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프로피온산(PPA)은 자폐 스펙트럼 장애와 같은 신경발달 장애에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할을 연구하는 데 사용됩니다. PPA는 미토콘드리아 생합성, 대사 및 회전율을 저해하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 미토콘드리아 역동성, 분열 및 융합에 대한 PPA의 영향은 이러한 메커니즘의 복잡한 시간적 특성으로 인해 여전히 불분명합니다. 본 연구에서는 상보적인 정량적 이미징 기법을 사용하여 신경세포 유사 세포인 SH-SY5Y 세포에서 PPA가 미토콘드리아의 미세구조, 형태 및 역동성에 미치는 영향을 조사했습니다. 5 mM의 PPA는 미토콘드리아 면적(p < 0.01), 페렛 직경 및 둘레(p < 0.05), 그리고 면적 2(p < 0.01)를 유의하게 감소시켰습니다. 미토콘드리아 사건 위치 분석 결과, 분열 및 융합 현상이 유의하게 증가(p < 0.05)하여 스트레스 조건 하에서도 미토콘드리아 네트워크의 완전성이 유지됨을 보여주었습니다. 또한, cMYC(p < 0.0001), NRF1(p < 0.01), TFAM(p < 0.05), STOML2(p < 0.0001) 및 OPA1(p < 0.05)의 mRNA 발현이 유의하게 감소했습니다. 이는 스트레스 조건 하에서 기능을 유지하기 위해 미토콘드리아의 형태, 생합성 및 역동성이 재구성됨을 보여줍니다. 본 연구 결과는 PPA가 미토콘드리아 역동성에 미치는 영향에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 미토콘드리아 스트레스 반응에 관련된 복잡한 조절 메커니즘을 연구하는 데 있어 영상 기술의 유용성을 강조합니다.
미토콘드리아는 에너지 생산 및 생합성이라는 일반적인 역할 외에도 다양한 세포 기능에 필수적인 역할을 합니다. 미토콘드리아 대사는 칼슘 신호 전달, 대사 및 산화환원 항상성, 염증 신호 전달, 후성유전적 변형, 세포 증식, 분화 및 세포 사멸을 조절하는 핵심 요소입니다.¹ 특히, 미토콘드리아 대사는 신경 세포의 발달, 생존 및 기능에 매우 중요하며 다양한 신경병리학적 증상과 광범위하게 관련되어 있습니다.^2,3,4
지난 10년간 대사 상태는 신경 발생, 분화, 성숙 및 가소성의 핵심 조절자로 부상했습니다.5,6 최근에는 미토콘드리아의 형태와 역동성이 세포 내 건강한 미토콘드리아 풀을 유지하는 역동적인 과정인 세포 분열의 특히 중요한 구성 요소로 주목받고 있습니다. 미토콘드리아 역동성은 미토콘드리아 생합성 및 생체 에너지에서부터 미토콘드리아 분열, 융합, 수송 및 제거에 이르기까지 복잡하고 상호 의존적인 경로에 의해 조절됩니다.7,8 이러한 통합 메커니즘 중 어느 하나라도 교란되면 건강한 미토콘드리아 네트워크 유지가 손상되고 신경 발달에 심각한 기능적 결과를 초래합니다.9,10 실제로 미토콘드리아 역동성의 조절 장애는 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 포함한 많은 정신 질환, 신경 퇴행성 질환 및 신경 발달 장애에서 관찰됩니다.11,12
자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 복잡한 유전적 및 후성유전적 구조를 가진 이질적인 신경발달 장애입니다. ASD의 유전성은 논란의 여지가 없지만, 근본적인 분자적 병인은 여전히 ​​제대로 이해되지 않고 있습니다. 전임상 모델, 임상 연구 및 다중 오믹스 분자 데이터 세트에서 축적된 데이터는 ASD에서 미토콘드리아 기능 장애에 대한 증거를 점점 더 많이 제공하고 있습니다.^13,14 우리는 이전에 ASD 환자 코호트에서 게놈 전체 DNA 메틸화 스크리닝을 수행하여 미토콘드리아 대사 경로를 따라 군집된 차등 메틸화 유전자를 확인했습니다.¹⁵ 이후 우리는 미토콘드리아 생합성 및 역학의 핵심 조절인자의 차등 메틸화를 보고했으며, 이는 ASD에서 증가된 mtDNA 복제 수 및 변화된 소변 대사 프로필과 관련이 있었습니다.¹⁶ 우리의 데이터는 미토콘드리아 역학과 항상성이 ASD의 병태생리에 중요한 역할을 한다는 증거를 더욱 강화하고 있습니다. 따라서 미토콘드리아의 역동성, 형태 및 기능 간의 관계에 대한 기전적 이해를 향상시키는 것은 이차적인 미토콘드리아 기능 장애를 특징으로 하는 신경 질환에 대한 지속적인 연구의 핵심 목표입니다.
분자생물학적 기법은 미토콘드리아 스트레스 반응에서 특정 유전자의 역할을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 그러나 이러한 접근 방식은 유사분열 조절 기전의 다면적이고 시간적인 특성으로 인해 한계가 있을 수 있습니다. 더욱이, 미토콘드리아 유전자의 차등 발현은 기능적 변화를 간접적으로 나타내는 지표이며, 특히 일반적으로 분석되는 유전자의 수가 제한적이기 때문에 더욱 그렇습니다. 따라서 미토콘드리아 기능과 생체 에너지학을 연구하기 위한 보다 직접적인 방법들이 제안되어 왔습니다.¹⁷ 미토콘드리아 형태는 미토콘드리아 역동성과 밀접한 관련이 있습니다. 미토콘드리아의 모양, 연결성 및 구조는 에너지 생산과 미토콘드리아 및 세포 생존에 매우 중요합니다.^5,18 또한, 유사분열의 다양한 구성 요소들은 미토콘드리아 형태의 변화에 ​​초점을 맞추고 있으며, 이는 미토콘드리아 기능 장애의 유용한 지표가 될 수 있고 후속적인 기전 연구의 기초를 제공할 수 있습니다.
미토콘드리아의 형태는 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 직접 관찰할 수 있으며, 이를 통해 세포 미세구조를 자세히 연구할 수 있습니다. TEM은 세포 집단에서 유전자 전사, 단백질 발현 또는 미토콘드리아 기능 매개변수에만 의존하는 것이 아니라, 개별 미토콘드리아 수준에서 미토콘드리아 크리스타의 형태, 모양 및 구조를 직접 시각화할 수 있습니다.^17,19,20 또한, TEM은 미토콘드리아 기능 및 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 소포체 및 자가포식소와 같은 다른 세포 소기관과의 상호작용 연구를 용이하게 합니다.^21,22 따라서 TEM은 특정 경로 또는 유전자에 초점을 맞추기 전에 미토콘드리아 기능 장애를 연구하는 데 좋은 출발점이 됩니다. 미토콘드리아 기능이 신경병리학과 점점 더 관련성이 높아짐에 따라, 시험관 내 신경 세포 모델에서 미토콘드리아의 형태와 역동성을 직접적이고 정량적으로 연구할 필요성이 분명해지고 있습니다.
