이 논문은 "첨단 생물정화 기술 및 합성 유기 화합물(SOC) 재활용 공정" 연구 주제의 일부입니다. 전체 14개 논문을 보려면 여기를 클릭하십시오.
나프탈렌 및 치환 나프탈렌(메틸나프탈렌, 나프토산, 1-나프틸-N-메틸카르바메이트 등)과 같은 저분자량 다환 방향족 탄화수소(PAH)는 다양한 산업 분야에서 널리 사용되며 생물체에 유전독성, 돌연변이 유발성 및/또는 발암성을 나타냅니다. 이러한 합성 유기 화합물(SOC) 또는 외래물질은 우선 오염물질로 간주되며 지구 환경과 공중 보건에 심각한 위협을 가합니다. 석탄 가스화, 석유 정제, 차량 배기가스 및 농업 활동과 같은 인간 활동의 강도는 이러한 편재하고 지속적인 화합물의 농도, 거동 및 이동을 결정합니다. 물리적 및 화학적 처리/제거 방법 외에도, POC를 완전히 분해하거나 무독성 부산물로 전환할 수 있는 미생물을 활용하는 생물정화와 같은 친환경 기술이 안전하고 비용 효율적이며 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 토양 미생물군에 존재하는 프로테오박테리아문(Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia, Neosphingobacterium), 피르미쿠테스문(Bacillus, Paenibacillus), 그리고 액티노박테리아문(Rhodococcus, Arthrobacter)에 속하는 다양한 세균 종들은 여러 유기 화합물을 분해하는 능력을 보여왔습니다. 대사 연구, 유전체학, 그리고 메타게놈 분석은 이러한 단순한 생명체에 존재하는 이화작용의 복잡성과 다양성을 이해하는 데 도움을 주며, 이는 효율적인 생분해에 적용될 수 있습니다. 다환방향족 탄화수소(PAH)의 장기간 존재는 플라스미드, 전이인자, 박테리오파지, 게놈 아일랜드, 그리고 통합 접합 요소와 같은 유전적 요소를 이용한 수평적 유전자 전달을 통해 새로운 분해 표현형의 출현을 초래했습니다. 시스템 생물학과 특정 분리균 또는 모델 군집(컨소시엄)의 유전 공학은 시너지 효과를 통해 이러한 PAH의 포괄적이고 신속하며 효율적인 생물 정화를 가능하게 합니다. 본 리뷰에서는 나프탈렌 및 치환 나프탈렌 분해 세균의 다양한 대사 경로 및 다양성, 유전적 구성 및 다양성, 그리고 세포 반응/적응에 초점을 맞추었습니다. 이를 통해 현장 적용에 필요한 생태학적 정보와 효율적인 생물정화를 위한 균주 최적화 방안을 제시하고자 합니다.
석유화학, 농업, 제약, 섬유 염료, 화장품 등 산업의 급속한 발전은 세계 경제 번영과 생활 수준 향상에 기여해 왔습니다. 이러한 기하급수적인 발전은 다양한 제품 제조에 사용되는 수많은 합성 유기 화합물(SOC)의 생산을 초래했습니다. 이러한 외래 화합물 또는 SOC에는 다환 방향족 탄화수소(PAH), 살충제, 제초제, 가소제, 염료, 의약품, 유기인산염, 난연제, 휘발성 유기 용매 등이 포함됩니다. 이들은 대기, 수생 및 육상 생태계로 배출되어 물리화학적 특성 및 군집 구조의 변화를 통해 다양한 생물체에 다차원적인 악영향을 미칩니다(Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). 많은 방향족 오염물질은 산호초, 북극/남극 빙상, 고산 호수, 심해 퇴적물 등과 같은 많은 온전한 생태계/생물다양성 보고에 강력하고 파괴적인 영향을 미칩니다(Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). 최근 지질미생물학 연구에 따르면 합성 유기물(예: 방향족 오염물질) 및 그 유도체가 인공 구조물(건축 환경)(예: 화강암, 석재, 목재 및 금속으로 만들어진 문화 유적지 및 기념물) 표면에 침적되면 이러한 구조물의 열화가 가속화되는 것으로 나타났습니다(Gadd 2017; Liu et al. 2018). 인간 활동은 대기 오염과 기후 변화를 통해 기념물과 건물의 생물학적 열화를 심화시키고 악화시킬 수 있습니다(Liu et al. 2020). 이러한 유기 오염물질은 대기 중의 수증기와 반응하여 구조물에 침적되고, 재료의 물리적 및 화학적 열화를 유발합니다. 생분해는 생물에 의해 발생하는 물질의 외관 및 성질의 바람직하지 않은 변화로, 보존에 영향을 미치는 현상으로 널리 알려져 있습니다(Pochon and Jaton, 1967). 이러한 화합물의 미생물 작용(대사)은 구조적 완전성, 보존 효과 및 문화적 가치를 저하시킬 수 있습니다(Gadd, 2017; Liu et al., 2018). 반면, 어떤 경우에는 미생물이 이러한 구조물에 적응하고 반응하여 생물막이나 기타 보호막을 형성함으로써 분해 속도를 늦추는 등 유익한 결과를 가져오기도 합니다(Martino, 2016). 따라서 석조, 금속 및 목재 기념물의 효과적인 장기 지속 가능한 보존 전략을 개발하기 위해서는 이 과정에 관련된 핵심 메커니즘에 대한 철저한 이해가 필요합니다. 자연적인 과정(지질학적 과정, 산불, 화산 폭발, 식물 및 박테리아 반응)과 비교했을 때, 인간 활동은 다환 방향족 탄화수소(PAH) 및 기타 유기 탄소(OC)를 대량으로 생태계에 방출합니다. 농업(DDT, 아트라진, 카바릴, 펜타클로로페놀 등의 살충제 및 제초제), 산업(원유, 유류 슬러지/폐기물, 석유 유래 플라스틱, PCB, 가소제, 세제, 소독제, 훈증제, 향료 및 방부제), 개인 위생용품(자외선 차단제, 소독제, 해충 퇴치제 및 다환 방향족 화합물) 및 군수품(2,4,6-TNT와 같은 폭발물)에 사용되는 많은 다환 방향족 탄화수소(PAH)는 지구 건강에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 외래물질입니다(Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). 이 목록은 석유 유래 화합물(연료유, 윤활유, 아스팔텐), 고분자량 바이오플라스틱 및 이온성 액체를 포함하도록 확장될 수 있습니다(Amde et al., 2015). 표 1은 다양한 방향족 오염물질과 여러 산업 분야에서의 적용 사례를 보여줍니다. 최근 몇 년 동안 휘발성 유기화합물뿐만 아니라 이산화탄소 및 기타 온실가스의 인위적 배출량이 증가하기 시작했습니다(Dvorak et al., 2017). 그러나 인위적인 영향은 자연적인 영향을 훨씬 능가합니다. 또한, 여러 유기 오염물질(SOC)이 다양한 환경에서 오랫동안 잔류하며 생태계에 악영향을 미치는 신흥 오염물질로 확인되었습니다(그림 1). 