현재 주소: 독일 쾰른 50931, 쾰른 노화 관련 질병의 세포 스트레스 반응 연구 우수 클러스터(CECAD).
미토콘드리아 질환으로 인한 신경퇴행은 신경세포의 대사 가소성이 제한적이기 때문에 비가역적인 것으로 여겨지지만, 체내 신경세포 대사의 세포 자율성에 대한 미토콘드리아 기능 장애의 영향은 제대로 이해되지 않고 있습니다. 본 연구에서는 미토콘드리아 융합 역학의 교란으로 인해 점진적인 산화적 인산화(OXPHOS) 결핍이 발생하는 푸르킨예 신경세포의 세포 특이적 단백질체를 분석했습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 단백질체에 심각한 변화를 유발하며, 궁극적으로 세포 사멸 전에 특정 대사 프로그램이 순차적으로 활성화됨을 발견했습니다. 특히, 피루브산 카르복실화효소(PCx)를 비롯한 TCA 회로 중간체를 보충하는 항노화 효소들의 발현이 뚜렷하게 유도됨을 확인했습니다. PCx 억제는 산화 스트레스와 신경퇴행을 악화시켰으며, 이는 OXPHOS가 결핍된 신경세포에서 PCx가 보호 효과를 나타낸다는 것을 시사합니다. 말기 퇴행성 신경세포에서 미토콘드리아 융합을 회복시키면 이러한 대사적 특성이 완전히 역전되어 세포 사멸을 예방할 수 있었습니다. 우리의 연구 결과는 미토콘드리아 기능 장애에 대한 회복력을 부여하는 이전에 알려지지 않은 경로를 밝혀냈으며, 신경퇴행성 질환이 질병의 후기 단계에서도 되돌릴 수 있음을 보여줍니다.
미토콘드리아가 신경 세포 에너지 대사 유지에 있어 중심적인 역할을 한다는 점은 인간 미토콘드리아 질환과 관련된 광범위한 신경학적 증상에서 강조됩니다. 이러한 질환의 대부분은 미토콘드리아 유전자 발현을 조절하는 유전자 돌연변이(1, 2) 또는 미토콘드리아 역학과 관련된 유전자 파괴로 인해 발생하며, 이는 간접적으로 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 안정성에 영향을 미칩니다(3, 4). 동물 모델 연구에서는 주변 조직의 미토콘드리아 기능 장애에 대한 반응으로 보존적 대사 경로(5-7)가 활성화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 이러한 복잡한 질환의 병인에 대한 심층적인 이해에 중요한 정보를 제공합니다. 이와는 대조적으로, 뇌 미토콘드리아의 아데노신 삼인산(ATP) 생산의 전반적인 실패로 인해 특정 세포 유형에서 발생하는 대사 변화에 대한 이해는 매우 중요하며(8), 질병을 예방하거나 신경퇴행을 방지하는 데 사용할 수 있는 치료 표적을 식별해야 할 필요성을 강조합니다(9). 정보 부족의 원인은 신경 세포가 주변 조직의 세포 유형에 비해 대사적 유연성이 매우 제한적이라고 널리 알려져 있기 때문입니다(10). 이러한 세포들은 시냅스 전달을 촉진하고 손상 및 질병 상태에 반응하기 위해 뉴런에 대사 물질을 공급하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에, 뇌 조직의 까다로운 환경에 맞춰 세포 대사를 조절하는 능력은 거의 신경교 세포에 국한되어 있습니다(11-14). 또한, 뇌 조직의 고유한 세포 이질성은 특정 신경 세포 하위 그룹에서 발생하는 대사 변화를 연구하는 데 큰 어려움을 초래합니다. 결과적으로, 뉴런에서 미토콘드리아 기능 장애가 세포 및 대사에 미치는 정확한 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
미토콘드리아 기능 장애의 대사적 결과를 이해하기 위해, 우리는 미토콘드리아 외막 융합(Mfn2) 파괴로 인한 신경퇴행의 여러 단계에 있는 푸르킨예 신경세포(PN)를 분리했습니다. 인간에서 Mfn2 돌연변이는 샤르코-마리-투스 2A형(15)으로 알려진 유전성 운동 감각 신경병증과 관련이 있지만, 마우스에서 Mfn2의 조건부 파괴는 산화인산화(OXPHOS) 기능 장애를 유도하는 잘 알려진 방법입니다. 다양한 신경세포 아형(16-19)과 그 결과로 나타나는 신경퇴행성 표현형은 운동 장애(18, 19) 또는 소뇌 운동실조(16)와 같은 진행성 신경 증상을 동반합니다. 본 연구에서는 라벨 없는 정량적 단백질체학(LFQ)과 대사체학, 영상화 및 바이러스학적 방법을 조합하여 진행성 신경퇴행이 생체 내 말초신경세포(PN)의 동맥경화에 관여하는 피루브산 카르복실화효소(PCx) 및 기타 인자들의 발현을 강력하게 유도함을 보여줍니다. 이러한 결과의 타당성을 검증하기 위해, Mfn2 결핍 말초신경세포에서 PCx 발현을 특이적으로 억제한 결과, 산화 스트레스가 악화되고 신경퇴행이 가속화되는 것을 확인했습니다. 이는 무정자증이 세포 사멸에 대한 대사적 적응성을 부여함을 입증합니다. MFN2의 심각한 발현은 심각한 산화적 인산화 결핍, 미토콘드리아 DNA의 대량 소모, 그리고 명백히 파괴된 미토콘드리아 네트워크를 보이는 말기 퇴행성 말초신경세포를 완전히 회복시킬 수 있으며, 이는 이러한 형태의 신경퇴행이 세포 사멸 이전 질병의 진행 단계에서도 회복될 수 있음을 시사합니다.
Mfn2 녹아웃 PN에서 미토콘드리아를 시각화하기 위해, Cre 의존성 미토콘드리아 표적화 노란 형광 단백질(YFP)(mtYFP)(20) Cre 발현을 허용하는 마우스 계통을 사용하여 생체 내에서 미토콘드리아 형태를 확인했습니다. PN에서 Mfn2 유전자의 파괴는 미토콘드리아 네트워크의 점진적인 분열을 초래하며(그림 S1A), 가장 빠른 변화는 생후 3주에 나타났습니다. 대조적으로, 칼빈딘 면역염색 소실로 나타나는 PN 세포층의 상당한 퇴화는 생후 12주가 되어서야 시작되었습니다(그림 1, A 및 B). 미토콘드리아 형태의 가장 빠른 변화와 신경 세포 사멸의 가시적인 시작 사이의 시간적 불일치는 세포 사멸 이전에 미토콘드리아 기능 장애로 인해 유발되는 대사 변화를 조사하도록 했습니다. 우리는 형광활성세포분류(FACS) 기반 전략을 개발하여 YFP(YFP+)를 발현하는 말초신경세포(PN)를 분리했습니다(그림 1C). 대조군 마우스(Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre, 이하 CTRL로 지칭)에서도 동일한 전략을 적용했습니다(그림 S1B). YFP 신호의 상대적 강도를 기반으로 한 게이팅 전략 최적화를 통해 YFP+ 말초신경세포(YFPhigh)를 비말초신경세포(YFPneg)(그림 S1B) 또는 형광을 띠는 것으로 추정되는 축삭/수상돌기 조각(YFPlow; 그림 S1D, 왼쪽)으로부터 분리할 수 있었으며, 이는 공초점 현미경으로 확인했습니다(그림 S1D, 오른쪽). 분류된 세포 집단의 정체를 확인하기 위해 LFQ 프로테오믹스 및 주성분 분석을 수행한 결과, YFPhigh 세포와 YFPneg 세포가 명확하게 분리됨을 확인했습니다(그림 S1C). YFPhigh 세포는 알려진 PN 마커(예: Calb1, Pcp2, Grid2 및 Itpr3)의 순 농축을 보였지만(21, 22), 뉴런이나 다른 세포 유형에서 일반적으로 발현되는 단백질의 농축은 나타나지 않았습니다(그림 1D). 독립적인 실험에서 수집된 분류된 YFPhigh 세포 샘플 간의 비교는 상관 계수가 0.9보다 커서 생물학적 반복 실험 간의 우수한 재현성을 보여주었습니다(그림 S1E). 요약하면, 이러한 데이터는 실현 가능한 PN을 급성적이고 특이적으로 분리하기 위한 우리의 계획을 검증했습니다. 사용된 L7-cre 드라이버 시스템은 분만 후 첫 주에 모자이크 재조합을 유도하기 때문에(23), 우리는 CTRL 및 조건부(Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) 마우스에서 뉴런을 수집하기 시작했습니다. 재조합이 완료되면 4주령에 Mfn2cKO라고 명명했습니다. 최종 시점으로, 미토콘드리아 파편화가 뚜렷하게 나타났음에도 불구하고 PN층이 온전하게 유지된 생후 8주를 선택했습니다(그림 1B 및 그림 S1A). 총 3013개의 단백질을 정량화했으며, 이 중 약 22%는 미토콘드리아 프로테옴 기반의 MitoCarta 2.0 주석에 따라 미토콘드리아로 분류되었습니다(그림 1E)(24). 생후 8주에 수행된 차등 유전자 발현 분석 결과, 전체 단백질 중 10.5%만이 유의미한 변화를 보였으며(그림 1F 및 그림 S1F), 이 중 195개는 하향 조절되었고 120개는 상향 조절되었습니다(그림 1F). 이 데이터 세트에 대한 "혁신적인 경로 분석" 결과, 차등 발현 유전자들은 주로 특정 대사 경로의 제한된 집합에 속하는 것으로 나타났습니다(그림 1G). 흥미롭게도, OXPHOS 및 칼슘 신호 전달과 관련된 경로의 하향 조절은 융합 결핍 PN에서 미토콘드리아 기능 장애 유도를 확인시켜 주지만, 주로 아미노산 대사와 관련된 다른 범주들은 유의미하게 상향 조절되어 미토콘드리아 PN의 재배선에서 발생하는 대사와 일치합니다.
(A) CTRL 및 Mfn2cKO 마우스의 소뇌 단면을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 사진으로, PN(칼빈딘, 회색)의 점진적인 소실을 나타낸다. 핵은 DAPI로 대조 염색되었다. (B) (A)의 정량 분석(일원 분산 분석, ***P<0.001; 3마리 마우스에서 얻은 4~6개의 원형 샘플). (C) 실험 과정. (D) 푸르킨예 세포(상단) 및 기타 세포 유형(중간)에 특이적인 마커의 분포를 나타낸 히트맵. (E) 분류된 PN에서 확인된 미토콘드리아 단백질의 수를 보여주는 벤 다이어그램. (F) 8주차 Mfn2cKO 뉴런에서 차등 발현된 단백질의 화산 플롯(유의성 임계값 1.3). (G) 창의성 경로 분석은 8주차에 분류된 Mfn2cKO PN에서 가장 중요한 5가지 상향 조절(빨간색) 및 하향 조절(파란색) 경로를 보여준다. 각 단백질의 평균 발현 수준이 표시되어 있다. 회색조 히트맵: 조정된 P값. ns, 중요하지 않음.