본 논문에서는 자폐 스펙트럼 장애(ASD)에서 나타나는 미토콘드리아 기능 장애의 신경 세포 모델에서 미토콘드리아 역동성을 조사합니다. 우리는 이전에 미토콘드리아 프로피오닐-CoA 카르복실라제(PCC) 효소의 하위 단위인 프로피오닐-CoA 카르복실라제 베타(PCCB)의 차등 메틸화를 ASD15에서 보고한 바 있습니다. PCC의 기능 이상은 프로피온산(PPA)을 포함한 프로피오닐 유도체의 독성 축적을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.23,24,25 PPA는 생체 내에서 신경 세포 대사를 교란하고 행동을 변화시키는 것으로 나타났으며, ASD와 관련된 신경 발달 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용되는 동물 모델입니다.26,27,28 또한, PPA는 시험관 내에서 미토콘드리아 막 전위, 생합성 및 호흡을 저해하는 것으로 보고되었으며, 신경 세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 모델링하는 데 널리 사용되고 있습니다.29,30 하지만 PPA로 유발된 미토콘드리아 기능 장애가 미토콘드리아 형태 및 역동성에 미치는 영향은 아직 제대로 이해되지 않고 있다.
본 연구는 상호보완적인 이미징 기법을 이용하여 SH-SY5Y 세포에서 PPA가 미토콘드리아 형태, 역동성 및 기능에 미치는 영향을 정량화했습니다. 먼저, 미토콘드리아 형태 및 미세구조의 변화를 시각화하기 위한 투과전자현미경(TEM) 방법을 개발했습니다.^17,31,32 미토콘드리아의 역동적인 특성을 고려하여³³, 미토콘드리아 분열 및 융합 현상 간의 균형, 미토콘드리아 수 및 부피의 변화를 정량화하기 위해 미토콘드리아 사건 국소화(MEL) 분석도 수행했습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 형태 및 역동성이 생합성, 분열 및 융합에 관여하는 유전자 발현 변화와 관련이 있는지 조사했습니다. 종합적으로, 본 연구 결과는 미토콘드리아 역동성을 조절하는 복잡한 메커니즘을 규명하는 데 있어 어려움을 보여줍니다. 또한, SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 형태를 측정 가능한 유사분열의 수렴적 지표로 활용하는 것이 유용함을 강조합니다. 또한, TEM 데이터는 대사 스트레스에 대한 동적 반응을 포착하는 이미징 기술과 결합될 때 가장 풍부한 정보를 제공한다는 점을 강조합니다. 신경 세포 분열을 뒷받침하는 분자 조절 메커니즘에 대한 추가적인 특성 규명은 신경계 및 신경퇴행성 질환의 미토콘드리아 구성 요소에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
미토콘드리아 스트레스를 유도하기 위해 SH-SY5Y 세포에 3mM 및 5mM 프로피온산나트륨(NaP)을 사용하여 PPA를 처리했습니다. 투과전자현미경(TEM) 분석 전, 고압 동결 및 저온 동결을 통해 시료를 극저온 처리했습니다(그림 1a). 3개의 생물학적 반복 실험을 통해 미토콘드리아 집단의 8가지 형태학적 매개변수를 측정하기 위한 자동화된 미토콘드리아 이미지 분석 파이프라인을 개발했습니다. PPA 처리는 면적 2, 면적, 둘레 및 페렛 직경의 4가지 매개변수에 유의미한 변화를 일으켰습니다(그림 1b–e). 면적 2는 3mM 및 5mM PPA 처리 모두에서 유의미하게 감소했으며(p = 0.0183 및 p = 0.002)(그림 1b), 면적(p = 0.003), 둘레(p = 0.0106) 및 페렛 직경 또한 모두 유의미하게 감소했습니다. 5 mM 처리군은 대조군에 비해 유의미한 감소(p = 0.0172)를 보였다(그림 1c–e). 면적과 둘레의 유의미한 감소는 5 mM PPA로 처리된 세포의 미토콘드리아가 더 작고 둥글며, 대조군 세포의 미토콘드리아보다 길쭉하지 않다는 것을 보여준다. 이는 입자 가장자리 사이의 최대 거리를 나타내는 독립적인 매개변수인 페렛 직경의 유의미한 감소와도 일치한다. 미토콘드리아 크리스타의 미세구조 변화가 관찰되었다. PPA 스트레스의 영향으로 크리스타가 덜 뚜렷해졌다(그림 1a, 패널 B). 그러나 모든 이미지가 크리스타의 미세구조를 명확하게 반영하는 것은 아니었기 때문에 이러한 변화에 대한 정량적 분석은 수행하지 않았다. 이러한 TEM 데이터는 세 가지 가능한 시나리오를 반영할 수 있다: (1) PPA가 분열을 촉진하거나 융합을 억제하여 기존 미토콘드리아의 크기를 줄인다; (2) 향상된 생합성은 새롭고 더 작은 미토콘드리아를 생성하거나 (3) 두 메커니즘을 동시에 유도합니다. 이러한 조건은 TEM으로 구별할 수 없지만, 중요한 형태학적 변화는 PPA 스트레스 하에서 미토콘드리아 항상성 및 역학의 변화를 나타냅니다. 우리는 이러한 역학과 그 기저에 있는 잠재적 메커니즘을 더 자세히 규명하기 위해 추가적인 매개변수를 탐색했습니다.
프로피온산(PPA)은 미토콘드리아 형태를 변화시킨다. (a) PPA 처리 농도가 증가함에 따라 미토콘드리아 크기가 감소하고 더 ​​작고 둥근 형태를 보이는 것을 보여주는 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지. 각각 0 mM(미처리), 3 mM, 5 mM 처리군이다. 붉은색 화살표는 미토콘드리아를 가리킨다. (b–e) 24시간 동안 PPA로 처리한 SH-SY5Y 세포를 TEM 분석을 위해 준비하고 Fiji/ImageJ를 사용하여 결과를 분석했다. 8개 매개변수 중 4개에서 대조군(미처리, 0 mM PPA)과 처리군(3 mM 및 5 mM PPA) 간에 유의미한 차이가 나타났다. (b) 영역 2, (c) 면적, (d) 둘레, (e) 페렛 직경. 일원 분산 분석(대조군 vs. 처리군)과 Dunnett 다중 비교 검정을 사용하여 유의미한 차이를 확인하였다(p < 0.05). 데이터 포인트는 각 개별 세포의 평균 미토콘드리아 값을 나타내며, 오차 막대는 평균 ± 표준오차(SEM)를 나타냅니다. 표시된 데이터는 n=3(반복당 최소 24개 세포)이며, 총 266개의 이미지를 분석했습니다. *는 p < 0.05, **는 p < 0.01을 나타냅니다.