미국 환경보호청(USEPA)과 같은 환경 기관들은 이러한 오염물질들이 세포독성, 유전독성, 돌연변이 유발성 및 발암성을 가지고 있다는 이유로 우선 관리 대상 목록에 포함시켰습니다. 따라서 엄격한 폐기물 처리 규제와 오염된 생태계에서 폐기물을 처리/제거하기 위한 효과적인 전략이 필요합니다. 열분해, 산화열처리, 폭기, 매립, 소각 등 다양한 물리적 및 화학적 처리 방법은 효과가 미미하고 비용이 많이 들며 부식성, 독성 및 처리가 어려운 부산물을 생성합니다. 전 세계적으로 환경에 대한 인식이 높아짐에 따라 할로겐화, 니트로, 알킬 및/또는 메틸 화합물과 같은 오염물질 및 그 유도체를 분해할 수 있는 미생물에 대한 관심이 증가하고 있습니다(Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). 이러한 토착 미생물을 단독 또는 혼합 배양(콜로니)하여 방향족 오염물질을 제거하는 것은 환경 안전성, 비용, 효율성, 효과성 및 지속가능성 측면에서 이점이 있습니다. 연구자들은 또한 미생물 공정과 전기화학적 산화환원 방법을 통합한 생물전기화학 시스템(BES)을 오염물질 처리/제거를 위한 유망한 기술로 연구하고 있습니다(Huang et al., 2011). 생물전기화학시스템(BES) 기술은 높은 효율성, 저비용, 환경 안전성, 상온 작동, 생체 적합성 재료, 그리고 유용한 부산물(예: 전기, 연료, 화학물질) 회수 능력으로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다(Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). 고처리량 게놈 시퀀싱 및 오믹스 도구/방법의 등장으로 다양한 분해 미생물의 반응에 대한 유전적 조절, 단백질체학, 물질 흐름체학에 대한 풍부한 새로운 정보가 제공되었습니다. 이러한 도구를 시스템 생물학과 결합함으로써 효율적이고 효과적인 생분해를 달성하기 위해 미생물의 표적 이화 경로(즉, 대사 설계)를 선택하고 미세 조정하는 것에 대한 이해가 더욱 향상되었습니다. 적합한 후보 미생물을 사용하여 효과적인 생물 정화 전략을 설계하려면 미생물의 생화학적 잠재력, 대사 다양성, 유전적 구성 및 생태(자생태학/공생태학)를 이해해야 합니다.
그림 1. 다양한 환경과 생물에 영향을 미치는 다양한 요인을 통한 저분자량 PAH의 발생원 및 이동 경로. 점선은 생태계 요소 간의 상호작용을 나타낸다.
본 리뷰에서는 나프탈렌 및 치환 나프탈렌과 같은 단순 다환방향족 탄화수소(PAH)의 다양한 세균 분리주에 의한 분해에 관한 데이터를 대사 경로 및 다양성, 분해에 관여하는 효소, 유전자 구성/함량 및 다양성, 세포 반응, 그리고 생물정화의 다양한 측면을 포함하여 요약하고자 했습니다. 생화학적 및 분자적 수준에서의 이해는 적합한 숙주 균주를 식별하고 효과적인 생물정화를 위한 유전자 조작을 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 이는 특정 지역에 적합한 세균 컨소시엄을 구축하여 효과적인 생물정화를 위한 전략을 개발하는 데 기여할 것입니다.
독성이 강하고 위험한 방향족 화합물(후켈 규칙 4n + 2π 전자, n = 1, 2, 3, …을 만족하는 화합물)이 다수 존재함으로써 대기, 토양, 퇴적물, 지표수 및 지하수와 같은 다양한 환경 매체에 심각한 위협을 가합니다(Puglisi et al., 2007). 이러한 화합물은 단일 벤젠 고리(단환형) 또는 다중 벤젠 고리(다환형)가 선형, 각형 또는 클러스터 형태로 배열되어 있으며, 높은 음의 공명 에너지와 불활성으로 인해 환경에서 안정성(안정성/불안정성)을 나타냅니다. 이러한 불활성은 화합물의 소수성과 환원된 상태로 설명할 수 있습니다. 방향족 고리가 메틸기(-CH3), 카르복실기(-COOH), 하이드록실기(-OH) 또는 설폰산기(-HSO3)로 치환되면 안정성이 높아지고 고분자 물질에 ​​대한 친화력이 강해지며 생물계에 축적되는 성질을 나타낸다(Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). 나프탈렌 및 그 유도체[메틸나프탈렌, 나프토산, 나프탈렌설폰산, 1-나프틸 N-메틸카르바메이트(카르바릴)]와 같은 일부 저분자량 다환 방향족 탄화수소(LMWAH)는 유전독성, 돌연변이 유발성 및/또는 발암성을 지닌 물질로 미국 환경보호청(EPA)의 우선 유기 오염물질 목록에 포함되었다(Cerniglia, 1984). 이러한 종류의 NM-PAH가 환경으로 방출되면 먹이 사슬의 모든 단계에서 이러한 화합물의 생물 축적이 발생하여 생태계 건강에 영향을 미칠 수 있습니다(Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
다환방향족탄화수소(PAH)가 생물체로 유입되는 주요 경로는 토양, 지하수, 지표수, 작물, 대기 등 다양한 생태계 구성 요소 간의 이동 및 상호작용입니다(Arey and Atkinson, 2003). 그림 1은 생태계 내 다양한 ​​저분자량 PAH의 상호작용 및 분포와 생물체/인간 노출 경로를 보여줍니다. PAH는 대기 오염, 차량 배기가스, 산업 배기가스(석탄 가스화, 연소 및 코크스 생산)의 이동(비산) 및 침적을 통해 표면에 침착됩니다. 합성 섬유, 염료 및 페인트 제조, 목재 방부 처리, 고무 가공, 시멘트 제조, 살충제 생산 및 농업 활동은 육상 및 수생 시스템에서 PAH의 주요 발생원입니다(Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). 연구에 따르면 교외 및 도시 지역, 고속도로 인근, 대도시의 토양은 발전소, 주거 난방, 대기 및 도로 교통량, 건설 활동으로 인한 배출물 때문에 다환 방향족 탄화수소(PAH)에 더 취약한 것으로 나타났습니다(Suman et al., 2016). (2008) 연구에서는 미국 루이지애나주 뉴올리언스의 도로 인근 토양에서 PAH 농도가 7189 μg/kg에 달하는 반면, 개방된 공간에서는 2404 μg/kg에 불과한 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 미국 여러 도시의 석탄 가스화 시설 인근 지역에서도 PAH 농도가 300 μg/kg에 달하는 것으로 보고되었습니다(Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). 