프로테오믹스 데이터는 복합체 I, III, IV의 단백질 발현이 점차 감소함을 보여주었습니다. 복합체 I, III, IV는 모두 필수적인 mtDNA 코딩 서브유닛을 포함하고 있는 반면, 핵 코딩 서브유닛만 포함하는 복합체 II는 기본적으로 영향을 받지 않았습니다(그림 2A 및 그림 S2A). 프로테오믹스 결과와 일치하게, 소뇌 조직 절편의 면역조직화학 분석 결과, PN에서 복합체 IV의 MTCO1(미토콘드리아 시토크롬 C 산화효소 서브유닛 1) 서브유닛 수준이 점차 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 2B). mtDNA 코딩 서브유닛인 Mtatp8은 유의하게 감소한 반면(그림 S2A), 핵 코딩 ATP 합성효소 서브유닛의 정상 상태 수준은 변하지 않았습니다. 이는 mtDNA 발현이 안정적일 때 안정적인 ATP 합성효소 서브어셈블리 F1 복합체가 형성된다는 기존 연구 결과와 일치합니다(7). 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 이용하여 분리된 Mfn2cKO PN에서 mtDNA 수준을 평가한 결과, mtDNA 복제 수가 점진적으로 감소하는 것을 확인했습니다. 대조군과 비교했을 때, 8주령에는 mtDNA 수준이 약 20%만 남아 있었습니다(그림 2C). 이러한 결과와 일관되게, Mfn2cKO PN의 공초점 현미경 염색을 통해 DNA를 검출한 결과, 미토콘드리아 뉴클레오티드의 시간 경과에 따른 소모를 관찰할 수 있었습니다(그림 2D). 미토콘드리아 단백질 분해 및 스트레스 반응에 관여하는 Lonp1, Afg3l2, Clpx 및 OXPHOS 복합체 조립 인자를 포함한 일부 후보 유전자만 상향 조절되었음을 확인했습니다. 세포 사멸에 관여하는 단백질 수준에서는 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 S2B). 마찬가지로, 칼슘 수송에 관여하는 미토콘드리아 및 소포체 채널에서도 미미한 변화만 나타났습니다(그림 S2C). 또한, 자가포식 관련 단백질 평가에서는 유의미한 변화가 발견되지 않았으며, 이는 면역조직화학 및 전자현미경을 통해 생체 내에서 관찰된 자가포식소의 가시적인 유도와 일치합니다(그림 S3). 그러나 PN에서 진행되는 산화적 인산화(OXPHOS) 기능 장애는 뚜렷한 미토콘드리아의 미세구조적 변화를 동반합니다. 5주 및 8주령 Mfn2cKO PN의 세포체와 수상돌기에서 미토콘드리아 클러스터가 관찰되었으며, 내막 구조는 심각한 변화를 겪었습니다(그림 S4, A 및 B). 이러한 미세구조적 변화 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 현저한 감소와 일관되게, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM)를 이용한 급성 소뇌 절편 분석 결과, Mfn2cKO PN의 미토콘드리아 막 전위가 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 S4C).
(A) OXPHOS 복합체의 발현 수준에 대한 시간 경과 분석. 8주 시점에서 P<0.05인 단백질만 고려하였다(이원 분산 분석). 점선: 대조군과 비교하여 조정하지 않음. (B) 왼쪽: 항-MTCO1 항체로 표지된 소뇌 단면의 예(척도 막대, 20 μm). 푸르킨예 세포체가 차지하는 영역은 노란색으로 표시되어 있다. 오른쪽: MTCO1 수준 정량화(일원 분산 분석; 3마리 마우스에서 분석한 세포 수 n = 7~20개). (C) 분리된 PN에서 mtDNA 복제 수의 qPCR 분석(일원 분산 분석; 3~7마리 마우스). (D) 왼쪽: 항-DNA 항체로 표지된 소뇌 절편의 예(척도 막대, 20 μm). 푸르킨예 세포체가 차지하는 영역은 노란색으로 표시되어 있다. 오른쪽: mtDNA 손상 정량화(일원 분산 분석; 3마리 마우스에서 얻은 세포 수 n = 5~9개). (E) 전세포 패치 클램프 기록에서 mitoYFP+ ​​푸르킨예 세포(화살표)를 보여주는 급성 소뇌 단면의 예. (F) IV 곡선 정량화. (G) CTRL 및 Mfn2cKO 푸르킨예 세포에 탈분극 전류를 주입했을 때의 대표적인 기록. 위쪽 파형: 활동 전위를 유발한 첫 번째 펄스. 아래쪽 파형: 최대 활동 전위 빈도. (H) 시냅스 후 자발적 입력(sPSP) 정량화. 대표적인 기록 파형과 확대 비율은 (I)에 나와 있다. 3마리 마우스에서 얻은 세포 수 n = 5~20개를 대상으로 일원 분산 분석을 수행했다. 데이터는 평균±표준오차로 표시된다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) 천공 패치 클램프 모드를 사용하여 기록한 자발적 활동 전위의 대표적인 파형. 위쪽 파형: 최대 활동 전위 빈도. 하단 그래프: 단일 활동 전위(AP)의 확대. (K) (J)에 따라 평균 및 최대 AP 빈도를 정량화합니다. Mann-Whitney 검정; 4마리 쥐에서 5개의 세포를 분석했습니다. 데이터는 평균±표준오차로 표시됩니다. 중요하지 않습니다.
8주령 Mfn2cKO PN에서 명백한 OXPHOS 손상이 관찰되었으며, 이는 뉴런의 생리적 기능이 심각하게 비정상적임을 나타냅니다. 따라서 우리는 급성 소뇌 절편에서 전세포 패치 클램프 기록을 수행하여 4~5주령 및 7~8주령의 OXPHOS 결핍 뉴런의 수동 전기적 특성을 분석했습니다(그림 2E). 예상치 못하게, Mfn2cKO 뉴런의 평균 안정막 전위와 입력 저항은 세포 간에 미묘한 차이가 있었지만 대조군과 유사했습니다(표 1). 마찬가지로, 4~5주령에서는 전류-전압 관계(IV 곡선)에서 유의미한 변화가 발견되지 않았습니다(그림 2F). 그러나 7~8주령의 Mfn2cKO 뉴런은 IV 요법(과분극 단계)에서 생존하지 못했는데, 이는 이 후기 단계에서 과분극 전위에 대한 민감성이 뚜렷하게 나타남을 시사합니다. 대조적으로, Mfn2cKO 뉴런에서는 반복적인 활동전위(AP) 방전을 유발하는 탈분극 전류가 잘 견뎌져, 전체적인 방전 패턴이 8주령 대조군 뉴런의 패턴과 크게 다르지 않음을 나타냅니다(표 1 및 그림 2G). 마찬가지로, 자발적 시냅스후 전류(sPSC)의 빈도와 진폭은 대조군과 유사했으며, 발생 빈도는 4주에서 5주, 7주, 8주로 갈수록 유사하게 증가했습니다(그림 2, H 및 I). PN의 시냅스 성숙 기간(25). 천공된 PN 패치를 사용한 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 이러한 구성은 전체 세포 패치 클램프 기록에서 발생할 수 있는 세포 ATP 결함의 보상 가능성을 방지합니다. 특히, Mfn2cKO 뉴런의 안정막전위와 자발적 발화 빈도는 영향을 받지 않았습니다(그림 2, J 및 K). 요약하자면, 이러한 결과는 산화적 인산화 기능 장애가 뚜렷한 PN도 고주파 방전 패턴에 잘 대처할 수 있음을 보여주며, 이는 PN이 거의 정상적인 전기생리학적 반응을 유지할 수 있도록 하는 보상 메커니즘이 존재함을 시사합니다.
데이터는 평균 ± 표준오차(일원 분산 분석, Holm-Sidak 다중 비교 검정; *P<0.05)로 표시됩니다. 단위 번호는 괄호 안에 표시됩니다.
우리는 단백질체 데이터 세트(그림 1G)의 어떤 범주에 심각한 OXPHOS 결핍을 상쇄할 수 있는 경로가 포함되어 있는지 조사하여, 영향을 받은 PN이 거의 정상적인 전기생리학을 유지할 수 있는 이유를 설명하고자 했습니다(그림 2, E~K). 단백질체 분석 결과, 분지사슬 아미노산(BCAA)의 이화작용에 관여하는 효소들이 유의하게 상향 조절되었으며(그림 3A 및 그림 S5A), 최종 생성물인 아세틸-CoA(CoA) 또는 숙시닐 CoA는 삼카르복실산(TCA) 회로에서 트리카르복실산을 보충할 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 BCAA 트랜스아미나제 1(BCAT1)과 BCAT2의 함량이 모두 증가했음을 발견했습니다. 이들은 α-케토글루타르산으로부터 글루타메이트를 생성함으로써 BCAA 이화작용의 첫 번째 단계를 촉매합니다(26). 분지사슬 케토산 탈수소효소(BCKD) 복합체를 구성하는 모든 소단위체가 상향 조절되었습니다(이 복합체는 생성된 분지사슬 아미노산(BCAA) 탄소 골격의 후속적이고 비가역적인 탈카르복실화를 촉매합니다)(그림 3A 및 그림 S5A). 그러나 분리된 PN에서 BCAA 자체의 뚜렷한 변화는 발견되지 않았는데, 이는 이러한 필수 아미노산의 세포 흡수 증가 또는 TCA 회로를 보충하기 위해 다른 공급원(포도당 또는 젖산)의 사용 때문일 수 있습니다(그림 S5B). 산화적 인산화(OXPHOS)가 결핍된 PN은 또한 8주령에 글루타민 분해 및 트랜스아미네이션 활성이 증가했는데, 이는 미토콘드리아 효소인 글루타미나제(GLS)와 글루타민 피루브산 트랜스아미나제 2(GPT2)의 상향 조절로 나타납니다(그림 3, A 및 C). GLS의 상향 조절은 스플라이스된 동형 글루타미나제 C(GLS-GAC)에만 국한된다는 점(Mfn2cKO/CTRL의 변화는 약 4.5배, P = 0.05)과 암 조직에서의 특이적 상향 조절이 미토콘드리아 생체 에너지를 지원할 수 있다는 점에 주목할 가치가 있다.(27).
(A) 히트맵은 8주 후 특정 경로에서 단백질 수준의 변화율을 보여줍니다. (B) 항-PCx 항체로 표지된 소뇌 절편의 예(척도 막대, 20 μm). 노란색 화살표는 푸르킨예 세포체를 가리킵니다. (C) 죽상경화증의 중요한 후보로 확인된 단백질의 시간 경과에 따른 발현 분석(다중 t-검정, *FDR <5%; n = 3-5마리). (D) 위: [1-13C]피루브산 추적자에 포함된 표지된 탄소가 들어가는 다양한 경로(즉, PDH 또는 경동맥 경로)를 보여주는 개략도. 아래: 바이올린 차트는 급성 소뇌 절편을 [1-13C]피루브산으로 표지한 후 단일 표지된 탄소(M1)가 아스파르트산, 시트르산 및 말산으로 전환된 비율을 보여줍니다(쌍체 t-검정; ** P <0.01). (E) 표시된 경로에 대한 종합적인 시간 경과 분석. 8주 시점에서 P<0.05인 단백질만 고려했습니다. 점선: 조정 값 없음(이원 분산 분석; * P <0.05; *** P <0.001). 데이터는 평균±표준오차로 표시됩니다.
우리의 분석에서 BCAA 이화작용은 주요 상향 조절 경로 중 하나가 되었습니다. 이 사실은 OXPHOS가 결핍된 PN에서 TCA 사이클로 들어가는 환기량이 변화될 수 있음을 강력하게 시사합니다. 이는 신경 세포 대사 재배선의 주요 형태를 나타낼 수 있으며, 심각한 OXPHOS 기능 장애 유지 동안 신경 세포 생리 및 생존에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 가설과 일관되게, 우리는 주요 항동맥경화 효소인 PCx가 상향 조절됨을 발견했습니다(Mfn2cKO/CTRL은 약 1.5배 변화, 그림 3A). PCx는 피루브산을 옥살로아세트산으로 전환하는 반응을 촉매하며(28), 뇌 조직에서 발현은 성상세포에 국한되는 것으로 알려져 있습니다(29, 30). 단백질체학 결과와 일관되게, 공초점 현미경 관찰 결과 PCx 발현이 OXPHOS 결핍 PN에서 특이적으로 유의미하게 증가한 반면, 대조군에서는 PCx 반응성이 주로 인접한 베르그만 신경교세포에 국한되었음을 보여주었습니다(그림 3B). 관찰된 PCx 발현 증가를 기능적으로 검증하기 위해, 급성 소뇌 절편에 [1-13C]피루브산 추적자를 처리했습니다. 피루브산이 피루브산 탈수소효소(PDH)에 의해 산화되면 동위원소 표지가 사라지지만, 혈관 반응에 의해 대사될 때 TCA 회로 중간체에 통합됩니다(그림 3D). 단백질체학 데이터를 뒷받침하듯, Mfn2cKO 절편의 아스파르트산에서 이 추적자의 표지자가 다수 관찰되었으며, 시트르산과 말산에서도 유의미하지는 않지만 중간 정도의 증가 경향이 나타났습니다(그림 3D).