미토콘드리아 역동성이 PPA에 어떻게 반응하는지 더 자세히 알아보기 위해, 테트라메틸로다민 에틸 에스터(TMRE)로 미토콘드리아를 염색하고, 3mM 및 5mM PPA 처리 후 24시간이 지난 시점에서 타임랩스 현미경 및 MEL 분석을 이용하여 미토콘드리아의 위치와 양을 측정하였다. (그림 2a). MEL 분석 후, 미토콘드리아 구조의 수와 평균 부피를 정량화하기 위해 추가 분석을 실시하였다. 3 mM 농도에서 분열 현상 발생 횟수가 [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)]로, 5 mM 농도에서 분열 현상 [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] 및 융합 현상 [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 발생 횟수가 대조군에 비해 작지만 유의미하게 증가한 것을 관찰하였다(그림 3b). 미토콘드리아 수는 3 mM [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)]과 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] 모두에서 유의미하게 증가한 반면(그림 3c), 각 미토콘드리아 구조의 평균 부피는 변화가 없었다(그림 3d). 종합적으로 볼 때, 이는 미토콘드리아 역동성의 재구성이 미토콘드리아 네트워크의 완전성을 성공적으로 유지하는 보상 반응으로 작용함을 시사합니다. 3mM PPA 농도에서 분열 횟수가 증가한 것은 미토콘드리아 수 증가의 일부가 미토콘드리아 분열 때문임을 나타내지만, 평균 미토콘드리아 부피가 거의 변하지 않았다는 점을 고려하면 미토콘드리아 생합성이 추가적인 보상 반응일 가능성을 배제할 수는 없습니다. 그러나 이러한 데이터는 투과전자현미경(TEM)으로 관찰된 더 작고 둥근 미토콘드리아 구조와 일치하며, PPA에 의해 유도된 미토콘드리아 역동성의 유의미한 변화를 보여줍니다.
프로피온산(PPA)은 미토콘드리아 네트워크의 완전성을 유지하기 위해 역동적인 미토콘드리아 재구성을 유도합니다. SH-SY5Y 세포를 배양하고 3mM 및 5mM PPA로 24시간 처리한 후 TMRE 및 Hoechst 33342로 염색하고 MEL 분석을 수행했습니다. (a) 각 조건에 대해 시간 2(t2)에서의 컬러 및 이진화된 최대 강도 투영을 나타내는 대표적인 타임랩스 현미경 이미지. 각 이진 이미지에서 선택된 영역을 강조 표시하고 세 가지 다른 시간 프레임(t1-t3)에서 3D로 표시하여 시간에 따른 역동성을 보여줍니다. 융합 현상은 녹색으로 강조 표시되고, 분열 현상은 녹색으로 강조 표시됩니다. 빨간색으로 표시됩니다. (b) 조건별 평균 동적 현상 수. (c) 세포당 평균 미토콘드리아 구조 수. (d) 세포당 각 미토콘드리아 구조의 평균 부피(µm³). 제시된 데이터는 처리 그룹당 n=15개의 세포를 대표하는 결과입니다. 오차 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타내며, 스케일 바는 10 μm입니다. * p < 0.05.
프로피온산(PPA)은 미토콘드리아 역동성과 관련된 유전자들의 전사 억제를 유발합니다. SH-SY5Y 세포에 3mM 및 5mM PPA를 24시간 동안 처리했습니다. RT-qPCR을 이용하여 상대적 유전자 발현량을 정량화하고 B2M으로 정규화했습니다. 미토콘드리아 생합성 관련 유전자는 (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1, (d) NFE2L2입니다. 미토콘드리아 융합 및 분열 관련 유전자는 (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2, (i) DRP1입니다. 유의미한 차이(p < 0.05)는 일원 분산 분석(대조군 vs. 처리군)과 Dunnett 다중 비교 검정을 사용하여 검정했습니다. *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ****는 p < 0.0001을 나타냅니다. 막대는 평균 발현량 ± 표준오차(SEM)를 나타냅니다. 표시된 데이터는 STOML2, OPA1, TFAM의 경우 n=3, cMYC, NRF1, NFE2L2의 경우 n=4, MFN1, MFN2, DRP1의 경우 n=5의 생물학적 반복 실험 결과를 나타냅니다.
투과전자현미경(TEM)과 멜라닌세포분석(MEL) 데이터를 종합해 보면, PPA가 미토콘드리아의 형태와 역동성을 변화시킨다는 것을 알 수 있습니다. 그러나 이러한 영상 기법들은 이러한 변화를 유발하는 근본적인 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하지 못합니다. 따라서 우리는 PPA 처리 후 미토콘드리아 역동성, 생합성 및 세포 분열을 조절하는 9가지 핵심 유전자의 mRNA 발현을 조사했습니다. 3mM 및 5mM PPA로 24시간 처리 후, 세포 골수종 종양유전자(cMYC), 핵 호흡 인자(NRF1), 미토콘드리아 전사 인자 1(TFAM), NFE2 유사 전사 인자 BZIP(NFE2L2), 가스트린 유사 단백질 2(STOML2), 시신경 위축 1(OPA1), 미토퓨신 1(MFN1), 미토퓨신 2(MFN2) 및 다이나민 관련 단백질 1(DRP1)의 mRNA 발현량을 정량화했습니다. 3 mM(p = 0.0053, p = 0.0415, p < 0.0001) 및 5 mM(p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA 처리에서 mRNA 발현 감소를 관찰하였다(그림 3a–c). mRNA 발현 감소는 용량 의존적이었는데, cMYC, NRF1, TFAM의 발현은 3 mM에서 각각 5.7배, 2.6배, 1.9배 감소하였고, 5 mM에서는 각각 11.2배, 3배, 2.2배 감소하였다. 반면, 중심 산화환원 생합성 유전자 NFE2L2는 PPA 농도에 관계없이 변화가 없었지만, 유사한 용량 의존적 발현 감소 경향이 관찰되었다(그림 3d).