델리(Sharma et al., 2008), 아그라(Dubey et al., 2014), 뭄바이(Kulkarni and Venkataraman, 2000), 비사카파트남(Kulkarni et al., 2014) 등 인도 여러 도시의 토양에서 고농도의 다환방향족탄화수소(PAH)가 검출되었다는 보고가 있습니다. 방향족 화합물은 토양 입자, 유기물, 점토 광물에 쉽게 흡착되어 생태계의 주요 탄소 흡수원이 됩니다(Srogi, 2007; Peng et al., 2008). 수생태계에서 PAH의 주요 발생원은 강수(습식/건식 강수 및 수증기), 도시 유출수, 폐수 방류, 지하수 유입 등입니다(Srogi, 2007). 해양 생태계에 존재하는 PAH의 약 80%는 강수, 침전 및 폐기물 배출에서 유래하는 것으로 추정됩니다(Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). 표층수나 고형 폐기물 처리장의 침출수에 고농도의 PAH가 함유되면 결국 지하수로 유출되어 남아시아와 동남아시아 인구의 70% 이상이 지하수를 마시고 있기 때문에 심각한 공중 보건 위협이 됩니다(Duttagupta et al., 2019). Duttagupta et al.(2020)의 최근 연구에서는 인도 서벵골 지역의 강(32)과 지하수(235)를 분석한 결과, 도시 거주자의 약 53%와 농촌 거주자의 약 44%(총 2천만 명)가 나프탈렌(4.9–10.6 μg/L) 및 그 유도체에 노출되었을 가능성이 있는 것으로 나타났습니다. 토지 이용 패턴의 차이와 지하수 추출량 증가는 지하에서 저분자량 다환방향족 탄화수소(PAH)의 수직 이동(이류)을 제어하는 ​​주요 요인으로 여겨집니다. 농업 유출수, 도시 및 산업 폐수 방류, 고형 폐기물/쓰레기 방류는 하천 유역과 지하 퇴적물의 PAH에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 대기 강수는 PAH 오염을 더욱 악화시킵니다. 프레이저 강, 루안 강, 덴소 강, 미주리 강, 아나코스티아 강, 에브로 강, 델라웨어 강 등 전 세계 여러 강/유역에서 PAH 및 그 알킬 유도체(총 51종)의 고농도가 보고되었습니다(Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). 갠지스 강 유역 퇴적물에서는 나프탈렌과 페난트렌이 가장 중요한 PAH(시료의 70%에서 검출)로 밝혀졌습니다(Duttagupta et al., 2019). 또한, 연구에 따르면 식수 염소 소독은 독성이 더 강한 산소화 및 염소화 PAH의 생성을 유발할 수 있습니다(Manoli and Samara, 1999). PAH는 오염된 토양, 지하수 및 강수로부터 식물이 흡수하여 곡물, 과일 및 채소에 축적됩니다(Fismes et al., 2002). 어류, 홍합, 조개, 새우와 같은 많은 수생 생물은 오염된 음식과 해수를 섭취하거나 조직 및 피부를 통해 PAH에 오염됩니다(Mackay and Fraser, 2000). 그릴, 로스팅, 훈제, 튀김, 건조, 베이킹 및 숯불구이와 같은 조리/가공 방법 또한 식품에 상당량의 PAH를 함유시킬 수 있습니다. 이는 주로 훈연 재료의 선택, 페놀/방향족 탄화수소 함량, 조리 방법, 가열 장치 유형, 수분 함량, 산소 공급 및 연소 온도에 따라 달라집니다(Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). 다환 방향족 탄화수소(PAH)는 우유에서도 다양한 농도(0.75~2.1 mg/L)로 검출되었습니다(Girelli et al., 2014). 식품 내 PAH 축적은 식품의 물리화학적 특성에 따라 달라지며, 독성 효과는 생리 기능, 대사 활동, 흡수, 분포 및 체내 분포와 관련이 있습니다(Mechini et al., 2011).
다환방향족탄화수소(PAH)의 독성과 유해성은 오래전부터 알려져 왔다(Cherniglia, 1984). 저분자량 다환방향족탄화수소(LMW-PAH)(2~3개의 고리)는 DNA, RNA, 단백질과 같은 다양한 거대 분자에 공유 결합할 수 있으며 발암성이 있다(Santarelli et al., 2008). 소수성 특성으로 인해 지질막에 의해 차단된다. 인체에서는 시토크롬 P450 모노옥시게나제가 PAH를 에폭사이드로 산화시키는데, 이 중 일부(예: 바에디올 에폭사이드)는 반응성이 매우 높아 정상 세포를 악성 세포로 변형시킬 수 있다(Marston et al., 2001). 또한, 퀴논, 페놀, 에폭사이드, 디올 등과 같은 PAH의 변환 생성물은 모화합물보다 독성이 더 강하다. 일부 다환방향족 탄화수소(PAH)와 그 대사 중간체는 호르몬 및 다양한 대사 효소에 영향을 미쳐 성장, 중추신경계, 생식계 및 면역계에 악영향을 미칠 수 있습니다(Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). 저분자량 PAH에 단기간 노출될 경우 천식 환자의 폐 기능 저하 및 혈전증을 유발하고 피부암, 폐암, 방광암, 위장관암의 위험을 증가시키는 것으로 보고되었습니다(Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). 동물 연구에서도 PAH 노출이 생식 기능 및 발달에 악영향을 미치고 백내장, 신장 및 간 손상, 황달을 유발할 수 있음이 밝혀졌습니다. 다이올, 에폭사이드, 퀴논 및 자유 라디칼(양이온)과 같은 다양한 PAH 생체 변환 생성물은 DNA 부가물을 형성하는 것으로 나타났습니다. 안정적인 부가물은 DNA 복제 기작을 변화시키는 것으로 나타났으며, 불안정한 부가물은 DNA의 퓨린기를 탈퓨린화(주로 아데닌으로, 때로는 구아닌으로)할 수 있습니다. 둘 다 돌연변이를 유발하는 오류를 생성할 수 있습니다(Schweigert et al. 2001). 또한, 퀴논(벤조/판퀴논)은 활성산소종(ROS)을 생성하여 DNA 및 기타 거대분자에 치명적인 손상을 일으켜 조직 기능/생존력에 영향을 미칠 수 있습니다(Ewa and Danuta 2017). 피렌, 비페닐, 나프탈렌의 저농도에 만성적으로 노출되면 실험 동물에서 암을 유발하는 것으로 보고되었습니다(Diggs et al. 2012). 이러한 다환방향족 탄화수소(PAH)는 치명적인 독성을 가지고 있으므로 오염된 지역에서 제거하는 것이 최우선 과제입니다.