미토콘드리아 전사 인자 A 유전자(Tfam)를 특이적으로 파괴하여 미토콘드리아 기능 장애를 유발한 MitoPark 마우스의 도파민 신경 세포에서 PCx 발현 또한 유의하게 상향 조절되었습니다(그림 S6B)(31). 이는 아세톤산 동맥경화증의 발생이 체내 신경 세포의 산화적 인산화(OXPHOS) 기능 장애 동안 조절됨을 시사합니다. 동맥경화증과 관련될 수 있는 신경 세포에서 발현될 수 있는 특이 효소(32-34)가 산화적 인산화가 결핍된 PN에서 유의하게 상향 조절되는 것으로 밝혀졌는데, 여기에는 프로피오닐-CoA 카르복실라제(PCC-A), 프로피오닐-CoA를 숙시닐-CoA로 전환하는 말로닐-CoA 효소, 그리고 말산으로부터 피루브산을 회수하는 주요 역할을 하는 미토콘드리아 말산 효소 3(ME3) 등이 포함됩니다(그림 3, A 및 C)(33, 35). 또한, PDH를 인산화하여 불활성화시키는 Pdk3 효소의 유의미한 증가가 관찰되었지만(36), PDH를 활성화시키는 Pdp1 효소나 PDH 효소 복합체 자체에서는 변화가 감지되지 않았습니다(그림 3A). 마찬가지로, Mern2cKO PN에서는 PDH 복합체의 피루브산 탈수소효소 E1 구성 요소의 α1 서브유닛 α(PDHE1α) 서브유닛의 Ser293(PDH 효소 활성을 억제하는 것으로 알려짐)의 인산화가 증가했습니다(그림 S6C). 피루브산은 혈관을 통해 전달되지 않습니다.
마지막으로, 세린과 글리신 생합성의 주요 경로, 관련 미토콘드리아 엽산(1C) 주기 및 프롤린 생합성(그림 1G 및 그림 S5C)이 모두 활성화 과정 동안 보고된 바와 같이 유의하게 상향 조절됨을 확인했습니다. 주변 조직은 미토콘드리아 기능 장애로 인해 활성화됩니다(5-7). 이러한 단백질체학 데이터를 뒷받침하는 공초점 현미경 분석 결과, 산화적 인산화(OXPHOS)가 결핍된 PN에서 8주령 마우스의 소뇌 절편에서 미토콘드리아 엽산 주기의 핵심 효소인 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 2(SHMT2)의 발현이 유의하게 증가했습니다(그림 S5D). 13 CU-포도당을 처리한 급성 소뇌 절편에서 대사 추적 실험을 통해 세린과 프롤린 생합성의 상향 조절이 추가적으로 확인되었으며, 이는 세린과 프롤린으로의 탄소 동위체의 흐름이 증가했음을 나타냅니다(그림 S5E). GLS와 GPT2에 의해 촉진되는 반응은 글루타민으로부터 글루타메이트 합성 및 글루타메이트와 α-케토글루타레이트 간의 트랜스아미네이션을 담당하므로, 이들의 상향 조절은 OXPHOS 결핍 뉴런이 글루타메이트에 대한 수요 증가를 나타낸다는 것을 의미합니다. 이는 프롤린 생합성 증가를 유지하기 위한 것일 수 있습니다(그림 S5C). 이러한 변화와는 대조적으로, PN 특이적 Mfn2cKO 마우스의 소뇌 성상세포에 대한 단백질체 분석 결과, 이러한 경로(모든 항과산화효소 포함)의 발현이 크게 변화하지 않은 것으로 나타났습니다. 이는 이러한 대사적 재조정이 분해된 PN에 선택적임을 보여줍니다(그림 S6, D~G).
요약하자면, 이러한 분석은 PN에서 특정 대사 경로의 시간적 활성화 패턴이 상당히 다르다는 것을 보여주었습니다. 비정상적인 신경 세포 미토콘드리아 기능은 조기 동맥경화 및 TCA 회로 재형성(그림 3E 및 그림 S5C)으로 이어질 수 있으며, I 및 IV 복합체의 발현에 예측 가능한 변화를 일으킬 수도 있지만, 세린 신생 합성의 변화는 후기 단계에서만 분명하게 나타났습니다. 산화적 인산화(OXPHOS) 기능 장애(그림 3E 및 그림 S5C). 이러한 결과는 스트레스 유발 미토콘드리아(TCA 회로) 및 세포질(세린 생합성) 반응이 TCA 회로의 동맥경화 증가와 시너지 효과를 내어 신경 세포 대사를 재구성하는 순차적인 과정을 규명합니다.
8주령의 OXPHOS 결핍 PN은 고주파 흥분 활동을 유지하고 미토콘드리아 기능 장애를 보상하기 위해 상당한 대사 재연결을 겪을 수 있습니다. 이 발견은 이러한 세포들이 이 시점에서도 치료적 개입을 통해 신경퇴행을 지연시키거나 예방할 수 있다는 흥미로운 가능성을 제시합니다. 우리는 두 가지 독립적인 개입을 통해 이 가능성을 확인했습니다. 첫 번째 방법에서는 Cre 의존성 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 설계하여 생체 내에서 OXPHOS 결핍 PN에 MFN2가 선택적으로 발현되도록 했습니다(그림 S7A). MFN2와 형광 리포터 유전자 mCherry를 인코딩하는 AAV(Mfn2-AAV)는 시험관 내 일차 신경 세포 배양에서 검증되었으며, 이는 Cre 의존적인 방식으로 MFN2를 발현시키고 미토콘드리아 형태를 회복시켜 Mfn2cKO 신경 세포에서 신경 돌연변이를 예방했습니다(그림 S7, B, D 및 E). 다음으로, 생체 내 실험을 통해 8주령 Mfn2-AAV를 Mfn2cKO 마우스와 대조군 마우스의 소뇌 피질에 정위적으로 전달하고 12주령 마우스를 분석했습니다(그림 4A). 치료받은 Mfn2cKO 마우스는 사망했습니다(그림 1, A 및 B)(16). 생체 내 바이러스 전달은 일부 소뇌 영역에서 PN의 선택적 발현을 유도했습니다(그림 S7, G 및 H). mCherry만 발현하는 대조군 AAV(Ctrl-AAV)를 주입했을 때는 Mfn2cKO 동물의 신경퇴행 정도에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 반면, Mfn2-AAV를 전달받은 Mfn2cKO 마우스를 분석한 결과, PN 세포층의 유의미한 보호 효과가 나타났습니다(그림 4, B 및 C). 특히, 신경 세포 밀도는 대조군 동물과 거의 구별할 수 없는 것으로 보입니다(그림 4, B 및 C, 그리고 그림 S7, H 및 I). MFN1의 발현은 MFN2와 달리 신경 세포 사멸을 억제하는 데 동등하게 효과적이었으며(그림 4C 및 그림 S7, C 및 F), 이는 이소성 MFN1 발현이 MFN2 결핍을 효과적으로 보완할 수 있음을 시사합니다. 단일 PN 수준에서의 추가 분석 결과, Mfn2-AAV는 미토콘드리아의 미세구조를 크게 회복시키고, mtDNA 수준을 정상화하며, 항혈관신생 마커인 PCx의 과발현을 역전시켰습니다(그림 4, C~E). 휴식 상태의 Mfn2cKO 마우스를 육안으로 관찰한 결과, 자세 및 운동 증상(움직임 S1~S3)이 개선된 것을 확인했습니다. 결론적으로, 이러한 실험들은 산화적 인산화가 심각하게 결핍된 PN에 MFN2를 지연 재도입하는 것만으로도 mtDNA 소모를 되돌리고 동맥경화 유발을 억제하여 생체 내에서 축삭 변성과 신경 세포 사멸을 예방할 수 있음을 보여줍니다.
(A) 표시된 대사 경로가 활성화될 때 MFN2를 인코딩하는 AAV를 주입하는 실험 일정을 보여주는 모식도. (B) Mfn2cKO 마우스에서 8주차에 형질전환시키고 항-칼빈딘 항체로 표지한 12주령 소뇌 절편의 대표적인 공초점 현미경 이미지. 오른쪽: 축삭 섬유의 크기. 축삭 확대 배율은 450μm와 75μm이다. (C) 왼쪽: AAV 형질전환 루프(AAV+)에서 푸르킨예 세포 밀도 정량화(일원 분산 분석; n = 3마리). 오른쪽: 12주차에 형질전환된 PN에서 mtDNA 초점 분석(비대응 t-검정; 3마리 마우스에서 얻은 6개 세포). * P <0.05; ** P <0.01. (D) 표시된 바이러스 벡터로 형질전환된 Mfn2cKO 소뇌 절편의 PN에 대한 대표적인 투과 전자 현미경 이미지. 분홍색 마스크는 수상돌기가 차지하는 영역을 나타내고, 노란색 점선 사각형은 오른쪽에 제공된 확대 영역을 나타냅니다. n은 핵을 나타냅니다. 스케일 바는 1μm입니다. (E)는 12주에 형질전환된 PN에서 PCx 염색의 예를 보여줍니다. 스케일 바는 20μm입니다. OE는 과발현, FC는 배율 변화를 나타냅니다.
마지막으로, 산화적 인산화(OXPHOS) 기능 장애를 겪은 PN에서 퍼옥시다아제 유도 세포 생존의 중요성을 조사했습니다. 마우스 PCx mRNA를 특이적으로 표적하는 AAV-shRNA(짧은 헤어핀 RNA)를 인코딩하는 mCherry를 제작하고(AAV-shPCx), 이 바이러스 또는 스크램블된 대조군(AAV-scr)을 Mfn2cKO 마우스의 소뇌에 주입했습니다. PCx 발현이 증가하고(그림 3C) PN 세포층이 여전히 온전한 상태인(그림 1A) 시기에 PCx 발현을 효과적으로 억제하기 위해 생후 4주차에 주입을 실시했습니다(그림 5A). PCx 발현 억제(그림 S8A)는 감염된 고리에 국한된 PN 세포 사멸을 현저하게 가속화시키는 것으로 나타났습니다(그림 5, B 및 C). PCx 상향 조절에 의해 유도되는 대사 효과의 메커니즘을 이해하기 위해, PCx 녹다운 후 PN의 산화환원 상태를 연구하고 AAV 매개 광학 바이오센서 Grx1-roGFP2를 동시에 발현시켜 글루타티온 펩타이드 산화환원 전위의 상대적 변화를 평가했습니다(그림 S8, B~D)(38). 그런 다음, 7주령 Mfn2cKO 또는 대조군 동배 생쥐의 급성 뇌 절편에서 이광자 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 세포질 산화환원 상태의 잠재적 변화를 감지했습니다(그림 S8, E~G). 분석 결과, PCx 발현이 결핍된 단일 Mfn2cKO PN의 산화 상태가 대조군 뉴런이나 스크램블된 shRNA만 발현하는 Mfn2cKO PN과 비교하여 유의하게 증가한 것을 확인했습니다(그림 5, D 및 E). PCx 발현이 하향 조절되었을 때, 고도로 산화된 상태를 보이는 Mfn2cKO PN의 비율이 3배 이상 증가했습니다(그림 5E). 이는 PCx 상향 조절이 퇴화된 뉴런의 산화환원 능력을 유지했음을 나타냅니다.
(A) 표시된 대사 경로가 활성화될 때 shPCx를 인코딩하는 AAV를 주입하는 실험 일정을 나타내는 모식도. (B) 4주차에 항칼시뉴린 항체로 표지된 Mfn2cKO 마우스의 8주령 소뇌 단면의 대표적인 공초점 현미경 사진. 스케일 바: 450μm. (C) AAV가 주입된 루프에서 푸르킨예 세포 밀도 정량화(일원 분산 분석; n = 3~4마리). 데이터는 평균±표준오차로 표시됨; ***P<0.001. (D) 지정된 실험 조건에서 글루타티온 산화환원 센서 Grx1-roGFP2를 발현하는 7주령 PN의 평균 수명을 보여주는 대표적인 FLIM 사진. LUT(룩업 테이블) 비율: 생존 시간 간격(피코초). 스케일 바: 25μm. (E) 히스토그램은 (D)에서 얻은 Grx1-roGFP2 수명 값의 분포를 보여줍니다(각 조건에서 두 마리의 마우스에서 158~368개의 세포). 각 히스토그램 위의 원형 차트는 CTRL-AAV-scr의 평균 수명 값의 1 표준편차를 초과하는, 유의미하게 긴(빨간색, 산화형) 또는 짧은(파란색, 환원형) 수명 값을 가진 세포의 수를 나타냅니다. (F) 제안된 모델은 신경 세포 PCx의 상향 조절에 따른 보호 효과를 보여줍니다.