또한 세포 분열 및 융합 조절에 관여하는 대표적인 유전자들의 발현을 조사하였다. STOML2는 세포 융합, 미토콘드리아 자가포식 및 세포 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 3 mM(2.4배 감소) 및 5 mM(2.8배 감소)의 PPA 처리 시 발현이 유의하게 감소하였다(p < 0.0001) (그림 1, 3d). 마찬가지로, OPA1 융합 유전자의 발현도 3 mM(1.6배 감소) 및 5 mM(1.9배 감소)의 PPA 처리 시 감소하였다(p = 0.006 및 p = 0.0024) (그림 3f). 그러나 24시간 PPA 처리에도 불구하고 융합 유전자 MFN1, MFN2 또는 세포 분열 유전자 DRP1의 발현에는 유의미한 차이가 나타나지 않았다(그림 3g–i). 또한, 네 가지 융합 및 분열 단백질(OPA1, MFN1, MFN2 및 DRP1)의 발현 수준은 동일한 조건에서 변화하지 않는 것을 확인했습니다(그림 4a–d). 이러한 데이터는 특정 시점의 결과만을 반영하며, PPA 스트레스 초기 단계 동안의 단백질 발현 또는 활성 수준 변화를 정확하게 나타내지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 및 OPA1의 발현이 유의미하게 감소한 것은 미토콘드리아 대사, ​​생합성 및 역동성의 전사 조절 이상이 심각함을 시사합니다. 또한, 이러한 데이터는 영상 기법을 이용하여 미토콘드리아 기능의 최종 상태 변화를 직접 연구하는 데 유용함을 보여줍니다.
프로피온산(PPA) 처리 후 융합 및 분열 인자 단백질 수준은 변화하지 않았습니다. SH-SY5Y 세포에 3mM 및 5mM PPA를 24시간 동안 처리했습니다. 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 정량화했으며, 발현 수준은 총 단백질량으로 정규화했습니다. 표적 단백질과 총 단백질의 평균 발현량 및 대표적인 웨스턴 블롯 이미지를 제시합니다. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. 막대는 평균 ± 표준오차(SEM)를 나타내며, 제시된 데이터는 3개의 생물학적 반복 실험 결과를 대표합니다. 다중 비교(p < 0.05)는 일원 분산 분석과 Dunnett 검정을 사용하여 수행했습니다. 원본 겔 및 블롯 이미지는 그림 S1에 제시되어 있습니다.
미토콘드리아 기능 장애는 대사 질환, 심혈관 질환, 근육 질환에서부터 신경계 질환에 이르기까지 다양한 전신 질환과 관련이 있습니다.^1,10 많은 신경퇴행성 질환과 신경퇴행성 질환이 미토콘드리아 기능 장애와 연관되어 있다는 점은 뇌의 전 생애에 걸쳐 이러한 세포소기관의 중요성을 강조합니다. 이러한 질환에는 파킨슨병, 알츠하이머병, 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 등이 있습니다.^3,4,18 그러나 이러한 질환을 연구하기 위한 뇌 조직에 접근하는 것은 특히 기전적 수준에서 어렵기 때문에 세포 모델 시스템이 필수적인 대안입니다. 본 연구에서는 신경 질환, 특히 자폐 스펙트럼 장애에서 관찰되는 미토콘드리아 기능 장애를 재현하기 위해 PPA로 처리한 SH-SY5Y 세포를 이용한 세포 모델 시스템을 사용했습니다. 이 PPA 모델을 이용하여 신경 세포의 미토콘드리아 역학을 연구함으로써 자폐 스펙트럼 장애의 병인을 이해하는 데 도움이 될 수 있을 것입니다.
우리는 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 미토콘드리아 형태 변화를 관찰할 가능성을 탐구했습니다. TEM의 효과를 극대화하기 위해서는 정확한 사용법을 숙지하는 것이 중요합니다. 극저온 시료 준비는 세포 구성 요소를 동시에 고정하고 인공물 생성을 줄임으로써 신경 구조를 더 잘 보존할 수 있도록 합니다.34 이러한 점을 고려하여, 신경 세포와 유사한 SH-SY5Y 세포에서 세포 소기관이 온전하게 유지되고 미토콘드리아가 길쭉한 형태를 보이는 것을 관찰했습니다(그림 1a). 이는 신경 세포 모델에서 미토콘드리아 형태 연구에 극저온 준비 기술이 유용함을 보여줍니다. TEM 데이터의 객관적인 분석을 위해서는 정량적 측정이 필수적이지만, 미토콘드리아 형태 변화를 확인하기 위해 어떤 특정 매개변수를 측정해야 하는지에 대해서는 아직 합의된 바가 없습니다. 미토콘드리아 형태를 정량적으로 조사한 수많은 연구17,31,32를 기반으로, 우리는 면적, 면적2, 종횡비, 둘레, 원형도, 각도, 페렛 직경 및 원형도와 같은 8가지 형태학적 매개변수를 측정하는 자동화된 미토콘드리아 이미지 분석 파이프라인을 개발했습니다.
그중 PPA는 면적 2, 면적, 둘레 및 페렛 직경을 유의하게 감소시켰습니다(그림 1b–e). 이는 미토콘드리아가 더 작고 둥글게 변했음을 보여주는데, 이는 PPA30으로 유도된 미토콘드리아 스트레스 72시간 후 미토콘드리아 면적이 감소한다는 이전 연구 결과와 일치합니다. 이러한 형태학적 특징은 미토콘드리아 분열을 시사할 수 있는데, 이는 손상된 구성 요소를 미토콘드리아 네트워크에서 분리하여 미토파지를 통해 분해를 촉진하는 데 필요한 과정입니다.35,36,37 한편, 평균 미토콘드리아 크기의 감소는 생합성 증가와 관련될 수 있으며, 이는 작고 새로 생성되는 미토콘드리아의 형성을 초래합니다. 분열 또는 생합성 증가는 미토콘드리아 스트레스에 대한 세포 분열 유지를 위한 보상 반응으로 해석될 수 있습니다. 그러나 미토콘드리아 성장 감소, 융합 장애 또는 기타 원인도 배제할 수는 없습니다.
TEM으로 생성된 고해상도 이미지는 개별 미토콘드리아 수준에서 형태학적 특성을 파악할 수 있게 해주지만, 이 방법은 특정 시점의 2차원 스냅샷만을 제공합니다. 대사 스트레스에 대한 동적 반응을 연구하기 위해, 우리는 미토콘드리아를 TMRE로 염색하고 MEL 분석을 이용한 타임랩스 현미경 관찰을 수행했습니다. 이 방법은 시간에 따른 미토콘드리아 네트워크 변화를 고처리량으로 3차원 시각화할 수 있게 해줍니다.33,38 PPA 스트레스 하에서 미토콘드리아 역학에 미묘하지만 중요한 변화가 관찰되었습니다(그림 2). 3mM 농도에서 분열 횟수는 유의미하게 증가한 반면, 융합 횟수는 대조군과 동일하게 유지되었습니다. 5mM PPA 농도에서는 분열 및 융합 횟수 모두 증가했지만, 이러한 변화는 대략 비례하는 양상을 보였는데, 이는 고농도에서 분열 및 융합 속도가 평형에 도달함을 시사합니다(그림 2b). 평균 미토콘드리아 부피는 3mM 및 5mM PPA 농도 모두에서 변화가 없었으며, 이는 미토콘드리아 네트워크의 완전성이 유지되었음을 나타냅니다(그림 2d). 이는 역동적인 미토콘드리아 네트워크가 약한 대사 스트레스에 반응하여 네트워크 분열을 유발하지 않고 항상성을 효과적으로 유지할 수 있음을 보여줍니다. 3mM PPA 농도에서는 분열 증가만으로도 새로운 평형 상태로의 전환을 촉진하기에 충분하지만, 더 높은 농도의 PPA에 의해 유발되는 스트레스에 반응하기 위해서는 더욱 심층적인 운동학적 재구성이 필요합니다.