오염된 부지/환경에서 다환방향족탄화수소(PAH)를 제거하기 위해 다양한 물리적, 화학적 방법이 사용되어 왔습니다. 소각, 탈염소화, 자외선 산화, 고정화, 용매 추출과 같은 공정은 독성 부산물 생성, 복잡한 공정, 안전 및 규제 문제, 낮은 효율성, 높은 비용 등 여러 단점을 가지고 있습니다. 그러나 미생물 생분해(생물정화)는 순수 배양 또는 군집 형태의 미생물을 이용하는 유망한 대안입니다. 물리적, 화학적 방법과 비교했을 때, 이 공정은 환경친화적이고, 비침습적이며, 비용 효율적이고, 지속 가능합니다. 생물학적 정화는 오염된 현장(현장) 또는 특별히 준비된 현장(외부)에서 수행될 수 있으므로 기존의 물리적 및 화학적 방법보다 더 지속 가능한 정화 방법으로 간주됩니다(Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
방향족 오염물질 분해에 관여하는 미생물 대사 단계를 이해하는 것은 생태 및 환경 지속가능성에 막대한 과학적, 경제적 의미를 지닙니다. 전 세계적으로 약 2.1×10¹⁸g의 탄소(C)가 퇴적물과 유기 화합물(예: 석유, 천연가스, 석탄, 즉 화석 연료)에 저장되어 있으며, 이는 지구 탄소 순환에 상당한 기여를 합니다. 그러나 급속한 산업화, 화석 연료 추출 및 인간 활동으로 인해 이러한 지각 탄소 저장고가 고갈되고 있으며, 매년 약 5.5×10¹⁵g의 유기 탄소(오염물질 형태로)가 대기 중으로 방출되고 있습니다(Gonzalez-Gaya et al., 2019). 이러한 유기 탄소의 대부분은 퇴적, 이동 및 유출을 통해 육상 및 해양 생태계로 유입됩니다. 또한, 플라스틱, 가소제, 플라스틱 안정제(프탈레이트 및 그 이성체)와 같은 화석 연료에서 유래한 새로운 합성 오염물질은 해양, 토양, 수생 생태계와 그 생물들을 심각하게 오염시켜 지구 기후 위험을 악화시키고 있습니다. 다양한 종류의 미세플라스틱, 나노플라스틱, 플라스틱 조각, 그리고 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)에서 유래한 독성 단량체 생성물은 북미와 동남아시아 사이의 태평양에 축적되어 "태평양 거대 쓰레기 섬"을 형성하고 해양 생물에 해를 끼치고 있습니다(Newell et al., 2020). 과학 연구에 따르면 이러한 오염물질/폐기물은 어떠한 물리적 또는 화학적 방법으로도 제거할 수 없습니다. 이러한 상황에서 가장 유용한 미생물은 오염물질을 산화적으로 대사하여 이산화탄소, 화학 에너지 및 기타 무독성 부산물로 전환하고, 이러한 부산물은 궁극적으로 다른 영양소 순환 과정(H, O, N, S, P, Fe 등)에 기여하는 미생물입니다. 따라서 방향족 오염물질의 광물화에 대한 미생물 생태생리학과 환경적 제어 방안을 이해하는 것은 미생물 탄소 순환, 순 탄소 수지 및 미래 기후 위험을 평가하는 데 매우 중요합니다. 환경에서 이러한 화합물을 제거해야 할 필요성이 시급해짐에 따라 청정 기술에 초점을 맞춘 다양한 친환경 산업이 등장했습니다. 또한, 생태계에 축적된 산업 폐기물/폐화학물질을 가치화하는 것(즉, 폐기물을 자원으로 전환하는 접근법)은 순환 경제와 지속 가능한 개발 목표의 핵심 요소 중 하나로 여겨집니다(Close et al., 2012). 그러므로 이러한 잠재적 분해 후보 물질의 대사적, 효소적, 유전적 측면을 이해하는 것은 방향족 오염물질의 효과적인 제거 및 생물학적 정화를 위해 매우 중요합니다.
다양한 방향족 오염물질 중에서도 나프탈렌 및 치환 나프탈렌과 같은 저분자량 다환방향족 탄화수소(PAH)에 특히 주목해야 합니다. 이 화합물들은 석유 유래 연료, 섬유 염료, 소비재, 살충제(나프탈렌 및 해충 기피제), 가소제 및 탄닌의 주요 성분으로, 다양한 생태계에 널리 분포되어 있습니다(Preuss et al., 2003). 최근 연구에서는 대수층 퇴적물, 지하수 및 표토, 불포화대, 하천 바닥에서 나프탈렌 농도가 축적되는 것이 보고되었으며, 이는 환경에서의 생물 축적을 시사합니다(Duttagupta et al., 2019, 2020). 표 2는 나프탈렌 및 그 유도체의 물리화학적 특성, 용도 및 건강 영향을 요약한 것입니다. 다른 고분자량 다환방향족탄화수소(PAH)와 비교했을 때, 나프탈렌과 그 유도체는 소수성이 낮고 수용성이 높으며 생태계에 널리 분포되어 있어 PAH의 대사, 유전학 및 대사 다양성을 연구하는 모델 기질로 자주 사용됩니다. 많은 미생물이 나프탈렌과 그 유도체를 대사할 수 있으며, 이들의 대사 경로, 효소 및 조절 특성에 대한 포괄적인 정보가 축적되어 있습니다(Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). 또한, 나프탈렌과 그 유도체는 높은 존재량과 생체이용률로 인해 환경오염 평가를 위한 프로토타입 화합물로 지정되어 있습니다. 미국 환경보호청(EPA)은 담배 연기에서 발생하는 나프탈렌의 평균 농도가 입방미터당 5.19μg이며, 이는 주로 불완전 연소에서 비롯된다고 추정합니다. 또한 간접흡연에서는 7.8~46μg의 나프탈렌이 검출되며, 크레오소트와 나프탈렌에 대한 노출은 이보다 100~10,000배 더 높습니다(Preuss et al. 2003). 특히 나프탈렌은 종, 지역, 성별에 따라 호흡기 독성과 발암성이 다르게 나타나는 것으로 알려져 있습니다. 국제암연구기관(IARC)은 동물 연구를 바탕으로 나프탈렌을 "인체 발암 가능 물질"(그룹 2B)로 분류했습니다. 치환 나프탈렌에 대한 노출은 주로 흡입이나 경구 투여를 통해 이루어지며, 쥐와 생쥐에서 폐 조직 손상을 유발하고 폐 종양 발생률을 증가시킵니다(National Toxicology Program 2). 급성 영향으로는 메스꺼움, 구토, 복통, 설사, 두통, 혼란, 심한 발한, 발열, 빈맥 등이 있습니다. 한편, 광범위 살충제인 카바메이트계 살충제 카바릴(1-나프틸 N-메틸카바메이트)은 수생 무척추동물, 양서류, 꿀벌 및 인간에게 독성이 있는 것으로 보고되었으며, 아세틸콜린에스테라제를 억제하여 마비를 유발하는 것으로 나타났습니다(Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). 따라서 오염된 환경에서 생물정화 전략을 개발하기 위해서는 미생물 분해 메커니즘, 유전자 조절, 효소 및 세포 반응을 이해하는 것이 매우 중요합니다.
