 사용하여 EE와 LC의 백분율을 계산합니다.
인슐린 나노입자(NP)의 최적화를 위해 2.0에서 4.0까지 다양한 CS/인슐린 비율을 시험했습니다. 인슐린/TPP 혼합물의 양은 일정하게 유지하면서 CS 용액의 첨가량을 변화시켰습니다. 모든 용액(인슐린, TPP, CS)을 첨가한 후 혼합물의 pH를 신중하게 조절하여 4.0에서 6.5 범위의 pH에서 인슐린 나노입자를 제조했습니다. 인슐린 나노입자의 최적 형성을 위해 다양한 pH 값과 CS/인슐린 질량비에서 인슐린 나노입자의 캡슐화 효율(EE)과 입자 크기를 평가했습니다.
최적화된 인슐린 나노입자를 알루미늄 용기에 넣고 티슈로 덮은 후 테이프로 단단히 고정했습니다. 그런 다음 나사로 밀봉한 용기를 트레이 건조기가 장착된 Labconco FreeZone 동결건조기(Labconco, Kansas City, MO, USA)에 넣었습니다. 건조된 인슐린 나노입자를 얻기 위해 처음 2시간 동안은 온도 -10°C, 0.350 Torr로, 나머지 22시간 동안은 0°C, 0.120 Torr로 24시간 동안 동결건조했습니다.
캡슐화된 인슐린을 제조하기 위해 Buchi Mini Spray Dryer B-290(BÜCHI, Flawil, 스위스)을 사용했습니다. 선택된 건조 매개변수는 온도 100°C, 공급 유량 3L/min, 가스 유량 4L/min였습니다.
탈수 전후의 인슐린 나노입자는 FTIR-ATR 분광법을 이용하여 특성을 분석하였다. 탈수된 나노입자와 유리 인슐린 및 키토산은 범용 ATR 샘플링 액세서리(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA)가 장착된 Spectrum 100 FTIR 분광기(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 분석하였다. 신호 평균값은 4000-600 cm⁻¹ 주파수 범위에서 4 cm⁻¹ 해상도로 16회 스캔하여 얻었다.
동결건조 및 분무건조된 인슐린 나노입자의 형태는 Helios NanoLab 650 집속 이온빔 주사전자현미경(FIB-SEM)(FEI, Hillsboro, Oregon, USA)으로 촬영한 SEM 이미지를 통해 평가하였다. 주요 매개변수는 전압 5 keV, 전류 30 mA였다.
모든 탈수된 인슐린 나노입자를 증류수에 재용해했습니다. 탈수 후 품질을 평가하기 위해 앞서 언급한 동일한 방법을 사용하여 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 캡슐화 효율(EE) 및 액체 함량(LC)을 다시 측정했습니다. 무수인슐린 나노입자의 안정성은 장기간 보관 후 나노입자의 특성을 측정하여 평가했습니다. 본 연구에서는 탈수된 모든 나노입자를 3개월 동안 냉장 보관했습니다. 3개월 보관 후, 나노입자의 형태학적 크기, PDI, EE 및 LC를 측정했습니다.
재구성된 나노입자 5mL를 모의 위액(pH 1.2, 펩신 1% 함유), 장액(pH 6.8, 트립신 1% 함유) 또는 키모트립신 용액(100g/mL, 인산염 완충액, pH 7.8) 45mL에 용해시켜 탈수 후 나노입자 보호에 대한 인슐린의 효능을 평가하였다. 이 용액들을 37°C에서 100rpm의 교반 속도로 배양하였다. 다양한 시간 간격으로 용액 500μL를 채취하여 HPLC로 인슐린 농도를 측정하였다.
새로 제조하고 탈수시킨 인슐린 나노입자의 시험관 내 방출 거동을 투석 백법(분자량 차단 100 kDa, Spectra Por Inc.)을 이용하여 분석하였다. 새로 제조하고 재구성한 건조 나노입자를 각각 위, 십이지장, 소장 상부의 pH 환경을 모사하기 위해 pH 2.5, pH 6.6, pH 7.0(0.1 M 인산염 완충 용액, PBS)의 용액에서 투석하였다. 모든 시료는 37 °C에서 200 rpm으로 연속 교반하면서 배양하였다. 5 mL 투석 백 외부의 용액을 0.5, 1, 2, 3, 4, 6시간 간격으로 흡인하고 즉시 새로운 투석액으로 보충하였다. 용액 내 인슐린 오염도는 HPLC로 분석하였고, 나노입자로부터의 인슐린 방출 속도는 방출된 유리 인슐린과 총 인슐린의 비율로 계산하였다. 나노입자에 캡슐화됨(식 3).