두 가지 PPA 스트레스 농도 모두에서 미토콘드리아 수는 증가했지만, 평균 미토콘드리아 부피는 유의미하게 변화하지 않았습니다(그림 2c). 이는 생합성 증가 또는 분열 증가 때문일 수 있지만, 평균 미토콘드리아 부피의 유의미한 감소가 없다는 점을 고려하면 생합성이 증가했을 가능성이 더 높습니다. 그러나 그림 2의 데이터는 두 가지 보상 메커니즘의 존재를 뒷받침합니다. 하나는 미토콘드리아 분열의 상향 조절과 일치하는 분열 횟수 증가이고, 다른 하나는 미토콘드리아 생합성과 일치하는 분열 횟수 증가입니다. 궁극적으로, 약한 스트레스에 대한 동적 보상은 분열, 융합, 생합성 및 미토파지를 포함하는 동시적인 과정으로 구성될 수 있습니다. 이전 연구에서는 PPA가 유사분열30,39 및 미토파지29를 촉진한다는 것을 보여주었지만, 본 연구에서는 PPA에 대한 반응으로 미토콘드리아 분열 및 융합 역학의 재구성에 대한 증거를 제시합니다. 이러한 데이터는 TEM으로 관찰된 형태학적 변화를 확인시켜주며, PPA 유발 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 메커니즘에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다.
TEM 분석과 MEL 분석 모두 관찰된 형태학적 변화의 기저에 있는 유전자 조절 메커니즘에 대한 직접적인 증거를 제공하지 못했기 때문에, 우리는 미토콘드리아 대사, ​​생합성 및 역동성에 관여하는 유전자들의 RNA 발현을 조사했습니다. cMYC 원종양유전자는 미토콘드리아, 해당 과정, 아미노산 및 지방산 대사 조절에 관여하는 전사 인자입니다.40 또한, cMYC는 NRF1과 TFAM을 포함하여 미토콘드리아 전사, 번역 및 복합체 조립에 관여하는 약 600개의 미토콘드리아 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있습니다.41 NRF1과 TFAM은 세포 분열의 두 가지 핵심 조절인자로, PGC-1α의 하위 단계에서 작용하여 mtDNA 복제를 활성화합니다. 이 경로는 cAMP 및 AMPK 신호 전달에 의해 활성화되며 에너지 소비 및 대사 스트레스에 민감합니다. 또한, PPA의 효과가 산화 스트레스에 의해 매개되는지 확인하기 위해 미토콘드리아 생합성의 산화환원 조절인자인 NFE2L2의 발현도 조사했습니다.
NFE2L2 발현은 변화가 없었지만, 3mM 및 5mM PPA로 24시간 처리 후 cMYC, NRF1 및 TFAM 발현이 용량 의존적으로 일관되게 감소하는 것을 확인했습니다(그림 3a–c). cMYC 발현 감소는 이전에 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 보고된 바 있으며42, 반대로 cMYC 발현 감소는 미토콘드리아 대사, ​​네트워크 연결성 및 막 극성 재구성을 통해 미토콘드리아 기능 장애를 유발할 수 있습니다43. 흥미롭게도 cMYC는 미토콘드리아 분열 및 융합 조절에도 관여하며42,43, 세포 분열 중 DRP1 인산화 및 미토콘드리아 국소화를 증가시키고44, 신경 줄기 세포에서 미토콘드리아 형태 재구성을 매개하는 것으로 알려져 있습니다45. 실제로 cMYC 결핍 섬유아세포는 PPA43 스트레스에 의해 유도된 변화와 일치하는 미토콘드리아 크기 감소를 나타냅니다. 이러한 데이터는 cMYC와 미토콘드리아 역동성 사이의 흥미롭지만 아직 명확히 밝혀지지 않은 관계를 보여주며, PPA 스트레스 유발 리모델링에 대한 향후 연구를 위한 흥미로운 연구 대상을 제시합니다.
NRF1과 TFAM의 감소는 cMYC가 중요한 전사 활성화인자로서의 역할을 한다는 점과 일치합니다. 이러한 데이터는 인간 결장암 세포에서 PPA가 22시간 후 NRF1 mRNA 발현을 감소시키고, 이는 ATP 고갈 및 ROS46 증가와 관련이 있다는 이전 연구 결과와도 일치합니다. 해당 연구에서는 TFAM 발현이 8.5시간 후에는 증가했지만 22시간 후에는 기저 수준으로 돌아왔다고 보고했습니다. 반면, Kim 등(2019)은 SH-SY5Y 세포에서 PPA 스트레스 4시간 후 TFAM mRNA 발현이 유의하게 감소했지만, 72시간 후에는 TFAM 단백질 발현과 미토콘드리아 DNA 복제 수가 유의하게 증가했다고 보고했습니다. 따라서, 우리가 24시간 후 관찰한 미토콘드리아 생합성 관련 유전자 수의 감소는 미토콘드리아 수의 증가가 초기 시점에서의 생합성 활성화와 관련이 있을 가능성을 배제하지 않습니다. 이전 연구에서는 PPA가 SH-SY5Y 세포에서 4시간 30분 만에 PGC-1α mRNA와 단백질 발현을 유의하게 증가시키고, 송아지 간세포에서는 12시간 39분 만에 PGC-1α를 통해 미토콘드리아 생합성을 촉진한다는 사실이 밝혀졌습니다. 흥미롭게도 PGC-1α는 NRF1과 TFAM의 직접적인 전사 조절자일 뿐만 아니라, 미토콘드리아 분열과 융합을 조절함으로써 MFN2와 DRP1의 활성도 조절하는 것으로 알려져 있습니다.47 이러한 결과들을 종합해 볼 때, PPA에 의해 유도되는 미토콘드리아 보상 반응을 조절하는 기전들이 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있습니다. 더욱이, 본 연구 결과는 PPA 스트레스 하에서 미토콘드리아 생합성과 대사의 전사 조절에 심각한 이상이 발생함을 보여줍니다.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 및 DRP1 유전자는 미토콘드리아 분열, 융합 및 역동성의 핵심 조절인자 중 하나입니다.37,48,49 미토콘드리아 역동성에 관여하는 다른 많은 유전자들이 있지만, STOML2, OPA1 및 MFN2는 이전에 ASD 코호트에서 차등 메틸화되는 것으로 밝혀졌으며,16 여러 독립적인 연구에서 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 이러한 전사 인자의 변화가 보고되었습니다.50,51,52 OPA1과 STOML2의 발현은 3mM 및 5mM PPA 처리로 유의하게 감소했습니다(그림 3e, f). OPA1은 MFN1 및 2와의 직접적인 상호작용을 통해 미토콘드리아 융합을 조절하는 대표적인 조절인자 중 하나이며, 미토콘드리아 내벽 구조 재형성 및 형태에 관여합니다.53 STOML2가 미토콘드리아 역학에서 정확히 어떤 역할을 하는지는 아직 불분명하지만, 미토콘드리아 융합, 생합성 및 자가포식에 관여한다는 증거가 있습니다.