표 2. 나프탈렌 및 그 유도체의 물리화학적 특성, 용도, 식별 방법 및 관련 질병에 대한 상세 정보.
오염된 환경에서 소수성 및 친유성 방향족 오염물질은 환경 미생물 군집에 다양한 세포적 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어 막 유동성 변화, 막 투과성 증가, 지질 이중층 팽창, 에너지 전달(전자 전달 사슬/양성자 구동력) 장애, 막 관련 단백질 활성 저하 등이 있습니다(Sikkema et al., 1995). 또한 카테콜과 퀴논과 같은 일부 수용성 중간체는 활성산소종(ROS)을 생성하고 DNA 및 단백질과 부가물을 형성합니다(Penning et al., 1999). 따라서 생태계 내 이러한 화합물의 풍부함은 미생물 군집이 흡수/수송, 세포 내 변환, 동화/이용, 구획화 등 다양한 생리적 수준에서 효율적인 분해자로 진화하도록 선택적 압력을 가합니다.
리보솜 데이터베이스 프로젝트-II(RDP-II) 검색 결과, 나프탈렌 또는 그 유도체로 오염된 배지 또는 농축 배양액에서 총 926종의 세균이 분리된 것으로 나타났습니다. 프로테오박테리아(Proteobacteria) 그룹이 가장 많은 종(n = 755)을 차지했으며, 그 다음으로 피르미쿠테스(Firmicutes, 52종), 박테로이데테스(Bacteroidetes, 43종), 액티노박테리아(Actinobacteria, 39종), 테네리쿠테스(Tenericutes, 10종), 그리고 미분류 세균(8종) 순이었습니다(그림 2). γ-프로테오박테리아(Pseudomonadales 및 Xanthomonadales) 그룹은 높은 G+C 함량을 가진 모든 그람 음성 세균 그룹에서 가장 큰 비중(54%)을 차지했으며, Clostridiales 및 Bacillales 그룹은 낮은 G+C 함량을 가진 그람 양성 세균 그룹(30%)이었습니다. 슈도모나스(가장 많은 종인 338종)는 다양한 오염된 생태계(석탄 타르, 석유, 원유, 슬러지, 기름 유출, 폐수, 유기성 폐기물 및 매립지)뿐만 아니라 오염되지 않은 생태계(토양, 강, 퇴적물 및 지하수)에서도 나프탈렌과 그 메틸 유도체를 분해할 수 있는 것으로 보고되었습니다(그림 2). 더 나아가, 이러한 지역 중 일부에 대한 농축 연구 및 메타게놈 분석 결과, 배양되지 않은 레지오넬라균과 클로스트리디움균도 분해 능력을 가질 수 있음이 밝혀졌으며, 이는 새로운 경로와 대사 다양성을 연구하기 위해 이러한 박테리아를 배양할 필요성을 시사합니다.
그림 2. 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체로 오염된 환경에서 발견되는 세균 대표종의 분류학적 다양성과 생태학적 분포.
다양한 방향족 탄화수소 분해 미생물 중에서 대부분은 나프탈렌을 유일한 탄소 및 에너지원으로 분해할 수 있습니다. 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 속의 나프탈렌 대사 과정은 이미 규명되었습니다. (균주: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 및 CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 및 기타 균주(ND6 및 AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006); 대사는 다성분 디옥시게나제[나프탈렌 디옥시게나제(NDO), 고리 수산화 디옥시게나제]에 의해 시작되며, 이 효소는 분자 산소를 다른 기질로 사용하여 나프탈렌의 방향족 고리 중 하나를 산화시켜 나프탈렌을 시스-나프탈렌디올로 전환합니다(그림 3). 시스-디하이드로디올은 다음으로 전환됩니다. 1,2-디히드록시나프탈렌은 탈수소효소에 의해 분해됩니다. 고리 절단형 이산화효소인 1,2-디히드록시나프탈렌 이산화효소(12DHNDO)는 1,2-디히드록시나프탈렌을 2-히드록시크로멘-2-카르복실산으로 전환합니다. 효소적 시스-트랜스 이성질화 반응을 통해 트랜스-o-히드록시벤질리덴피루브산이 생성되고, 이는 수화효소인 알돌라아제에 의해 살리실알데히드와 피루브산으로 분해됩니다. 유기산인 피루브산은 나프탈렌 탄소 골격에서 유래하여 중심 탄소 경로로 들어가는 첫 번째 C3 화합물입니다. 또한, NAD+-의존성 살리실알데히드 탈수소효소는 살리실알데히드를 살리실산으로 전환합니다. 이 단계의 대사를 나프탈렌 분해의 "상위 경로"라고 합니다. 이 경로는 대부분의 나프탈렌 분해 세균에서 매우 흔하게 나타납니다. 그러나 몇 가지 예외가 있는데, 예를 들어 호열성 세균인 바실러스 함부르기(Bacillus hamburgii)가 있습니다. 2. 나프탈렌 분해는 나프탈렌 2,3-디옥시게나제에 의해 시작되어 2,3-디히드록시나프탈렌을 형성합니다(Annweiler et al., 2000).
그림 3. 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 나프토산 및 카바릴 분해 경로. 원으로 표시된 숫자는 나프탈렌과 그 유도체를 순차적으로 다음 생성물로 전환하는 효소를 나타냅니다. 1 — 나프탈렌 이산화효소(NDO); 2, 시스-디하이드로디올 탈수소효소; 3, 1,2-디하이드록시나프탈렌 이산화효소; 4, 2-하이드록시크로멘-2-카르복실산 이성질화효소; 5, 트랜스-O-하이드록시벤질리덴피루베이트 수화효소 알돌라제; 6, 살리실알데히드 탈수소효소; 7, 살리실산 1-수산화효소; 8, 카테콜 2,3-이산화효소(C23DO); 9, 2-하이드록시무코네이트 세미알데히드 탈수소효소; 10, 2-옥소펜트-4-에노에이트 수화효소; 11, 4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 알돌라아제; 12, 아세트알데히드 탈수소효소; 13, 카테콜-1,2-디옥시게나아제(C12DO); 14, 뮤코네이트 시클로이소머라아제; 15, 뮤코놀락톤 델타-이소머라아제; 16, β-케토아디페이트 에놀락톤 가수분해효소; 17, β-케토아디페이트 숙시닐-CoA 전이효소; 18, β-케토아디페이트-CoA 티올라아제; 19, 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 숙시닐 전이효소; 20, 살리실레이트 5-하이드록실라아제; 21 – 겐티세이트 1,2-디옥시게나아제(GDO); 22, 말레일피루베이트 이소머라아제; 23, 푸마릴피루베이트 가수분해효소; 24, 메틸나프탈렌 하이드록실라제(NDO); 25, 하이드록시메틸나프탈렌 탈수소효소; 26, 나프탈데하이드 탈수소효소; 27, 3-포르밀살리실산 산화효소; 28, 하이드록시이소프탈레이트 탈카르복실라제; 29, 카바릴 하이드롤라제(CH); 30, 1-나프톨-2-하이드록실라제.