종합적으로, 본 연구에서 제시하는 데이터는 MFN2의 재발현이 심각한 산화적 인산화 결핍, 심각한 미토콘드리아 DNA 고갈, 그리고 극도로 비정상적인 이스타 유사 형태를 보이는 진행성 말초신경병증을 완전히 회복시켜, 진행된 질병에서도 지속적인 진행을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 신경퇴행은 세포 사멸 이전 단계의 가역적인 증거를 제공합니다. 이러한 대사적 유연성은 신경세포가 죽상동맥경화증(TCA 회로의 재배선)을 유도하는 능력에 의해 더욱 강조됩니다. 죽상동맥경화증은 산화적 인산화가 결핍된 말초신경병증에서 PCx 발현을 억제하고 세포 사멸을 촉진하여 보호 역할을 합니다(그림 5F).
본 연구에서는 PN이 OXPHOS 기능 장애에 반응하여 대사 프로그램에 의해 활성화되는 차별적 활성화 경로를 통해 TCA 회로 동맥경화로 점진적으로 수렴한다는 증거를 제시했습니다. 다양한 보완적인 방법을 통해 단백질체 분석을 확인하고, 심각한 미토콘드리아 기능 장애에 직면했을 때 뉴런이 이전에 알려지지 않은 형태의 대사적 탄력성을 나타낸다는 것을 밝혀냈습니다. 놀랍게도, 전체 재배선 과정이 점진적이고 비가역적인 신경퇴행을 동반하는 최종적인 대사 상태를 반드시 나타내는 것은 아니며, 오히려 세포 사멸 이전 단계에서도 유지 뉴런의 기능적 보상 메커니즘을 구성할 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 뉴런이 체내에서 상당한 수준의 대사적 가소성을 가지고 있음을 나타냅니다. 이는 MFN2의 후속 재도입이 주요 대사 마커의 발현을 되돌리고 PN 퇴행을 예방할 수 있음을 입증합니다. 반대로, 이는 동맥경화를 억제하고 신경 전환을 촉진합니다.
본 연구에서 가장 흥미로운 발견 중 하나는 OXPHOS가 결핍된 PN이 동맥경화를 특이적으로 자극하는 효소를 상향 조절함으로써 TCA 사이클 대사를 변형시킬 수 있다는 점입니다. 대사 재배열은 암세포의 일반적인 특징이며, 일부 암세포는 글루타민을 이용하여 TCA 사이클 중간체를 보충하고 환원 등가물을 생성하여 호흡 사슬을 구동하고 지질 및 뉴클레오티드 생합성 전구체의 생성을 유지합니다(39, 40). 최근 연구에 따르면 OXPHOS 기능 장애를 겪는 말초 조직에서 글루타민/글루탐산 대사의 재연결 또한 두드러진 특징이며(5, 41), TCA 사이클로의 글루타민 유입 방향은 OXPHOS 손상의 심각도에 따라 달라집니다(41). 그러나 신체 내 신경 세포의 대사 가소성과 질병 맥락에서의 관련성에 대한 명확한 증거는 부족합니다. 최근의 시험관 내 연구에서, 일차 피질 뉴런은 신경 전달을 위해 글루타메이트 풀을 동원하여 대사 스트레스 조건 하에서 산화 대사와 죽상경화증을 촉진하는 것으로 나타났습니다(42). TCA 회로 효소인 숙신산 탈수소효소의 약리학적 억제 하에서, 피루브산 카르복실화는 배양된 소뇌 과립 뉴런에서 옥살로아세트산 합성을 유지하는 것으로 여겨진다는 점에 주목할 필요가 있습니다(34). 그러나 이러한 메커니즘이 뇌 조직(죽상경화증은 주로 성상세포에 국한되는 것으로 여겨짐)에 미치는 생리학적 관련성은 여전히 ​​중요한 의미를 지닙니다(43). 이 경우, 우리의 데이터는 체내에서 산화적 인산화에 의해 손상된 PN이 TCA 풀 중간체의 두 가지 주요 공급원인 BCAA 분해 및 피루브산 카르복실화로 전환될 수 있음을 보여줍니다. BCAA 이화작용이 신경 세포 에너지 대사에 기여한다는 가설이 제시되었지만, 신경 전달에 대한 글루타메이트와 GABA의 역할 외에도(44), 생체 내에서 이러한 메커니즘에 대한 증거는 아직 없습니다. 따라서 기능 장애가 있는 PN은 동맥경화증 증가를 통해 동화 과정에 의해 유발되는 TCA 중간체의 소비를 자동으로 보상할 수 있다고 추측하기 쉽습니다. 특히, 미토콘드리아 기능 장애가 있는 증식 세포에서 제안된 바와 같이(45), 아스파르트산에 대한 증가된 수요를 유지하기 위해서는 PCx의 상향 조절이 필요할 수 있습니다. 그러나 우리의 대사체 분석에서는 Mfn2cKO PN에서 아스파르트산의 정상 상태 수준에 유의미한 변화가 나타나지 않았습니다(그림 S6A). 이는 아마도 증식 세포와 분열 후 신경 세포 간의 아스파르트산 대사 이용 방식의 차이를 반영하는 것으로 보입니다. 생체 내 기능 장애 뉴런에서 PCx 상향 조절의 정확한 메커니즘은 아직 규명되지 않았지만, 우리는 이 조기 반응이 뉴런의 산화환원 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 소뇌 절편에 대한 FLIM 실험을 통해 입증했습니다. 특히, PN의 PCx 상향 조절을 억제하면 더욱 산화된 상태가 되어 세포 사멸이 가속화될 수 있습니다. BCAA 분해 활성화와 피루브산 카르복실화는 미토콘드리아 기능 장애의 말초 조직을 특징짓는 방법이 아닙니다(7). 따라서, 이것들은 신경퇴행에 중요한 유일한 특징은 아니더라도 OXPHOS 결핍 뉴런의 우선적인 특징으로 보입니다.
소뇌 질환은 이질적인 유형의 신경퇴행성 질환으로, 일반적으로 운동실조를 유발하며 종종 PN(말초신경세포)을 손상시킵니다(46). 이 신경세포 집단은 미토콘드리아 기능 장애에 특히 취약한데, 생쥐에서 이 신경세포의 선택적 퇴화만으로도 인간의 척수소뇌 운동실조를 특징짓는 많은 운동 증상을 재현할 수 있기 때문입니다(16, 47, 48). 보고에 따르면, 돌연변이 유전자를 가진 형질전환 생쥐 모델은 인간의 척수소뇌 운동실조와 관련이 있으며 미토콘드리아 기능 장애를 나타냅니다(49, 50). 이는 PNPH에서 산화적 인산화(OXPH) 결핍의 결과를 연구하는 것이 중요함을 강조합니다. 따라서 이 특수한 신경세포 집단을 효과적으로 분리하고 연구하는 것이 특히 적합합니다. 그러나 PN은 압력에 매우 민감하고 전체 소뇌 세포 집단에서 차지하는 비율이 낮기 때문에, 많은 오믹스 기반 연구에서 PN을 세포 전체로 선택적으로 분리하는 것은 여전히 ​​어려운 과제입니다. 다른 세포 유형(특히 성체 조직)의 오염을 완전히 배제하는 것은 거의 불가능하지만, 본 연구에서는 효과적인 분리 단계와 FACS를 결합하여 후속 단백질체 분석에 필요한 충분한 수의 생존 뉴런을 얻었고, 기존의 전체 소뇌 데이터 세트(51)와 비교했을 때 상당히 높은 단백질 커버리지(약 3000개 단백질)를 확보했습니다. 본 연구에서 제시하는 방법은 전체 세포의 생존력을 유지함으로써 미토콘드리아의 대사 경로 변화뿐만 아니라 세포질 내 미토콘드리아의 변화까지 확인할 수 있게 해 줍니다. 이는 복잡한 조직에서 미토콘드리아 수를 측정하기 위해 미토콘드리아 막 태그를 사용하는 기존 방법(52, 53)을 보완하는 것입니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 푸르킨예 세포 연구뿐만 아니라 다른 미토콘드리아 기능 장애 모델을 포함하여 질병이 있는 뇌의 대사 변화를 연구하기 위해 모든 유형의 세포에 쉽게 적용할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 이러한 대사 재배열 과정 중 세포 스트레스의 주요 징후를 완전히 되돌리고 신경 퇴행을 예방할 수 있는 치료적 시기를 확인했습니다. 따라서, 여기서 설명된 재배열의 기능적 의미를 이해하는 것은 미토콘드리아 기능 장애 시 신경 세포 생존력을 유지하기 위한 가능한 치료법에 대한 근본적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. 다른 뇌 세포 유형에서 에너지 대사의 변화를 분석하는 것을 목표로 하는 향후 연구를 통해 이 원리가 다른 신경 질환에도 적용될 수 있는지 완전히 밝혀낼 필요가 있습니다.
MitoPark 마우스는 이전에 기술되었습니다(31). loxP 서열로 둘러싸인 Mfn2 유전자를 가진 C57BL/6N 마우스는 이전에 기술되었으며(18), L7-Cre 마우스와 교배되었습니다(23). 그 결과 생성된 이중 이형접합체 자손을 동형접합체 Mfn2loxP/Mfn2loxP 마우스와 교배하여 Purkinje 세포 특이적 Mfn2 유전자 결손(Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)을 생성했습니다. 일부 교배에서는 추가 교배를 통해 Gt(ROSA26) SorStop-mito-YFP 대립유전자(stop-mtYFP)를 도입했습니다(20). 모든 동물 실험 절차는 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었으며 독일 노르트라인베스트팔렌 주 환경 및 소비자 보호국(LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz)의 승인을 받았습니다. 동물 실험은 또한 유럽 실험동물과학협회(European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations)의 지침을 따릅니다.
임신한 암컷 쥐를 마취시킨 후 경추 탈골을 시행하여 배아를 분리하였다(E13). 대뇌 피질을 10 mM Hepes가 첨가된 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)에서 해부하고 파파인(20 U/ml)과 시스테인(1 μg/ml)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 계대 배양하였다. 조직을 DMEM에서 배양하고 37°C에서 20분간 효소 소화법으로 분리한 후, 10% 태아 소 혈청이 첨가된 DMEM에서 기계적으로 분쇄하였다. 세포를 폴리리신으로 코팅된 유리 커버슬립에 6cm 배양 접시당 2×10⁶개 또는 영상 분석을 위해 0.5×10⁵개/cm²의 밀도로 접종하였다. 4시간 후, 배지를 1% B27 보충제와 0.5 mM GlutaMax가 함유된 Neurobasal 무혈청 배지로 교체하였다. 실험 기간 동안 뉴런은 37°C 및 5% CO2 조건에서 유지되었으며, 일주일에 한 번 먹이를 공급했습니다. 시험관 내 재조합을 유도하기 위해, 시험관 내 배양 2일째에 다음 AAV9 바이러스 벡터를 뉴런에 처리했습니다. 3μl(24웰 배양 접시) 또는 0.5μl(24웰 플레이트). 사용된 벡터는 AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH(Addgene, 카탈로그 번호 105530-AAV9)와 AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40(Addgene, 카탈로그 번호 105545-AAV9)입니다.