STOML2는 미토콘드리아 호흡 결합 유지 및 호흡 사슬 복합체 형성에 관여하며54,55 암세포의 대사 특성을 크게 변화시키는 것으로 알려져 있습니다56. 연구에 따르면 STOML2는 BAN 및 카르디올리핀과의 상호작용을 통해 미토콘드리아 막 전위 및 생합성을 촉진합니다55, 57, 58. 또한, 독립적인 연구에서는 STOML2와 PINK1의 상호작용이 미토파지를 조절한다는 사실이 밝혀졌습니다59,60. 특히, STOML2는 MFN2와 직접 상호작용하여 안정화시키고, OPA1 분해를 담당하는 프로테아제를 억제함으로써 긴 OPA1 동형 단백질을 안정화시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다53,61,62. PPA 반응에서 관찰되는 STOML2 발현 감소는 이러한 융합 단백질이 유비퀴틴 및 프로테아좀 의존 경로를 통해 분해되기 쉽게 만들 수 있습니다48. PPA에 대한 동적 반응에서 STOML2와 OPA1의 정확한 역할은 불분명하지만, 이들 융합 유전자의 발현 감소(그림 3)는 분열과 융합 사이의 균형을 깨뜨려 미토콘드리아 크기 감소로 이어질 수 있다(그림 3).
반면, OPA1 단백질 발현은 24시간 후에도 변화가 없었으며, MFN1, MFN2 또는 DRP1의 mRNA 및 단백질 수준은 PPA 처리 후에도 유의미한 변화를 보이지 않았습니다(그림 3g-i, 그림 4). 이는 미토콘드리아 융합 및 분열에 관여하는 이러한 인자들의 조절에는 변화가 없음을 시사할 수 있습니다. 그러나 이 네 가지 유전자 각각은 단백질 활성을 조절하는 전사 후 변형(PTM)에 의해서도 조절된다는 점에 주목할 필요가 있습니다. OPA1은 미토콘드리아에서 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 두 가지 다른 이소형을 생성하는 8개의 대체 스플라이스 변이체를 가지고 있습니다.63 긴 이소형과 짧은 이소형 사이의 균형은 궁극적으로 미토콘드리아 융합 및 미토콘드리아 네트워크 유지에서 OPA1의 역할을 결정합니다.64 DRP1 활성은 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 II(CaMKII) 인산화에 의해 조절되는 반면, DRP1 분해는 유비퀴틴화 및 SUMO화에 의해 조절됩니다.65 또한, DRP1과 MFN1/2는 모두 GTPase이므로, 활성은 미토콘드리아 내 GTP 생성 속도의 영향을 받을 수 있습니다.66 따라서 이러한 단백질의 발현은 일정하게 유지되지만, 이는 단백질 활성이나 위치의 변화를 반영하는 것은 아닐 수 있습니다.67,68 실제로, 기존의 PTM 단백질 레퍼토리는 급성 스트레스 반응을 매개하는 1차 방어선 역할을 하는 경우가 많습니다. 본 모델에서 중간 정도의 대사 스트레스가 존재할 경우, PTM은 융합 및 분열 단백질의 활성을 증가시켜 mRNA 또는 단백질 수준에서 이러한 유전자의 추가 활성화 없이도 미토콘드리아의 완전성을 충분히 회복시킬 수 있을 것으로 예상됩니다.
위의 데이터들을 종합해 보면, 미토콘드리아 형태의 복잡하고 시간 의존적인 조절 양상과 이러한 메커니즘을 규명하는 데 따르는 어려움을 알 수 있습니다. 유전자 발현을 연구하기 위해서는 먼저 해당 경로에서 특정 표적 유전자를 식별해야 합니다. 그러나 우리의 데이터는 동일한 경로에 있는 유전자들이 동일한 스트레스에 대해 동일한 방식으로 반응하지 않는다는 것을 보여줍니다. 실제로, 이전 연구에서도 동일한 경로에 있는 서로 다른 유전자들이 서로 다른 시간적 반응 양상을 보일 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다.30,46 또한, 전사와 유전자 기능 간의 관계를 방해하는 복잡한 전사 후 조절 메커니즘이 존재합니다. 단백질체학 연구는 전사 후 변형(PTM)과 단백질 기능의 영향을 파악하는 데 도움을 줄 수 있지만, 처리량 부족, 높은 신호 대 잡음비, 낮은 해상도와 같은 어려움도 안고 있습니다.
이러한 맥락에서, 투과전자현미경(TEM)과 마이크로전자현미경(MEL)을 이용한 미토콘드리아 형태 연구는 미토콘드리아 역동성과 기능 간의 관계 및 이것이 질병에 미치는 영향에 대한 근본적인 질문에 답할 수 있는 큰 잠재력을 지니고 있습니다. 특히, TEM은 미토콘드리아 기능 장애 및 역동성의 수렴적 최종 결과인 미토콘드리아 형태를 직접 측정할 수 있는 방법을 제공합니다.51 MEL 또한 3차원 세포 환경에서 분열 및 융합 현상을 시각화하는 직접적인 방법을 제공하여 유전자 발현 변화가 없는 경우에도 동적인 미토콘드리아 재구성을 정량화할 수 있게 합니다.33 본 연구에서는 이차성 미토콘드리아 질환에서 미토콘드리아 영상 기술의 유용성을 강조합니다. 이러한 질환은 일반적으로 급성 미토콘드리아 손상보다는 미토콘드리아 네트워크의 미묘한 재구성을 특징으로 하는 만성적인 경미한 대사 스트레스를 특징으로 합니다. 그러나 만성 스트레스 하에서 세포 분열을 유지하기 위해 필요한 미토콘드리아 보상 작용은 심각한 기능적 결과를 초래합니다. 신경과학의 관점에서 이러한 보상 메커니즘을 더 잘 이해하면 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 다면발현성 신경병증에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.