생물체와 그 유전적 구성에 따라, 생성된 살리실산은 살리실산 1-하이드록실라제(S1H)를 이용한 카테콜 경로 또는 살리실산 5-하이드록실라제(S5H)를 이용한 겐티세이트 경로를 통해 추가적으로 대사됩니다(그림 3). 살리실산은 나프탈렌 대사의 주요 중간체(상위 경로)이기 때문에, 살리실산에서 TCA 회로 중간체로 이어지는 단계를 하위 경로라고 하며, 관련 유전자들은 하나의 오페론으로 구성됩니다. 상위 경로 오페론(nah)과 하위 경로 오페론(sal)의 유전자들은 공통적인 조절 인자에 의해 조절되는 경우가 흔합니다. 예를 들어, NahR과 살리실산은 유도체로 작용하여 두 오페론 모두 나프탈렌을 완전히 대사할 수 있도록 합니다(Phale et al., 2019, 2020).
또한, 카테콜은 카테콜 2,3-디옥시게나제(C23DO)에 의해 메타 경로를 통해 2-하이드록시무코네이트 세미알데하이드로 순환적으로 분해되고(Yen et al., 1988), 2-하이드록시무코네이트 세미알데하이드 가수분해효소에 의해 가수분해되어 2-하이드록시펜트-2,4-디에노산이 생성됩니다. 2-하이드록시펜트-2,4-디에노산은 하이드라타제(2-옥소펜트-4-에노에이트 하이드라타제)와 알돌라제(4-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 알돌라제)에 의해 피루브산과 아세트알데하이드로 전환된 후 중심 탄소 경로로 들어갑니다(그림 3). 또는, 카테콜은 카테콜 1,2-옥시게나제(C12DO)에 의해 오르토 경로를 통해 시스,시스-무코네이트로 순환적으로 분해됩니다. 무콘산 고리형 이성질화효소, 무콘산락톤 이성질화효소 및 β-케토아디페이트-놀락톤 가수분해효소는 cis,cis-무콘산을 3-옥소아디페이트로 변환하며, 이는 숙시닐-CoA 및 아세틸-CoA를 통해 중심 탄소 경로로 들어갑니다(Nozaki et al., 1968)(그림 3).
젠티세이트(2,5-디하이드록시벤조에이트) 경로에서 방향족 고리는 젠티세이트 1,2-디옥시게나제(GDO)에 의해 분해되어 말레일피루베이트를 생성합니다. 이 생성물은 직접 가수분해되어 피루브산과 말산으로 전환되거나, 이성질화되어 푸마릴피루베이트를 형성한 후 다시 가수분해되어 피루브산과 푸마르산으로 전환될 수 있습니다(Larkin and Day, 1986). 이러한 대체 경로의 선택은 그람 음성균과 그람 양성균 모두에서 생화학적 및 유전적 수준에서 관찰되었습니다(Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). 그람 음성균(슈도모나스)은 나프탈렌 대사의 유도물질인 살리실산을 선호하며, 살리실산 1-하이드록실라제를 이용하여 나프탈렌을 탈카르복실화시켜 카테콜로 전환합니다(Gibson and Subramanian, 1984). 반면에 그람 양성 세균(로도코커스)에서는 살리실산 5-하이드록실라제가 살리실산을 겐티신산으로 전환시키지만, 살리실산은 나프탈렌 유전자 전사에 유도 효과를 나타내지 않습니다(Grund et al., 1992)(그림 3).
Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas 및 Mycobacterium 종과 같은 미생물들이 모노메틸나프탈렌 또는 디메틸나프탈렌을 분해할 수 있다는 보고가 있다(Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). 특히 Pseudomonas sp. CSV86의 1-메틸나프탈렌 및 2-메틸나프탈렌 분해 경로는 생화학적 및 효소적 수준에서 명확하게 연구되었다(Mahajan et al., 1994). 1-메틸나프탈렌은 두 가지 경로를 통해 대사됩니다. 첫째, 방향족 고리(메틸나프탈렌의 비치환 고리)가 수산화되어 cis-1,2-디하이드록시-1,2-디하이드로-8-메틸나프탈렌을 형성하고, 이는 추가적으로 산화되어 살리실산메틸과 카테콜메틸메틸을 생성한 후 고리 절단 후 중심 탄소 경로로 들어갑니다(그림 3). 이 경로를 "탄소원 경로"라고 합니다. 두 번째 "해독 경로"에서는 메틸기가 NDO에 의해 수산화되어 1-하이드록시메틸나프탈렌을 형성하고, 이는 추가적으로 산화되어 1-나프토산이 되어 최종 생성물로서 배양 배지로 배출됩니다. 연구 결과에 따르면 CSV86 균주는 1-나프토산과 2-나프토산을 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용할 경우 생장할 수 없으며, 이는 CSV86 균주의 해독 경로를 뒷받침합니다(Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). 2-메틸나프탈렌에서 메틸기는 하이드록실화효소에 의해 하이드록실화되어 2-하이드록시메틸나프탈렌을 형성합니다. 또한, 나프탈렌 고리의 비치환된 고리는 고리 하이드록실화 반응을 통해 디하이드로디올을 형성하고, 이는 일련의 효소 촉매 반응을 통해 4-하이드록시메틸카테콜로 산화된 후 메타 고리 절단 경로를 거쳐 중심 탄소 경로로 들어갑니다. 마찬가지로, S. paucimobilis 2322는 NDO를 이용하여 2-메틸나프탈렌을 하이드록실화하고, 이를 추가 산화시켜 메틸 살리실레이트와 메틸카테콜을 생성하는 것으로 보고되었습니다(Dutta et al., 1998).
나프토산(치환/비치환)은 메틸나프탈렌, 페난트렌, 안트라센의 분해 과정에서 생성되는 해독/생물변환 부산물로, 사용 후 배양액으로 방출됩니다. 토양 분리균인 Stenotrophomonas maltophilia CSV89는 1-나프토산을 탄소원으로 대사할 수 있는 것으로 보고되었습니다(Phale et al., 1995). 대사는 방향족 고리의 이수산화 반응을 통해 1,2-디히드록시-8-카르복시나프탈렌을 형성하는 것으로 시작됩니다. 생성된 디올은 2-히드록시-3-카르복시벤질리덴피루브산, 3-포르밀살리실산, 2-히드록시이소프탈산, 살리실산을 거쳐 카테콜로 산화되고, 메타 고리 절단 경로를 통해 중심 탄소 경로로 들어갑니다(그림 3).