마우스 Mfn1 및 Mfn2 상보적 DNA(각각 Addgene 플라스미드 #23212 및 #23213에서 얻음)는 C-말단에 V5 서열(GKPIPNPLLGLDST)로 표시되어 있으며, T2A 서열을 통해 mCherry와 프레임 내에서 융합되어 있습니다. Grx1-roGFP2는 Heidelberg TP Dick DFKZ(독일 암 연구 센터)에서 제공받았습니다. 일반적인 클로닝 방법을 사용하여 tdTomato 카세트를 pAAV-CAG-FLEX-tdTomato 백본(Addgene 참조 번호 28306)에 서브클로닝하여 pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 및 pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 벡터를 제작했습니다. 유사한 전략을 사용하여 대조 벡터 pAAV-CAG-FLEX-mCherry를 생성했습니다. AAV-shPCx 구조체를 생성하기 위해서는 마우스 PCx를 표적으로 하는 shRNA(5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 AAV 벡터(VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1])가 필요합니다. U6 프로모터의 조절 하에 mCherry가 사용되며, mCherry는 CMV 프로모터의 조절 하에 사용됩니다. 보조 AAV 벡터의 생산은 제조사(Cell Biolabs)의 지침에 따라 수행되었습니다. 요약하면, mCherry-T2A-MFN2-V5(pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5(pAAV-CAG-FLEX-mCherry) 또는 Grx-roGFP2(pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) 유전자를 포함하는 전달 플라스미드를 293AAV 세포에 일시적으로 형질전환시키고, AAV1 캡시드 단백질 및 보조 단백질을 코딩하는 패키징 플라스미드를 인산칼슘법을 이용하여 제작하였다. 조제 바이러스 상층액은 드라이아이스/에탄올 욕조에서 동결-해동 과정을 거쳐 얻었고, 세포는 인산염 완충 용액(PBS)으로 용해시켰다. AAV 벡터는 불연속 요오딕사놀 기울기 초원심분리(32,000 rpm, 4°C에서 24시간)를 통해 정제되었고 Amicon ultra-15 원심분리 필터를 사용하여 농축되었습니다. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×10¹³ 게놈 카피(GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1.9×10¹³ GC/ml) 및 AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×10¹² GC/ml)의 게놈 역가는 이전에 설명된 바와 같이 실시간 정량 PCR(qPCR)로 측정되었습니다(54).
일차 신경세포를 얼음처럼 차가운 1x PBS에서 긁어내어 원심분리하여 침전시킨 후, 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS 용해 완충액(인산가수분해효소 및 단백분해효소 억제제 함유, Roche)에서 균질화했습니다. 단백질 정량은 비신코닌산 분석법(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행했습니다. 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(GE Healthcare)에 블로팅했습니다. 비특이적 결합 부위를 차단하고 TBST(트리스 완충 식염수 및 트윈 함유)에 5% 탈지분유를 첨가하여 1차 항체(자세한 내용은 표 S1 참조)와 반응시킨 후 세척하고, TBST에 2차 항체를 첨가하여 반응시켰습니다. 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰습니다. 세척 후, 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰습니다. 이후, 동일한 블롯을 항-β-액틴 항체와 함께 배양하여 동일한 로딩량을 확인하였다. 검출은 화학발광 변환 및 화학발광 증강법(GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다.
유리 커버슬립에 배양된 뉴런은 지정된 시점에서 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)/PBS 용액으로 고정했습니다. 커버슬립은 먼저 실온에서 5분 동안 0.1% Triton X-100/PBS 용액으로 투과시킨 후, 차단 완충액[3% 소혈청 알부민(BSA)/PBS]에 담갔습니다. 다음 날, 커버슬립을 차단 완충액으로 세척하고 적절한 형광 표지된 이차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 마지막으로, 샘플을 PBS로 충분히 세척하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조 염색한 후, Aqua-Poly/Mount를 사용하여 현미경 슬라이드에 고정했습니다.
수컷과 암컷 쥐에게 케타민(130mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취시키고, 카르프로펜 진통제(5mg/kg)를 피하 주사한 후, 온열 패드가 장착된 정위 고정 장치(Kopf)에 고정시켰다. 두개골을 노출시키고 치과용 드릴을 사용하여 뇌실질의 해당 부위(람다: 꼬리 1.8, 측면 1, 소엽 IV 및 V에 해당)를 얇게 만들었다. 구부러진 주사 바늘을 사용하여 아래쪽 혈관을 손상시키지 않도록 조심스럽게 두개골에 작은 구멍을 냈다. 그런 다음 가늘게 뽑은 유리 모세관을 미세 구멍(경막 복측의 -1.3에서 -1 사이)에 천천히 삽입하고, 수동 주사기(Narishige)를 사용하여 200~300 nl의 AAV를 미세 주입기(Narishige)에 저압으로 10~20분 동안 여러 번 주입합니다. 주입 후, 바이러스가 완전히 퍼지도록 모세관을 10분 더 그대로 둡니다. 모세관을 제거한 후, 상처 염증을 최소화하고 동물의 회복을 돕기 위해 피부를 조심스럽게 봉합합니다. 동물들에게 수술 후 며칠 동안 진통제(카스포펜)를 투여하고, 이 기간 동안 동물의 신체 상태를 면밀히 모니터링한 후, 정해진 시점에 안락사시켰습니다. 모든 절차는 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었으며, 독일 노르트라인베스트팔렌 주 환경 및 소비자 보호국(LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz)의 승인을 받았습니다.
동물에게 케타민(100 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 투여하여 마취시킨 후, 심장에 먼저 0.1 M PBS를 주입하고 이어서 PBS에 4% PFA를 주입했습니다. 조직을 적출하여 4°C에서 4% PFA/PBS 용액에 하룻밤 동안 고정했습니다. 진동 칼(Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria)을 사용하여 PBS에 고정된 뇌에서 시상 절편(두께 50 μm)을 제작했습니다. 특별히 명시되지 않은 경우, 부유 절편의 염색은 위에서 설명한 방법(13)에 따라 실온에서 교반하면서 수행했습니다. 간단히 말하면, 먼저 얻은 절편을 실온에서 15분 동안 0.5% Triton X-100/PBS 용액으로 투과성을 부여했습니다. 일부 에피토프(Pcx 및 Shmt2)의 경우, 이 단계 대신 80°C(pH 9)의 트리스-EDTA 완충액에서 25분 동안 가열했습니다. 다음으로, 절편을 차단 완충액(3% BSA/PBS)에 1차 항체(표 S1 참조)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 교반하면서 배양했습니다. 다음 날, 절편을 차단 완충액으로 세척하고 적절한 형광 표지 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 마지막으로, 절편을 PBS로 충분히 세척하고 DAPI로 대조 염색한 후, AquaPolymount로 현미경 슬라이드에 고정했습니다.
백색광 레이저와 405nm 다이오드 자외선 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경(TCS SP8-X 또는 TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems)을 사용하여 시료 이미지를 촬영했습니다. 형광체를 여기시키고 하이브리드 검출기(HyDs)로 신호를 수집하여 LAS-X 소프트웨어를 사용하여 순차 모드에서 나이퀴스트 샘플링에 따라 스택 이미지를 얻었습니다. 정량 분석이 불가능한 패널의 경우, 신호가 매우 동적입니다(예: 체세포 및 수상돌기, mtYFP). HyD를 사용하여 BrightR 모드에서 PN 수를 검출했습니다. 배경 노이즈를 줄이기 위해 0.3~6ns의 게이팅을 적용했습니다.
분리된 세포의 실시간 이미징. 1% B27 보충제와 0.5 mM GlutaMax가 함유된 Neurobasal-A 배지에서 세포를 분리한 후, 즉시 폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드(μ-Slide8 Well, Ibidi, 카탈로그 번호 80826)에 접종하고 37°C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하여 세포가 안정화되도록 했다. 실시간 이미징은 백색 레이저, HyD, 63×[1.4 개구수(NA)] 오일 대물렌즈 및 가열 스테이지가 장착된 Leica SP8 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다.
생쥐를 이산화탄소로 빠르게 마취시킨 후 참수하고, 두개골에서 뇌를 신속하게 적출하여 200μm 두께(13C 표지 실험용) 또는 275μm 두께(이광자 실험용)의 시상면 절편으로 자른 후 다음 물질로 채웠습니다. 아이스크림(HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)에는 다음 물질이 채워져 있습니다: 125mM의 얼음처럼 차가운, 탄소 포화(95% O2 및 5% CO2) 저칼슘 인공뇌척수액(ACSF) NaCl, 2.5mM KCl, 1.25mM 인산나트륨 완충액, 25mM NaHCO3, 25mM 포도당, 0.5mM CaCl2 및 3.5mM MgCl2 (삼투압 310~330mmol). 얻어진 뇌 절편을 고농도 Ca2+ ACSF(125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM 인산나트륨 완충액, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-포도당, 1.0 mM CaCl2 및 2.0 mM MgCl2) 배지(pH 7.4, 310~320 mmol)가 들어 있는 전배양 챔버로 옮긴다.
이미징 과정 동안, 절편들을 전용 이미징실로 옮겨 32~33°C의 일정한 온도를 유지하면서 ACSF를 지속적으로 주입하며 실험을 진행했습니다. 절편 이미징에는 Leica 25배율 대물렌즈(NA 0.95, 수용액)와 Ti:Sapphire 레이저(Chameleon Vision II, Coherent)가 장착된 다광자 레이저 스캐닝 현미경(TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems)과 FLIM 모듈(PicoHarp300, PicoQuant)을 사용했습니다.
Grx1-roGFP2의 FLIM 분석. 시상면 뇌 절편에서 2광자 FLIM을 이용하여 PN의 세포질 산화환원 상태 변화를 측정하였다. 여기서 Grx1-roGFP2 바이오센서는 PN을 표적으로 한다. PN층에서, 획득 영역은 절편 표면에서 약 50~80μm 아래로 설정하여, 생존 가능한 PN(즉, 수상돌기를 따라 구슬 모양 구조나 신경 세포 형태 변화가 없는 PN)과 이중 양성 roGFP2 센서 및 shRNA PCx 또는 대조 서열을 인코딩하는 AAV(각각 mCherry를 공동 발현)가 존재하는지 확인하였다. 2배 디지털 줌으로 단일 스택 이미지를 획득하였다[여기 파장: 890nm; 512nm, 512픽셀]. 검출: 내부 HyD, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 필터 그룹]을 사용하고 2~3분 이내에 이미지를 평균화하여 곡선 맞춤에 필요한 충분한 광자(총 1000개)를 수집했습니다. Grx1-roGFP2 프로브의 감도 및 FLIM 조건 검증은 관류 ACSF에 외인성 10 mM H2O2를 첨가하여 산화를 최대화하고 수명을 증가시킨 후, 2 mM 디티오트레이톨을 첨가하여 환원 정도를 최소화하고 수명을 감소시켰을 때 roGFP2의 수명 값을 모니터링하여 수행했습니다(그림 S8, D~G). FLIMfit 5.1.1 소프트웨어를 사용하여 획득한 결과를 분석하고, 전체 이미지의 단일 지수 감쇠 곡선을 측정된 IRF(기기 응답 함수)에 맞추었으며, χ2 값은 약 1이었습니다. 단일 PN의 수명을 계산하기 위해 신경체 주변에 마스크를 수동으로 그리고 각 마스크의 평균 수명을 정량화에 사용했습니다.
미토콘드리아 전위 분석. 급성 절편을 관류된 ACSF에 직접 첨가한 100 nM TMRM과 함께 30분 동안 배양한 후, 2광자 현미경을 이용하여 PN의 미토콘드리아 전위 변화를 측정하였다. TMRM 이미징은 프로브를 920 nm에서 여기시키고 내부 HyD(테트라메틸로다민 이소티오시아네이트: 585/40 nm)를 사용하여 신호를 수집함으로써 수행하였다. mtYFP 이미징에는 동일한 여기 파장을 사용하되 다른 내부 HyD(FITC: 525/50 nm)를 사용하였다. ImageJ의 Image Calculator 플러그인을 사용하여 단일 세포 수준에서 미토콘드리아 전위를 평가하였다. 간단히 말하면, 플러그인 공식 `signal = min(mtYFP, TMRM)`을 사용하여 해당 채널의 단일 스택 공초점 이미지에서 푸르킨예 소말리 세포의 TMRM 신호가 나타나는 미토콘드리아 영역을 식별하였다. 그런 다음 생성된 마스크의 픽셀 영역을 정량화하고, 해당 임계값의 mtYFP 채널 단일 스택 이미지에 대해 정규화하여 미토콘드리아 잠재력을 나타내는 미토콘드리아 비율을 얻습니다.
이미지는 Huygens Pro(Scientific Volume Imaging) 소프트웨어를 사용하여 디컨볼루션 처리되었습니다. 스캔한 타일 이미지의 경우, LAS-X 소프트웨어에서 제공하는 자동 스티칭 알고리즘을 사용하여 단일 타일의 이미지를 합성합니다. 이미지 보정 후, ImageJ와 Adobe Photoshop을 사용하여 이미지를 추가로 처리하고 밝기와 대비를 균일하게 조정합니다. 그래픽 작업에는 Adobe Illustrator를 사용합니다.