궁극적으로, 본 연구 결과는 신경 세포 미토콘드리아 역학을 조절하는 유전자 발현, 단백질 변형 및 단백질 활성 간의 복잡한 상호작용의 기능적 결과를 이해하는 데 있어 영상 기법의 유용성을 강조합니다. 우리는 ASD의 미토콘드리아 구성 요소를 파악하기 위해 신경 세포 모델에서 PPA를 사용하여 미토콘드리아 기능 장애를 모델링했습니다. PPA로 처리된 SH-SY5Y 세포는 미토콘드리아 형태의 변화를 보였습니다. 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰했을 때 미토콘드리아는 작고 둥글게 변했으며, 크리스타는 불분명해졌습니다. MEL 분석 결과, 이러한 변화는 경미한 대사 스트레스에 반응하여 미토콘드리아 네트워크를 유지하기 위해 분열 및 융합 현상이 증가하는 것과 동시에 발생하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, PPA는 미토콘드리아 대사 및 항상성의 전사 조절을 유의미하게 교란시킵니다. 본 연구에서는 cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 및 OPA1을 PPA 스트레스에 의해 교란되는 주요 미토콘드리아 조절인자로 확인했으며, 이들은 PPA에 의해 유도되는 미토콘드리아 형태 및 기능 변화를 매개하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다. 향후 연구에서는 PPA에 의해 유도되는 유전자 발현 및 단백질 활성, 위치, 그리고 번역 후 변형의 시간적 변화를 보다 자세히 규명할 필요가 있습니다. 본 연구 결과는 미토콘드리아 스트레스 반응을 매개하는 조절 메커니즘의 복잡성과 상호의존성을 강조하며, 보다 표적화된 기전 연구를 위해 투과전자현미경(TEM) 및 기타 이미징 기술의 유용성을 보여줍니다.
SH-SY5Y 세포주(ECACC, 94030304-1VL)는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. SH-SY5Y 세포는 25cm2 플라스크에서 Dulbecco 변형 Eagle 배지/F-12 영양 혼합물(DMEM/F-12)과 L-글루타민(SC09411, ScienCell)을 첨가하고, 20% 태아 소 혈청(FBS)(10493106, ThermoFisher Scientific) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P4333-20ML, Sigma-Aldrich)을 넣어 37°C, 5% CO2 조건에서 배양했습니다. 세포를 0.05% 트립신-EDTA(15400054, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 80% 밀도로 계대 배양한 후, 300g에서 원심분리하고 약 7 × 10⁵ 세포/ml의 밀도로 플레이팅했습니다. 모든 실험은 계대 배양 19~22회 사이의 미분화 SH-SY5Y 세포를 사용하여 수행했습니다. PPA는 NaP 형태로 투여했습니다. NaP 분말(CAS 번호 137-40-6, 화학식 C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich)을 따뜻한 MilliQ 증류수에 녹여 1M 농도로 만든 후 4°C에서 보관했습니다. 처리 당일, 이 용액을 무혈청 배지(L-글루타민이 첨가된 DMEM/F-12)에서 1M PPA로 희석하여 3mM 및 5mM PPA를 만들었습니다. 모든 실험의 처리 농도는 PPA 무처리(0mM, 대조군), 3mM 및 5mM PPA였습니다. 실험은 최소 3회 이상의 생물학적 반복 실험을 통해 수행되었다.
SH-SY5Y 세포를 25cm5 플라스크에 5.5 × 10⁵ 세포/ml의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. PPA 처리액은 배양 24시간 전에 플라스크에 첨가했습니다. 일반적인 포유류 조직 계대배양 프로토콜(상기 설명 참조)에 따라 세포 펠렛을 수집했습니다. 세포 펠렛을 100µl의 2.5% 글루타르알데히드, 1× PBS 용액에 재현탁하고 처리 전까지 4°C에서 보관했습니다. SH-SY5Y 세포를 짧게 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들고 2.5% 글루타르알데히드, 1× PBS 용액을 제거했습니다. 침전물을 증류수로 제조한 4% 아가로스 겔에 재현탁했습니다(아가로스와 침전물의 부피 비율은 1:1). 아가로스 조각을 평판 위의 그리드에 놓고 1-헥사데센으로 코팅한 후 고압 동결했습니다. 시료를 100% 건조 아세톤에 넣어 -90°C에서 24시간 동안 냉동했습니다. 그 후 온도를 -80°C로 올리고 1% 사산화오스뮴과 0.1% 글루타르알데히드 용액을 첨가했습니다. 시료를 -80°C에서 24시간 동안 보관했습니다. 이후 온도를 며칠에 걸쳐 실온까지 점진적으로 올렸습니다. -80°C에서 -50°C까지 24시간, -30°C까지 24시간, -10°C까지 24시간, 그리고 마지막으로 실온까지 올렸습니다.
극저온 처리 후, 시료에 수지를 함침시키고 라이카 라이헤르트 울트라컷S 초미세절편기(라이카 마이크로시스템즈)를 사용하여 초박절편(약 100 nm)을 제작했습니다. 절편은 2% 아세트산우라닐과 구연산납으로 염색했습니다. 시료는 200 kV(Lab6 송신기)에서 작동하는 FEI 테크나이 20 투과 전자 현미경(써모피셔(구 FEI), 아인트호벤, 네덜란드)과 트라이디엠 에너지 필터가 장착된 가탄 CCD 카메라(가탄, 영국)를 사용하여 관찰했습니다.
각 기술적 반복 실험에서 최소 24개의 단일 세포 이미지를 획득하여 총 266개의 이미지를 얻었습니다. 모든 이미지는 관심 영역(ROI) 매크로와 미토콘드리아 매크로를 사용하여 분석했습니다. 미토콘드리아 매크로는 기존에 발표된 방법¹⁷,³¹,³²을 기반으로 하며, Fiji/ImageJ⁶⁹에서 TEM 이미지의 반자동 일괄 처리를 가능하게 합니다. 간단히 설명하면, 이미지를 반전시킨 후 롤링 볼 배경 제거(반경 60픽셀)와 FFT 대역 통과 필터(상한 60픽셀, 하한 8픽셀 사용)를 적용하고, 5%의 방향 허용 오차를 갖는 수직선 억제를 통해 다시 반전시킵니다. 처리된 이미지는 최대 엔트로피 알고리즘을 사용하여 자동으로 임계값을 설정하고 이진 마스크를 생성합니다. 원본 TEM 이미지에서 수동으로 선택한 ROI와 관련된 이미지 영역을 추출하여 미토콘드리아를 특징짓고 세포막 및 기타 고대비 영역을 제외했습니다. 추출된 각 ROI에 대해 600픽셀보다 큰 이진 입자를 분석하고, Fiji/ImageJ의 내장 측정 기능을 사용하여 입자 면적, 둘레, 장축 및 단축, 페렛 직경, 원형도 및 원형도를 측정했습니다. Merrill, Flippo 및 Strack(2017)의 방법을 따라, 이러한 데이터로부터 면적², 입자 종횡비(장축 대 단축 비율) 및 형상 계수(FF)를 계산했습니다. 여기서 FF = 둘레²/4π × 면적입니다. 매개변수 공식에 대한 정의는 Merrill, Flippo 및 Strack(2017)에서 확인할 수 있습니다. 언급된 매크로는 GitHub에서 사용할 수 있습니다(데이터 가용성 설명 참조). 평균적으로 PPA 처리당 약 5,600개의 입자를 분석했으며, 총 약 17,000개의 입자를 분석했습니다(데이터는 표시되지 않음).