카바릴은 나프틸 카바메이트계 살충제입니다. 1970년대 인도의 녹색혁명 이후 화학비료와 살충제 사용이 증가하면서 농업 비점오염원으로부터의 다환방향족탄화수소(PAH) 배출량이 늘어났습니다(Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). 인도 전체 경작지의 약 55%(8,572만 2천 헥타르)가 화학 살충제로 처리되고 있습니다. 지난 5년(2015~2020년) 동안 인도 농업 부문은 연평균 5만 5천~6만 톤의 살충제를 사용했습니다(인도 농업부 산하 협동조합 및 농민복지부, 2020년 8월). 인구와 인구밀도가 가장 높은 북부 및 중부 갠지스 평원 지역에서는 작물에 대한 살충제 사용이 광범위하며, 특히 살충제가 주를 이룹니다. 카바릴(1-나프틸-N-메틸카바메이트)은 광범위 살충 효과를 지닌 중등도에서 고독성의 카바메이트계 살충제로, 인도 농업에서 평균 100~110톤이 사용됩니다. 일반적으로 세빈(Sevin)이라는 상품명으로 판매되며, 옥수수, 대두, 면화, 과일, 채소 등 다양한 작물에 피해를 주는 진딧물, 불개미, 벼룩, 응애, 거미 등의 해충 방제에 사용됩니다. 또한, 슈도모나스(NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), 로도코커스(NCIB 12038), 스핑고박테리움(CF06), 버크홀데리아(C3), 미코코커스, 아르트로박터 등의 미생물도 다른 해충 방제에 사용될 수 있습니다. RC100은 카바릴을 분해할 수 있는 것으로 보고되었습니다(Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). 카바릴 분해 경로는 Pseudomonas sp. 균주 C4, C5 및 C6의 토양 분리주에서 생화학적, 효소적 및 유전적 수준에서 광범위하게 연구되었습니다(Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (그림 3). 대사 경로는 카바릴 가수분해효소(CH)에 의한 에스테르 결합의 가수분해로 시작하여 1-나프톨, 메틸아민 및 이산화탄소를 생성합니다. 1-나프톨은 1-나프톨 하이드록실라제(1-NH)에 의해 1,2-디하이드록시나프탈렌으로 전환되며, 이는 살리실산과 젠티산을 거치는 중심 탄소 경로를 통해 추가적으로 대사됩니다. 일부 카바릴 분해 세균은 카테콜의 오르토 고리를 절단하여 살리실산으로 대사하는 것으로 보고되었습니다(Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). 특히, 나프탈렌 분해 세균은 주로 카테콜 경로를 통해 살리실산을 대사하는 반면, 카바릴 분해 세균은 젠티산 경로를 통해 살리실산을 대사하는 것을 선호합니다.
나프탈렌술폰산/디술폰산 및 나프틸아민술폰산 유도체는 아조 염료, 습윤제, 분산제 등의 생산에 중간체로 사용될 수 있습니다. 이러한 화합물은 인체에 대한 독성은 낮지만, 세포독성 평가 결과 어류, 물벼룩, 조류에는 치명적인 것으로 나타났습니다(Greim et al., 1994). 슈도모나스(Pseudomonas) 속(A3, C22 균주)의 대표 균주는 술폰산기를 포함하는 방향족 고리의 이중 수산화 반응을 통해 디하이드로디올을 생성하고, 이를 아황산염기의 자발적인 분해를 통해 1,2-디하이드록시나프탈렌으로 전환하는 대사 과정을 시작하는 것으로 보고되었습니다(Brilon et al., 1981). 생성된 1,2-디하이드록시나프탈렌은 고전적인 나프탈렌 경로, 즉 카테콜 경로 또는 젠티세이트 경로를 통해 분해됩니다(그림 4). 아미노나프탈렌술폰산과 히드록시나프탈렌술폰산은 상보적인 이화 경로를 가진 혼합 세균 컨소시엄에 의해 완전히 분해될 수 있음이 밝혀졌습니다(Nortemann et al., 1986). 컨소시엄의 한 구성원은 1,2-이산화 반응을 통해 아미노나프탈렌술폰산 또는 히드록시나프탈렌술폰산을 탈황시키고, 아미노살리실산 또는 히드록시살리실산은 최종 대사산물로 배양 배지에 방출되어 컨소시엄의 다른 구성원에 의해 흡수되는 것으로 나타났습니다. 나프탈렌디술폰산은 비교적 극성이지만 생분해성이 낮아 다양한 경로를 통해 대사될 수 있습니다. 첫 번째 탈황은 방향족 고리와 술폰산기의 위치 선택적 이수산화 반응 중에 발생합니다. 두 번째 탈황은 살리실산 5-하이드록실화효소에 의한 5-설포살리실산의 하이드록실화 과정에서 일어나 겐티신산을 형성하며, 이는 중심 탄소 경로로 들어간다(Brilon et al., 1981)(그림 4). 나프탈렌 분해를 담당하는 효소는 나프탈렌 설포네이트 대사에도 관여한다(Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
그림 4. 나프탈렌 설포네이트 분해의 대사 경로. 원 안의 숫자는 나프틸 설포네이트 대사에 관여하는 효소를 나타내며, 그림 3에 설명된 효소와 유사하거나 동일합니다.
저분자량 ​​다환방향족 탄화수소(LMW-PAHs)는 환원성이 있고 소수성이며 용해도가 낮아 자연적인 분해가 어렵습니다. 그러나 호기성 미생물은 분자 산소(O2)를 흡수하여 이를 산화시킬 수 있습니다. 이러한 효소는 주로 산화환원효소 계열에 속하며 방향족 고리 수산화(모노 또는 디하이드록실화), 탈수소화 및 방향족 고리 절단과 같은 다양한 반응을 수행할 수 있습니다. 이러한 반응에서 생성된 물질은 산화 상태가 높아 중심 탄소 경로를 통해 더 쉽게 대사됩니다(Phale et al., 2020). 분해 경로에 관여하는 효소는 유도성인 것으로 알려져 있습니다. 세포를 포도당이나 유기산과 같은 단순 탄소원으로 배양할 경우 이러한 효소의 활성은 매우 낮거나 무시할 수 있을 정도입니다. 표 3은 나프탈렌 및 그 유도체의 대사에 관여하는 다양한 효소(산소화효소, 가수분해효소, 탈수소효소, 산화효소 등)를 요약한 것입니다.