미토콘드리아 DNA(mtDNA) 초점 분석. DNA에 대한 항체로 표지된 소뇌 절편에서 공초점 현미경을 이용하여 mtDNA 병변 수를 정량화했습니다. 각 세포의 세포체와 핵에 대해 표적 영역을 생성하고, ImageJ 소프트웨어의 Multi Measure 플러그인을 사용하여 각 영역의 면적을 계산했습니다. 세포체 면적에서 핵 면적을 빼서 세포질 면적을 구했습니다. 마지막으로, ImageJ 소프트웨어의 Analyze Particles 플러그인을 사용하여 임계값 이미지에서 mtDNA를 나타내는 세포질 DNA 지점을 자동으로 정량화하고, 얻은 결과를 대조군 마우스의 PN 평균값으로 정규화했습니다. 결과는 세포당 평균 뉴클레오사이드 수로 나타냈습니다.
단백질 발현 분석. ImageJ의 Image Calculator 플러그인을 사용하여 PN에서 단일 세포 수준의 단백질 발현을 평가합니다. 간단히 말하면, 해당 채널의 단일 레이어 공초점 이미지에서 다음 공식을 통해 특정 항체에 대한 면역 반응을 나타내는 미토콘드리아 영역을 식별합니다. 신호 = min(mtYFP, 항체). 그런 다음 생성된 마스크의 픽셀 영역을 정량화하고, 해당 임계값을 갖는 mtYFP 채널의 단일 스택 이미지로 정규화하여 표시된 단백질의 미토콘드리아 비율을 얻습니다.
푸르킨예 세포 밀도 분석. ImageJ의 Cell Counter 플러그인을 사용하여 계수한 푸르킨예 세포 수를 계수한 세포들이 차지하는 소뇌 고리의 길이로 나누어 푸르킨예 세포 밀도를 평가했습니다.
시료 준비 및 채취. 대조군과 Mfn2cKO 마우스의 뇌를 0.1M 인산 완충액(PB)에 2% PFA/2.5% 글루타르알데히드를 첨가하여 고정시킨 후, 섬모충류 현미경(Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria)을 이용하여 관상 절편을 제작하였다(두께 50~60μm). 이후 실온에서 1% 사산화이소산나트륨과 1.5% 페로시안화칼륨을 첨가한 PB 완충액에 1시간 동안 고정하였다. 절편을 증류수로 세 번 세척한 후, 1% 아세트산우라닐을 함유한 70% 에탄올에 20분간 염색하였다. 이어서 단계별 알코올로 탈수시킨 후, 실리콘 코팅된 유리 슬라이드 사이에 Durcupan ACM(Araldite casting resin M) 에폭시 수지(Electron Microscopy Sciences, 카탈로그 번호 14040)를 사용하여 포매하고, 마지막으로 오븐에서 60°C로 48시간 동안 중합시켰다. 소뇌 피질 영역을 선택하고 Leica Ultracut(Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria)을 사용하여 50 nm 초박절편을 제작한 후, 폴리스티렌 필름으로 코팅된 2×1 mm 구리 슬릿 그리드에 올렸습니다. 절편은 4% 아세트산우라닐 용액에 10분간 담근 후 여러 번 세척하고, 이어서 레이놀즈 납 시트르산염 용액에 10분간 담근 후 다시 여러 번 세척했습니다. 현미경 사진은 TVIPS(Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 디지털 카메라(TVIPS GmbH, Gauting, USA)가 장착된 Philips CM100 투과 전자 현미경(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 촬영했습니다.
AAV에 감염된 마우스의 뇌를 분리하여 1mm 두께의 시상면 절편으로 만들고, 형광 현미경을 사용하여 소뇌를 관찰하여 AAV 감염 부위(즉, mCherry 발현 부위)를 확인했습니다. AAV 주입 결과 푸르킨예 세포층의 형질전환 효율이 매우 높은(즉, 거의 전체 층에 걸쳐) 최소 두 개의 연속적인 소뇌 고리에서 나타난 실험 결과만 사용했습니다. AAV가 형질전환된 고리를 미세 절개하여 0.1M 코코에이트 완충액에 4% PFA와 2.5% 글루타르알데히드를 첨가한 용액에서 하룻밤 동안 후고정하고 추가 처리를 진행했습니다. EPON 포매를 위해 고정된 조직을 0.1M 코코에이트 완충액(Applichem)으로 세척하고, 0.1M 코코에이트 완충액(Applichem)에 2% OsO4(os, Science Services; Caco)를 첨가한 용액에서 4시간 동안 배양한 후 2시간 동안 세척했습니다. 0.1 M 코카마이드 완충액으로 3회 반복 처리했습니다. 이후, 에탄올 농도를 점차 높여가며 각 에탄올 용액에 4°C에서 15분 동안 담가 조직을 탈수했습니다. 조직을 프로필렌 옥사이드에 옮긴 후, EPON(Sigma-Aldrich)에 담가 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 조직을 새로운 EPON에 실온에서 2시간 동안 담근 후, 62°C에서 72시간 동안 포매했습니다. 초미세절편기(Leica Microsystems, UC6)와 다이아몬드 칼날(Diatome, Biel, Switzerland)을 사용하여 70 nm 두께의 초박절편을 제작하고, 1.5% 아세트산우라닐 용액으로 37°C에서 15분간 염색한 후, 구연산납 용액으로 4분간 염색했습니다. 전자현미경 사진은 Camera OneView 4K 16-bit(Gatan) 및 DigitalMicrograph 소프트웨어(Gatan)가 장착된 JEM-2100 Plus 투과 전자현미경(JEOL)을 사용하여 촬영했습니다. 분석을 위해 5000배 또는 10000배 디지털 줌으로 전자 현미경 사진을 촬영했습니다.
미토콘드리아의 형태학적 분석. 모든 분석에서, 개별 미토콘드리아의 윤곽은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지에서 수동으로 그려졌습니다. 다양한 형태학적 매개변수를 분석했습니다. 미토콘드리아 밀도는 각 세포의 전체 미토콘드리아 면적을 세포질 면적(세포질 면적 = 세포 면적 - 세포핵 면적)으로 나눈 값에 100을 곱하여 백분율로 나타냈습니다. 미토콘드리아의 원형도는 [4π∙(면적/둘레²)] 공식으로 계산했습니다. 미토콘드리아의 형태는 주요 모양에 따라 "관형"과 "물집형"의 두 가지 범주로 분류했습니다.
자가포식소/리소좀의 수 및 밀도 분석. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지에서 각 자가포식소/리소좀의 윤곽을 수동으로 그립니다. 자가포식소/리소좀의 면적은 각 세포의 전체 자가포식소/리소좀 구조 면적을 세포질 면적(세포질 면적 = 세포 면적 - 핵 면적)으로 나눈 후 100을 곱하여 백분율로 나타냅니다. 자가포식소/리소좀 밀도는 전체 자가포식소/리소좀 수를 세포질 면적당 자가포식소/리소좀 구조 수로 나누어 계산합니다(세포질 면적 = 세포 면적 - 핵 면적).
급성 뇌 절편 및 시료 준비를 위한 표지. 포도당 표지가 필요한 실험의 경우, 급성 뇌 절편을 포화 탄소(산소 95%, 이산화탄소 5%), 고농도 Ca2+ ACSF(125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM 인산나트륨 완충액, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-포도당, 1.0 mM CaCl2 및 2.0 mM MgCl2, pH 7.4, 삼투압 310~320 mOsm으로 조정)가 들어 있는 전배양 챔버로 옮깁니다. 여기서 포도당은 13C6-포도당 치환체(Eurisotop, 카탈로그 번호 CLM-1396)입니다. 피루브산 표지가 필요한 실험의 경우, 급성 뇌 절편을 고농도 Ca2+ ACSF(125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM 인산나트륨 완충액, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-포도당, 1.0 mM CaCl2 및 2.0 mM MgCl2 첨가, pH 7.4 및 310~320 mOsm으로 조정)로 옮기고 1 mM 1-[1-13C]피루브산(Eurisotop, 카탈로그 번호 CLM-1082)을 첨가합니다. 절편을 37°C에서 90분 동안 배양합니다. 실험 종료 후, 절편을 75 mM 탄산암모늄을 함유한 수용액(pH 7.4)으로 빠르게 세척한 다음, 아세토니트릴(ACN):메탄올:물 40:40:20(v:v:v) 혼합 용액에서 균질화합니다. 절편을 얼음 위에서 30분간 배양한 후, 4°C에서 21,000g로 10분간 원심분리하고, 투명한 상층액을 SpeedVac 농축기를 이용하여 건조시켰다. 이렇게 얻은 건조된 대사산물 펠렛은 분석 전까지 -80°C에서 보관하였다.
13C 표지 아미노산의 액체 크로마토그래피-질량 분석. 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)을 위해 대사체 펠렛을 LC-MS 등급 증류수(Honeywell) 75μl에 재현탁시켰다. 4°C에서 5분 동안 21,000g로 원심분리한 후, 상등액 20μl를 아미노산 플럭스 분석에 사용하고 나머지 추출물은 즉시 음이온 분석에 사용하였다(아래 참조). 아미노산 분석은 이전에 설명된 벤조일 클로라이드 유도체화 프로토콜(55, 56)을 사용하여 수행하였다. 첫 번째 단계에서 대사체 추출물 20μl에 100mM 탄산나트륨(Sigma-Aldrich) 10μl를 첨가한 다음, LC 등급 아세토니트릴(ACN)에 2% 벤조일 클로라이드(Sigma-Aldrich) 10μl를 첨가하였다. 시료를 잠시 와류시킨 후 20°C에서 5분 동안 21,000g로 원심분리했습니다. 상등액을 원뿔형 유리 인서트가 있는 2ml 자동 시료 주입기 바이알(200μl 용량)로 옮겼습니다. 시료는 Q-Exactive(QE)-HF(Ultra High Field Orbitrap) 고해상도 정밀 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 연결된 Acquity iClass 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템(Waters)을 사용하여 분석했습니다. 분석을 위해 유도체화된 시료 2μl를 1.8μm 입자를 포함하는 100×1.0mm 고강도 실리카 T3 컬럼(Waters)에 주입했습니다. 유속은 100μl/min이고, 완충액 시스템은 완충액 A(물에 10mM 포름산암모늄 및 0.15% 포름산)와 완충액 B(아세토니트릴)로 구성됩니다. 그라디언트는 다음과 같습니다: 0분에서 0%B; 0%B. 0~0.1분 동안 0~15% B; 0.1~0.5분 동안 15~17% B; 0.5~14분 동안 17~55% B; 14~14.5분 동안 55~70% B; 18분 동안 14.5~70~100% B; 18~19분 동안 100% B; 19~19.1분 동안 100~0% B; 19.1~28분 동안 0% B (55, 56). QE-HF 질량 분석기는 양이온화 모드에서 m/z(질량/전하비) 범위 50~750으로 작동합니다. 적용된 분해능은 60,000이고, 이득 제어(AGC)를 통해 얻은 이온 목표치는 3×10⁶이며, 최대 이온화 시간은 100밀리초입니다. 가열식 전기분무 이온화(ESI) 소스는 분무 전압 3.5kV, 모세관 온도 250°C, 쉬스 공기 유량 60AU(임의 단위), 보조 공기 유량 20AU로 작동합니다. S 렌즈는 60AU로 설정되었습니다.
13C로 표지된 유기산의 음이온 크로마토그래피-질량 분석. 남은 대사산물 침전물(55μl)은 QE-HF 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 연결된 Dionex 이온 크로마토그래피 시스템(ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분석했습니다. 간단히 설명하면, 대사산물 추출물 5μl를 HPLC가 장착된 Dionex IonPac AS11-HC 컬럼(2mm × 250mm, 입자 크기 4μm, Thermo Fisher Scientific)에 푸시인 부분 루프 모드(충전 비율 1)로 주입했습니다. Dionex IonPac AG11-HC 가드 컬럼(2mm × 50mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific)을 사용했습니다. 컬럼 온도는 30°C로 유지하고, 자동 시료 주입기는 6°C로 설정했습니다. 탈이온수가 제공되는 수산화칼륨 카트리지를 사용하여 용리액 발생기를 통해 수산화칼륨 농도 구배를 생성했습니다. 380μl/min의 유속으로 대사물질을 분리하기 위해 다음과 같은 농도 구배를 적용하였다: 0~3분, 10mM KOH; 3~12분, 10~50mM KOH; 12~19분, 50~100mM KOH; 19~21분, 100mM KOH; 21~21.5분, 100~10mM KOH. 컬럼은 10mM KOH 용액에서 8.5분 동안 재평형화하였다.