SH-SH5Y 세포를 8챔버 배양 접시(ThermoFisher, #155411)에 넣어 하룻밤 동안 부착시킨 후, TMRE 1:1000(ThermoFisher, #T669)과 Hoechst 33342 1:200(Sigma-Aldrich, H6024) 염색액으로 처리했습니다. 405nm 및 561nm 레이저를 사용하여 10분 동안 이미지를 획득했으며, 12개의 연속적인 시점에서 0.2μm의 az 간격으로 10개의 이미지 프레임을 포함하는 z-스택으로 원본 이미지를 얻었습니다. 이미지는 Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 초고해상도 플랫폼(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)과 LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 렌즈를 사용하여 촬영했습니다. 이미지는 이전에 설명된 파이프라인과 ImageJ 플러그인을 사용하여 ImageJ에서 분석하여 융합 및 분열 이벤트, 평균 미토콘드리아 구조 수, 세포당 평균 미토콘드리아 부피를 측정했습니다.33 MEL 매크로는 GitHub에서 사용할 수 있습니다(데이터 가용성 설명 참조).
SH-SY5Y 세포를 6웰 플레이트에 0.3 × 10⁶ 세포/mL의 밀도로 24시간 동안 배양한 후 처리하였다. RNA는 Quick-RNA™ Miniprep 프로토콜(ZR R1055, Zymo Research)을 약간 수정하여 추출하였다. 각 웰에 RNA 용해 완충액 300 μl를 첨가한 후, 마지막 단계에서 DNase/RNase가 없는 증류수 30 μl를 사용하여 각 샘플을 용해시켰다. 모든 샘플은 NanoDrop ND-1000 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 양과 질을 확인하였다. 세포 용해물에서 총 단백질은 RIPA 용해 완충액 200 μl를 사용하여 얻었고, 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석법70을 사용하여 정량하였다.
cDNA 합성은 Tetro™ cDNA 합성 키트(BIO-65043, Meridian Bioscience)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 일부 수정하여 수행했습니다. cDNA는 총 RNA 0.7~1 μg을 사용하여 20 μl 반응액에서 합성했습니다. 프라이머는 이전에 발표된 논문 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78에서 선택했으며(표 S1), 프로브는 Integrated DNA Technologies의 PrimerQuest 도구를 사용하여 설계했습니다. 모든 관심 유전자는 핵 B2M 유전자를 기준으로 정규화했습니다. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC 및 OPA1의 유전자 발현은 RT-qPCR로 측정했습니다. 마스터 믹스는 LUNA Taq 폴리머라제(M3003L, New England Biolabs), 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머, cDNA, 그리고 PCR 등급 증류수를 포함하여 각 반응의 최종 부피가 10 μL가 되도록 제조되었습니다. 세포 분열 및 분열 유전자(DRP1, MFN1/2)의 발현은 TaqMan 멀티플렉스 분석법을 사용하여 측정했습니다. Luna Universal Probe qPCR Master Mix(M3004S, New England Biolabs)는 제조사의 지침을 약간 수정하여 사용했습니다. 멀티플렉스 RT-qPCR 마스터 믹스는 1X LUNA Taq 폴리머라제, 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머, 10 μM의 프로브, cDNA, 그리고 PCR 등급 증류수를 포함하여 각 반응의 최종 부피가 20 μL가 되도록 제조되었습니다. RT-qPCR은 Rotor-Gene Q 6-plex(QIAGEN RG—일련번호: R0618110)를 사용하여 수행했습니다. 사이클링 조건은 표 S1에 제시되어 있습니다. 모든 cDNA 샘플은 3회 반복 증폭되었고, 10배 희석 시리즈를 사용하여 표준 곡선을 생성했습니다. 데이터 재현성을 확보하기 위해 3회 반복 샘플에서 주기 임계값 표준 편차(Ct)가 0.5보다 큰 이상치는 분석에서 제거했습니다.30,72 상대적 유전자 발현은 2-ΔΔCt79 방법을 사용하여 계산했습니다.
단백질 시료(60 μg)를 Laemmli 로딩 버퍼와 2:1 비율로 혼합한 후 12% 무색 단백질 겔(Bio-Rad #1610184)에서 전기영동했습니다. Trans-Blot Turbo 시스템(#170-4155, Bio-Rad)을 이용하여 단백질을 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) 멤브레인(#170-84156, Bio-Rad)으로 전사했습니다. 멤브레인을 차단 처리한 후, 적절한 1차 항체(OPA1, MFN1, MFN2 및 DRP1)(1:1000 희석)와 함께 48시간 동안 반응시키고, 이어서 2차 항체(1:10,000 희석)와 함께 1시간 동안 반응시켰습니다. Clarity Western ECL 기질(#170-5061, Bio-Rad)을 사용하여 멤브레인 이미지를 촬영하고 Bio-Rad ChemiDoc MP 시스템으로 분석했습니다. ImageLab 버전 6.1을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 원본 겔 및 블롯 이미지는 그림 S1에 나와 있습니다. 항체 정보는 표 S2에 제공됩니다.
데이터는 최소 3개의 독립 표본의 평균과 표준오차(SEM)로 제시되었습니다. 데이터는 Shapiro-Wilks 검정을 사용하여 정규성을 확인한 후(별도로 명시되지 않은 경우), 가우시안 분포와 동일한 표준편차를 가정하고 분석을 진행했습니다. 또한, Fisher의 MEL LSD 검정(p < 0.05), 일원 분산 분석(처리군 대 대조군 평균), Dunnett의 다중 비교 검정을 사용하여 유의성을 확인했습니다(p < 0.05). 유의한 p값은 그래프에 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 표시했습니다. 모든 통계 분석 및 그래프는 GraphPad Prism 9.4.0을 사용하여 수행 및 생성했습니다.
TEM 이미지 분석을 위한 Fiji/ImageJ 매크로는 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. 미토콘드리아 이벤트 로케이터(MEL) 매크로는 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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