인간 간세포암 세포주인 HepG2 세포는 10% 태아 소 혈청, 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신29이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 사용하여 직경 60 mm 배양 접시에서 배양했습니다. 배양은 37°C, 상대 습도 95%, CO2 5% 조건에서 유지했습니다. 약물 흡수 분석을 위해 HepG2 세포를 8웰 Nunc Lab-Tek 챔버 슬라이드 시스템(Thermo Fisher, NY, USA)에 1 × 10⁵ 세포/ml의 밀도로 접종했습니다. 세포 독성 분석을 위해 96웰 플레이트(Corning, NY, USA)에 5 × 10⁴ 세포/ml의 밀도로 접종했습니다.
MTT 분석법을 이용하여 새로 제조하고 탈수시킨 인슐린 나노입자(NPs)의 세포독성을 평가하였다. HepG2 세포를 96웰 플레이트에 5 × 10⁴ cells/mL의 밀도로 접종하고 7일 동안 배양한 후 실험을 진행하였다. 인슐린 나노입자를 배양액에 다양한 농도(50~500 μg/mL)로 희석하여 세포에 처리하였다. 24시간 배양 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 0.5 mg/ml MTT를 함유한 배지에서 추가로 4시간 동안 배양하였다. 세포독성은 Tecan infinite M200 pro 분광광도계(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 570 nm에서 황색 테트라졸륨 MTT가 보라색 포르마잔으로 효소적으로 환원되는 정도를 측정하여 평가하였다.
나노입자의 세포 흡수 효율은 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 유세포 분석을 통해 측정하였다. Nunc Lab-Tek 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 유리 FITC-인슐린, FITC-인슐린 함유 나노입자, 그리고 동일 농도의 25 μg/mL 탈수 FITC-인슐린 나노입자를 처리하고 4시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 핵은 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. 인슐린의 위치는 Olympus FV1000 레이저 스캐닝/이광자 공초점 현미경(Olympus, 일본 도쿄 신주쿠시)을 사용하여 관찰하였다. 유세포 분석을 위해, 동일 농도의 10 μg/mL 유리 FITC-인슐린, FITC-인슐린 함유 나노입자, 그리고 재용해된 탈수 FITC-인슐린 나노입자를 사용하였다. FITC-인슐린 나노입자를 HepG2 세포가 배양된 96웰 플레이트에 첨가하고 4시간 동안 배양했습니다. 4시간 배양 후, 세포를 제거하고 FBS로 3회 세척했습니다. 각 샘플당 5 × 10⁴개의 세포를 BD LSR II 유세포 분석기(BD, Franklin Lakes, New Jersey, United States)로 분석했습니다.
모든 값은 평균 ± 표준편차로 표시됩니다. 모든 그룹 간의 비교는 IBM SPSS Statistics 26 for Mac(IBM, Endicott, New York, USA)을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 t-검정을 통해 평가했으며, p < 0.05인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주했습니다.
본 연구는 분무 건조법이 기존의 동결 건조법(증량제 또는 동결보호제 사용)에 비해 우수한 재구성 능력과 높은 로딩 용량을 가지면서 가교 키토산/TPP/인슐린 나노입자를 탈수하는 데 있어 유연성과 능력을 갖추고 있음을 보여줍니다. 최적화된 인슐린 나노입자는 평균 입자 크기가 318 nm이고 캡슐화 효율이 99.4%였습니다. 탈수 후 SEM 및 FTIR 분석 결과, 구형 구조는 만니톨을 첨가하거나 첨가하지 않은 분무 건조 나노입자와 만니톨을 첨가하여 동결 건조한 나노입자에서만 유지되었으며, 만니톨을 첨가하지 않고 동결 건조한 나노입자는 탈수 과정에서 분해되었습니다. 재구성 능력 시험에서 만니톨을 첨가하지 않고 분무 건조한 인슐린 나노입자가 가장 작은 평균 입자 크기와 가장 높은 재구성 로딩 용량을 나타냈습니다. 모든 탈수된 나노입자의 방출 거동을 분석한 결과, pH 2.5 및 pH 7 용액에서는 빠르게 방출되었고, pH 7 이상의 용액에서는 매우 안정적이었습니다. 6.5. 다른 재용해된 탈수 나노입자와 비교했을 때, 만니톨 없이 분무건조한 나노입자가 가장 빠른 방출 속도를 보였다. 이 결과는 세포 흡수 분석에서 관찰된 결과와 일치하는데, 만니톨이 없는 분무건조 나노입자는 새로 제조한 나노입자의 세포 흡수 효율을 거의 완벽하게 유지했기 때문이다. 이러한 결과는 만니톨을 사용하지 않은 분무건조법으로 제조한 건조 인슐린 나노입자가 경구용 정제나 생체접착 필름과 같은 다른 무수 제형으로 가공하기에 가장 적합하다는 것을 시사한다.
지적 재산권 문제로 인해 본 연구에서 생성 및/또는 분석된 데이터 세트는 공개적으로 이용할 수 없지만, 합리적인 요청이 있을 경우 해당 저자에게서 제공받을 수 있습니다.
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