용출된 대사산물은 컬럼 후단에서 150μl/min의 이소프로판올 보충 스트림과 합쳐진 후 음이온화 모드로 작동하는 고해상도 질량 분석기로 보내집니다. 질량 분석기는 m/z 50~750 범위에서 60,000의 분해능으로 모니터링합니다. AGC는 1×10⁶으로 설정되었고, 최대 이온화 시간은 100ms로 유지되었습니다. 가열식 ESI 소스는 3.5kV의 분무 전압에서 작동되었습니다. 이온 소스의 다른 설정은 다음과 같습니다: 모세관 온도 275°C, 쉬스 가스 유량 60AU, 보조 가스 유량 20AU(300°C), S 렌즈 설정 60AU.
13C 표지 대사산물의 데이터 분석. 동위원소 비율 데이터 분석에는 TraceFinder 소프트웨어(버전 4.2, Thermo Fisher Scientific)를 사용했습니다. 각 화합물의 정체는 신뢰할 수 있는 참조 화합물을 통해 검증하고 독립적으로 분석했습니다. 동위원소 농축 분석을 수행하기 위해 각 13C 동위원소(Mn)의 추출 이온 크로마토그램(XIC) 면적을 [M + H]+에서 추출했습니다. 여기서 n은 대상 화합물의 탄소 수이며, 아미노산 분석에는 [MH]+를 사용하고, 음이온 분석에는 [MH]+를 사용했습니다. XIC의 질량 정확도는 백만분율 5 미만이며, RT의 정확도는 0.05분입니다. 농축 분석은 검출된 각 동위원소와 해당 화합물의 모든 동위원소 합계의 비율을 계산하여 수행합니다. 이러한 비율은 각 동위원소에 대해 백분율 값으로 표시되며, 결과는 이전에 설명한 바와 같이 몰 백분율 농축(MPE)으로 나타냅니다(42).
냉동된 뉴런 펠렛을 얼음처럼 차가운 80% 메탄올(v/v)에 넣고 균질화한 후, 볼텍싱하고 -20°C에서 30분 동안 배양했습니다. 샘플을 다시 볼텍싱하고 +4°C에서 30분 동안 교반했습니다. 샘플을 4°C에서 21,000g로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 수집하여 후속 분석을 위해 SpeedVac 농축기를 사용하여 25°C에서 건조했습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 분리된 세포의 아미노산에 대해 LC-MS 분석을 수행했습니다. TraceFinder(버전 4.2, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 각 화합물의 단일 동위원소 질량을 이용하여 데이터 분석을 수행했습니다. 대사체 데이터의 분위수 정규화는 preprocessCore 소프트웨어 패키지(57)를 사용하여 수행했습니다.
절편 준비. 마우스를 이산화탄소로 빠르게 마취시킨 후 머리를 절단하고, 두개골에서 뇌를 신속하게 적출한 다음, 얼음으로 채워진 진동 칼(HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany)을 사용하여 300~375 μm 두께의 시상 절편으로 잘랐습니다. 저온 탄소 가스화(95% O2 및 5% CO2) 후, 저칼슘 ACSF 용액(125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM 인산나트륨 완충액, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-포도당, 1.0 mM CaCl2 및 6.0 mM MgCl2, pH 7.4 및 310~330 mOsm으로 조정)을 사용하여 절편을 제작했습니다. 얻어진 뇌 절편을 고농도 Ca2+ ACSF(125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM 인산나트륨 완충액, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-포도당, 4.0 mM CaCl2 및 3.5 mM MgCl2, pH 7.4, 삼투압 310~320 mOsm)가 들어 있는 챔버로 옮긴다. 기록 전에 절편이 복원될 수 있도록 20~30분 동안 보관한다.
기록은 고정식 기록 챔버와 20배 수침형 대물렌즈(Scientifica)가 장착된 현미경 스테이지를 사용하여 수행되었습니다. 추정되는 푸르킨예 세포는 (i) 세포 크기, (ii) 소뇌의 해부학적 위치, (iii) 형광 mtYFP 리포터 유전자의 발현을 기준으로 식별되었습니다. 팁 저항이 5~11메가옴인 패치 피펫은 붕규산 유리 모세관(GB150-10, 0.86mm×1.5mm×100mm, Science Products, Hofheim, Germany)과 수평 피펫 기구(P-1000, Sutter, Novato, CA)를 사용하여 제작되었습니다. 모든 기록은 ELC-03XS npi 패치 클램프 증폭기(npi electronic GmbH, Tam, Germany)를 사용하여 수행되었으며, 이 증폭기는 Signal 소프트웨어(버전 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK)로 제어되었습니다. 실험은 12.5kHz의 샘플링 속도로 기록되었습니다. 신호는 차단 주파수가 각각 1.3kHz와 10kHz인 두 개의 단파장 베셀 필터를 사용하여 필터링되었습니다. 막과 피펫의 정전 용량은 증폭기를 이용한 보상 회로를 통해 보상되었습니다. 모든 실험은 Hokawo 소프트웨어(버전 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany)로 제어되는 Orca-Flash 4.0 카메라(Hamamatsu, Gerden, Germany)를 사용하여 수행되었습니다.
일반적인 전세포 구성 및 분석. 기록 직전에 피펫에 다음 물질을 포함하는 내부 용액을 채운다: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM 글루콘산칼륨, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP(Mg), 0.5 mM 구아노신 삼인산(GTP)(Na), 10.0 mM 크레아틴 인산염. 이 용액의 pH는 7.25로 조정하고, 삼투압은 290 mOsm(수크로오스)으로 맞춘다. 0 pA의 전류를 가하여 막을 파괴한 직후 안정막전위를 측정한다. 입력 저항은 -40, -30, -20, -10 pA의 과분극 전류를 가하여 측정한다. 전압 응답의 크기를 측정하고 옴의 법칙을 이용하여 입력 저항을 계산한다. 자발적 활동은 전압 클램프를 이용하여 5분 동안 기록하였고, sPSC는 Igor Pro(버전 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA)의 반자동 인식 스크립트를 사용하여 식별 및 측정하였다. IV 곡선과 정상 상태 전류는 배터리를 다양한 전위(-110mV부터 시작)로 클램핑하고 5mV씩 전압을 증가시키면서 측정하였다. 활동 전위(AP) 발생 여부는 탈분극 전류를 인가하여 검사하였다. 세포를 -70mV로 클램핑하면서 탈분극 전류 펄스를 인가하였다. 각 기록 단위의 스텝 크기를 개별적으로 조정하였다(10~60pA). 가장 높은 AP 빈도를 유발하는 펄스 스파이크를 수동으로 계수하여 최대 AP 빈도를 계산하였다. AP 역치는 하나 이상의 AP를 처음 유발하는 탈분극 펄스의 2차 미분을 이용하여 분석하였다.
천공 패치 구성 및 분석. 표준 프로토콜을 사용하여 천공 패치 기록을 수행합니다. 128 mM 글루콘산칼륨, 10 mM 염화칼륨, 10 mM 헤페스, 0.1 mM EGTA 및 2 mM 염화마그네슘을 포함하지 않는 ATP 및 GTP가 없는 피펫을 사용하고, KOH를 사용하여 pH 7.2로 조정합니다. 세포막의 무분별한 투과를 방지하기 위해 세포내 용액에서 ATP와 GTP를 제거합니다. 패치 피펫에 암포테리신을 함유한 내부 용액(약 200~250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich)을 채워 천공 패치 기록을 얻습니다. 암포테리신은 디메틸설폭사이드(DMSO; D8418, Sigma-Aldrich)에 용해하여 최종 농도를 0.1~0.3%로 만들었습니다. 사용된 DMSO 농도는 연구 대상 뉴런에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 펀칭 과정 동안 채널 저항(Ra)을 지속적으로 모니터링했으며, Ra와 활동전위(AP)의 진폭이 안정화된 후(20~40분) 실험을 시작했습니다. 자발적 활동은 전압 및/또는 전류 클램프를 사용하여 2~5분 동안 측정했습니다. 데이터 분석은 Igor Pro(버전 7.05.2, WaveMetrics, 미국), Excel(버전 2010, Microsoft Corporation, Redmond, 미국) 및 GraphPad Prism(버전 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, 미국)을 사용하여 수행했습니다. 자발적 AP를 식별하기 위해 IgorPro의 NeuroMatic v3.0c 플러그인을 사용했습니다. 각 기록에 대해 개별적으로 조정된 임계값을 사용하여 AP를 자동으로 식별합니다. 스파이크 간격을 사용하여 최대 순간 스파이크 빈도와 평균 스파이크 빈도를 계산합니다.
PN 분리. 이전에 발표된 프로토콜을 적용하여 특정 단계(58)의 마우스 소뇌에서 PN을 정제했습니다. 간단히 말하면, 소뇌를 해부하고 얼음처럼 차가운 해리 배지[HBSS Ca2+ 및 Mg2+ 제외, 20 mM 포도당, 페니실린(50 U/ml) 및 스트렙토마이신(0.05 mg/ml) 첨가]에서 잘게 다진 다음, 파파인[HBSS, 1-시스테인·HCl(1 mg/ml), 파파인(16 U/ml) 및 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I; 0.1 mg/ml) 첨가]에서 배지를 소화시키고 30°C에서 30분 동안 처리했습니다. 먼저 효소적 분해를 방지하기 위해 실온에서 난황 점액(10 mg/ml), BSA(10 mg/ml) 및 DNase(0.1 mg/ml)를 함유한 HBSS 배지에서 조직을 세척한 다음, 20 mM 포도당을 함유한 HBSS 배지에서 부드럽게 분쇄하고 페니실린(50 U/ml), 스트렙토마이신(0.05 mg/ml) 및 DNase(0.1 mg/ml)를 첨가하여 단일 세포를 분리합니다. 얻어진 세포 현탁액을 70μm 셀 스트레이너로 여과한 후, 원심분리(1110 rpm, 5분, 4°C)하여 세포를 침전시키고 분류 배지[HBSS, 20 mM 포도당, 20% 태아 소 혈청, 페니실린(50 U/ml) 및 스트렙토마이신(0.05 mg/ml) 첨가]에 재현탁합니다. 프로피디움 아이오다이드로 세포 생존율을 평가하고 세포 밀도를 1×10⁶ ~ 2×10⁶ 세포/ml로 조절하였다. 유세포 분석 전에 현탁액을 50 μm 셀 스트레이너로 여과하였다.
유세포 분석기. 세포 분류는 FACSAria III 기기(BD Biosciences)와 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, 버전 8.0.1)를 사용하여 4°C에서 수행되었습니다. 세포 현탁액은 100 μm 노즐을 사용하여 20 psi의 압력 하에서 초당 약 2800개의 이벤트를 처리하는 속도로 분류되었습니다. 기존의 게이팅 기준(세포 크기, 이중 모드 판별, 산란 특성)으로는 다른 세포 유형으로부터 신경세포(PN)를 정확하게 분리할 수 없으므로, mitoYFP+ ​​마우스와 대조군인 mitoYFP− 마우스에서 YFP 강도와 자가형광을 직접 비교하여 게이팅 전략을 설정했습니다. YFP는 488 nm 레이저를 조사하여 여기시키고, 신호는 530/30 nm 대역 통과 필터를 사용하여 검출했습니다. mitoYFP+ ​​마우스에서는 Rosa26-mitoYFP 리포터 유전자의 상대적 강도를 이용하여 신경세포체와 축삭 조각을 구분했습니다. 7-AAD는 561nm 황색 레이저로 여기시키고 675/20nm 대역 통과 필터를 사용하여 검출함으로써 사멸 세포를 배제합니다. 동시에 성상세포를 분리하기 위해 세포 현탁액을 ACSA-2-APC로 염색한 후 640nm 레이저를 조사하고 660/20nm 대역 통과 필터를 사용하여 신호를 검출했습니다.
수집된 세포는 원심분리(1110 rpm, 5분, 4°C)하여 침전시킨 후 사용 전까지 -80°C에서 보관하였다. 절차적 변동성을 최소화하기 위해 Mfn2cKO 마우스와 그 동배 새끼들은 같은 날 분류하였다. FACS 데이터의 제시 및 분석은 FlowJo 소프트웨어(FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA)를 사용하여 수행하였다.
위에서 언급한 바와 같이(59), 실시간 PCR은 이후 mtDNA 정량을 위해 분리된 뉴런에서 DNA를 분리하는 데 사용됩니다. 선형성과 역치 민감도는 다양한 수의 세포에서 qPCR을 실행하여 초기 테스트를 수행했습니다. 간단히 말하면, 300개의 PN을 50 mM 트리스-HCl(pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 및 프로테아제 K(200 ng/ml)로 구성된 용해 완충액에 넣고 55°C에서 120분 동안 배양합니다. 프로테아제 K의 완전한 불활성화를 위해 세포를 95°C에서 10분 동안 추가로 배양했습니다. mt-Nd1에 특이적인 TaqMan 프로브(Thermo Fisher)를 사용하여 7900HT 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 반정량 PCR로 mtDNA를 측정했습니다. Science(카탈로그 번호 Mm04225274_s1), mt-Nd6(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AIVI3E8) 및 18S(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 Hs99999901_s1) 유전자.
프로테옴 샘플 준비. 용해 완충액[6M 염화구아니딘, 10mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염, 10mM 클로로아세트아미드 및 100mM 트리스-HCl]에서 용액을 95°C에서 10분간 가열하고 초음파 처리하여 냉동 뉴런 펠렛을 용해시켰습니다. Bioruptor(Diagenode)에서 10분 동안(30초 펄스/30초 정지 주기) 초음파 처리했습니다. 샘플을 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 1:10으로 희석하고, 300ng의 트립신 골드(Promega)를 첨가하여 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 완전 소화를 유도했습니다. 다음 날, 샘플을 20,000g에서 20분간 원심분리했습니다. 상층액을 0.1% 포름산으로 희석하고, 자체 제작한 StageTips를 사용하여 탈염 처리했습니다. 시료는 SpeedVac 기기(Eppendorf concentrator plus 5305)를 사용하여 45°C에서 건조시킨 후, 펩타이드를 0.1% 포름산에 현탁시켰습니다. 모든 시료는 동일인이 동시에 준비했습니다. 성상세포 시료 분석을 위해, 탈염 처리된 펩타이드 4 μg을 펩타이드 대 TMT 시약 비율 1:20으로 탠덤 질량 태그(TMT10plex, 카탈로그 번호 90110, Thermo Fisher Scientific)로 표지했습니다. TMT 표지를 위해, TMT 시약 0.8 mg을 무수 아세토니트릴(ACN) 70 μl에 재현탁시키고, 건조된 펩타이드를 0.1 M 트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB) 9 μl에 재구성한 후, ACN에 현탁된 TMT 시약 7 μl를 첨가했습니다. 농도는 43.75%였습니다. 60분간 배양 후, 5% 하이드록실아민 2μl를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 표지된 펩타이드를 수집하고 건조시킨 후, 0.1% 포름산(FA) 200μl에 재현탁시키고 두 부분으로 나눈 다음, 자체 제작한 StageTips를 사용하여 탈염 처리하였다. UltiMate 3000 초고성능 액체 크로마토그래피(UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph)를 사용하여, 두 부분 중 한 부분을 130Å 1.7μm C18 입자로 채워진 1mm x 150mm Acquity 크로마토그래피 컬럼(Waters, 카탈로그 번호 SKU: 186006935, Thermo Fisher Scientific)에서 분획하였다. 펩타이드를 30μl/min의 유속으로 분리하고, 1%에서 50%까지 버퍼 B를 85분 동안 단계적으로 증가시킨 후 96분 동안, 50%에서 95%까지 버퍼 B를 3분 동안, 그리고 95% 버퍼 B에서 8분 동안 분리합니다. 버퍼 A는 5% 아세토니트릴(ACN)과 10mM 암모늄 바이카보네이트(ABC)이고, 버퍼 B는 80% ACN과 10mM ABC입니다. 3분마다 분획을 수집하여 두 그룹(1 + 17, 2 + 18 등)으로 합친 후 진공 원심분리기로 건조합니다.
LC-MS/MS 분석. 질량 분석을 위해 펩타이드(번호 r119.aq)는 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ 컬럼(Dr. Maisch, mat)이 장착된 25 cm, 내경 75 μm PicoFrit 분석 컬럼(새로운 대물렌즈, 부품 번호 PF7508250)에서 분리하였다. EASY-nLC 1200(Thermo Fisher Scientific, 독일)을 사용하였다. 컬럼 온도는 50°C로 유지하였다. 완충액 A와 B는 각각 0.1% 포름산 수용액과 0.1% 포름산 80% 아세토니트릴 용액이다. 펩타이드는 200 nl/min의 유속으로 6%에서 31% 완충액 B까지 65분, 그리고 31%에서 50% 완충액 B까지 5분 동안 용출시켰다. 용출된 펩타이드는 Orbitrap Fusion 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석되었습니다. 펩타이드 전구체의 m/z 값 측정은 350~1500 m/z 범위에서 120,000의 분해능으로 수행되었습니다. 27%의 정규화된 충돌 에너지를 사용하여, 전하 상태가 2~6인 가장 강한 전구체를 선택하여 고에너지 C 트랩 해리(HCD) 절단을 수행했습니다. 사이클 시간은 1초로 설정되었습니다. 펩타이드 단편의 m/z 값은 최소 AGC 목표값 5×10⁴ 및 최대 주입 시간 86ms를 사용하여 이온 트랩에서 측정되었습니다. 단편화 후, 전구체는 45초 동안 동적 제외 목록에 추가되었습니다. TMT로 표지된 펩타이드는 50cm, 75μm Acclaim PepMap 컬럼(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 164942)에서 분리되었고, 이동 스펙트럼은 고자기장 비대칭 파형 이온화 질량 분석기(FAIMS)(Thermo Fisher Scientific)가 장착된 Orbitrap Lumos Tribrid 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에서 분석되었습니다. 이 장비는 -50V와 -70V의 두 가지 보상 전압에서 작동합니다. TMT 보고 이온 신호 측정에는 동기화 전구체를 기반으로 선택된 MS3가 사용되었습니다. 펩타이드 분리는 EASY-nLC 1200에서 90% 선형 기울기 용리법을 사용하여 수행되었으며, 완충액 농도는 6%에서 31%까지 변화시켰습니다. 완충액 A는 0.1% 포름산(FA)이었고, 완충액 B는 0.1% 포름산과 80% 아세토니트릴(ACN)이었습니다. 분석 컬럼은 50°C에서 작동되었습니다. FreeStyle(버전 1.6, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 FAIMS 보상 전압에 따라 원본 파일을 분할하십시오.
단백질 동정 및 정량. 통합된 Andromeda 검색 엔진을 사용하여 원본 데이터를 MaxQuant 버전 1.5.2.8(https://maxquant.org/)로 분석했습니다. Aequorea victoria에서 얻은 Cre 재조합효소 및 YFP 서열 외에도, 펩타이드 단편 스펙트럼에서 마우스 참조 프로테옴(Proteome ID UP000000589, 2017년 5월 UniProt에서 다운로드)의 표준 서열 및 이성질체 서열을 검색했습니다. 메티오닌 산화 및 단백질 N-말단 아세틸화를 가변 변형으로, 시스테인 카르바모일 메틸화를 고정 변형으로 설정했습니다. 소화 조건은 "특이성" 및 "트립신/P"로 설정했습니다. 단백질 동정에 사용된 최소 펩타이드 및 레이저 펩타이드 수는 1개, 최소 고유 펩타이드 수는 0개입니다. 펩타이드 맵 매칭 조건에서 단백질 동정률은 0.01로 설정했습니다. “두 번째 펩타이드” 옵션이 활성화되어 있습니다. 서로 다른 원본 파일 간에 성공적인 식별 결과를 전송하려면 “실행 간 일치” 옵션을 사용하십시오. 라벨 없는 정량화(LFQ)에는 최소 비율 카운트 1을 사용하십시오(60). LFQ 강도는 각 시점에서 적어도 하나의 유전자형 그룹에서 최소 두 개의 유효 값으로 필터링되며, 너비가 0.3이고 1.8 아래로 이동하는 정규 분포에서 외삽됩니다. LFQ 결과 분석에는 Perseus 컴퓨팅 플랫폼(https://maxquant.net/perseus/)과 R(https://r-project.org/)을 사용했습니다. 차등 발현 분석에는 limma 소프트웨어 패키지의 양방향 중간 t 검정을 사용했습니다(61). 탐색적 데이터 분석은 ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally 및 pheatmap을 사용하여 수행했습니다. TMT 기반 프로테오믹스 데이터는 MaxQuant 버전 1.6.10.43을 사용하여 분석했습니다. 2018년 9월에 다운로드된 UniProt 인간 단백질체 데이터베이스에서 원시 단백질체 데이터를 검색합니다. 분석에는 제조사에서 제공하는 동위원소 순도 보정 계수가 포함됩니다. 차등 발현 분석에는 R의 limma 함수를 사용합니다. 원본 데이터, 데이터베이스 검색 결과, 데이터 분석 워크플로 및 결과는 모두 PRIDE 파트너 저장소를 통해 ProteomeXchange 연합에 데이터 세트 식별자 PXD019690으로 저장되어 있습니다.
기능적 주석은 분석을 더욱 풍부하게 합니다. Ingenuity Pathway Analysis(QIAGEN) 도구를 사용하여 8주차 데이터 세트의 기능적 주석 용어의 풍부도를 분석했습니다(그림 1). 간단히 설명하면, LC-MS/MS(탠덤 질량 분석법) 데이터 분석에서 얻은 정량적 단백질 목록을 다음과 같은 필터 기준과 함께 사용했습니다. 종과 배경은 Mus musculus로 선택하고, Benjamini 보정 P값이 0.05 이하인 범주를 유의미한 것으로 간주했습니다. 이 그래프에서는 보정 P값을 기준으로 각 클러스터에서 상위 5개의 과잉 범주를 보여줍니다. Benjamini, Krieger, Yekutieli의 2단계 선형 부스팅 프로그램(Q = 5%)을 사용하여 다중 t-검정을 수행하고, 각 범주에서 식별된 중요 후보에 대해 시간 경과에 따른 단백질 발현 분석을 수행했으며, 각 행을 개별적으로 분석했습니다. 일관된 표준 편차를 적용할 필요는 없습니다.
본 연구 결과를 공개된 데이터베이스와 비교하고 그림 1의 벤 다이어그램을 생성하기 위해 정량적 단백질 목록과 MitoCarta 2.0 주석(24)을 결합했습니다. 온라인 도구 Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)을 사용하여 다이어그램을 생성했습니다.
단백질체 분석에 사용된 통계적 절차에 대한 자세한 내용은 재료 및 방법의 해당 부분을 참조하십시오. 다른 모든 실험에 대한 자세한 정보는 해당 범례에서 확인할 수 있습니다. 별도로 명시되지 않은 경우, 모든 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시되며, 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 8.1.2 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
본 논문의 추가 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 에서 확인하실 수 있습니다.
본 논문은 크리에이티브 커먼즈 저작자표시-비상업적 이용약관(Creative Commons Attribution-Non-Commercial License)에 따라 배포되는 오픈 액세스 논문입니다. 이 라이선스는 최종 사용이 상업적 이익을 위한 것이 아니며 원저작물이 정확하다는 전제 하에 모든 매체에서 사용, 배포 및 복제를 허용합니다. 참고문헌.
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작성자: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. 라슨
기능 장애 뉴런에 대한 단백질체 분석 결과, 신경 퇴행을 막기 위해 대사 프로그램이 활성화되는 것으로 나타났다.
작성자: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. 라슨
기능 장애 뉴런에 대한 단백질체 분석 결과, 신경 퇴행을 막기 위해 대사 프로그램이 활성화되는 것으로 나타났다.
©2020 미국과학진흥협회. 모든 권리 보유. AAAS는 HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef 및 COUNTER의 파트너입니다. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.