표 3. 나프탈렌 및 그 유도체의 분해를 담당하는 효소의 생화학적 특성.
방사성 동위원소 연구(¹⁸O₂)에 따르면, 산소화효소에 의한 방향족 고리에 분자 산소(O₂)의 결합은 화합물의 추가적인 생분해를 활성화하는 데 가장 중요한 단계입니다(Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). 분자 산소(O₂)로부터 기질에 산소 원자(O) 하나가 결합하는 과정은 내인성 또는 외인성 모노옥시게나제(수산화효소라고도 함)에 의해 시작됩니다. 다른 산소 원자 하나는 물로 환원됩니다. 외인성 모노옥시게나제는 NADH 또는 NADPH를 이용하여 플라빈을 환원시키는 반면, 내인성 모노옥시게나제에서는 기질이 플라빈을 환원시킵니다. 수산화 위치에 따라 생성물이 다양하게 나타납니다. 예를 들어, 살리실산 1-수산화효소는 살리실산의 C1 위치를 수산화하여 카테콜을 생성합니다. 반면에, 다성분 살리실산 5-수산화효소(환원효소, 페레독신 및 산소화효소 소단위를 포함)는 살리실산의 C5 위치에서 수산화 반응을 일으켜 겐티신산을 형성한다(Yamamoto et al., 1965).
산소화효소는 기질에 두 개의 O2 원자를 결합시킵니다. 생성되는 생성물에 따라 고리 수산화 산소화효소와 고리 절단 산소화효소로 나뉩니다. 고리 수산화 산소화효소는 방향족 기질을 시스-디하이드로디올(예: 나프탈렌)로 전환시키며, 세균에 널리 분포합니다. 현재까지 고리 수산화 산소화효소를 가진 미생물은 다양한 방향족 탄소원을 이용하여 생장할 수 있음이 밝혀졌으며, 이러한 효소는 NDO(나프탈렌), 톨루엔 산소화효소(TDO, 톨루엔), 비페닐 산소화효소(BPDO, 비페닐)로 분류됩니다. NDO와 BPDO는 모두 다양한 다환 방향족 탄화수소(톨루엔, 니트로톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 비페닐, 플루오렌, 인돌, 메틸나프탈렌, 나프탈렌설포네이트, 페난트렌, 안트라센, 아세토페논 등)의 이중 산화 및 측쇄 수산화 반응을 촉매할 수 있다(Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO는 산화환원효소, 페레독신, 그리고 활성 부위를 포함하는 산소화효소 성분으로 구성된 다성분계이다(Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). NDO의 촉매 단위는 큰 α 소단위와 작은 β 소단위가 α3β3 구조로 배열되어 있다. NDO는 산소화효소의 큰 계열에 속하며, 그 α-소단위에는 리스케 부위[2Fe-2S]와 단핵 비헴철이 포함되어 있어 NDO의 기질 특이성을 결정합니다(Parales et al., 1998). 일반적으로 하나의 촉매 주기에서 피리딘 뉴클레오티드의 환원으로부터 생성된 두 개의 전자가 환원효소, 페레독신 및 리스케 부위를 거쳐 활성 부위의 Fe(II) 이온으로 전달됩니다. 이 환원 등가물은 분자 산소를 활성화시키는데, 이는 기질의 디하이드록실화에 필수적인 조건입니다(Ferraro et al., 2005). 현재까지 다양한 균주에서 분리 및 자세히 특성화된 NDO는 소수에 불과하며, 나프탈렌 분해에 관련된 경로의 유전적 조절에 대한 연구가 상세히 진행되었습니다(Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). 고리 절단 이산소화효소(엔도 또는 오르토 고리 절단 효소 및 엑소디올 또는 메타 고리 절단 효소)는 수산화된 방향족 화합물에 작용합니다. 예를 들어, 오르토 고리 절단 이산소화효소는 카테콜-1,2-이산소화효소이고, 메타 고리 절단 이산소화효소는 카테콜-2,3-이산소화효소입니다(Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). 다양한 산소화효소 외에도, NAD+/NADP+를 전자 수용체로 사용하여 방향족 디히드로디올, 알코올 및 알데히드의 탈수소화를 담당하는 다양한 탈수소효소가 있으며, 이들은 대사에 관여하는 중요한 효소 중 일부입니다(Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
가수분해효소(에스테라제, 아미다제)와 같은 효소는 물을 이용하여 공유 결합을 분해하고 넓은 기질 특이성을 나타내는 두 번째 중요한 효소 부류입니다. 카바릴 가수분해효소를 비롯한 여러 가수분해효소는 그람 음성 세균의 세포막 주변 공간(periplasm)에 존재하는 것으로 알려져 있습니다(Kamini et al., 2018). 카바릴은 아미드 결합과 에스테르 결합을 모두 가지고 있으므로 에스테라제 또는 아미다제에 의해 가수분해되어 1-나프톨을 생성할 수 있습니다. Rhizobium rhizobium AC10023 균주와 Arthrobacter RC100 균주의 카바릴은 각각 에스테라제와 아미다제로 작용하는 것으로 보고되었습니다. 특히 Arthrobacter RC100 균주의 카바릴은 아미다제로도 작용합니다. RC100은 카바릴, 메토밀, 메페나믹산 및 XMC와 같은 4가지 N-메틸카바메이트 계열 살충제를 가수분해하는 것으로 나타났습니다(Hayaatsu et al., 2001). Pseudomonas sp. C5pp의 CH는 카바릴(100% 활성)과 1-나프틸아세테이트(36% 활성)에 작용하지만 1-나프틸아세트아미드에는 작용하지 않는 것으로 보고되어 에스테라제임을 시사합니다(Trivedi et al., 2016).
생화학적 연구, 효소 조절 패턴 및 유전 분석을 통해 나프탈렌 분해 유전자는 두 개의 유도성 조절 단위 또는 "오페론"으로 구성되어 있음이 밝혀졌습니다. 하나는 nah(나프탈렌을 살리실산으로 전환하는 "상류 경로")이고, 다른 하나는 sal(살리실산을 카테콜을 거쳐 중심 탄소 경로로 전환하는 "하류 경로")입니다. 살리실산과 그 유사체는 유도체로 작용할 수 있습니다(Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). 포도당이나 유기산이 존재할 경우, 이 오페론은 억제됩니다. 그림 5는 나프탈렌 분해의 전체 유전적 구조(오페론 형태)를 보여줍니다. nah 유전자의 여러 변이형/형태(ndo/pah/dox)가 보고되었으며, 모든 Pseudomonas 종에서 높은 서열 상동성(90%)을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다(Abbasian et al., 2016). 나프탈렌 상류 경로의 유전자들은 일반적으로 그림 5A에 나타낸 바와 같이 공통된 순서로 배열되어 있습니다. 또 다른 유전자 nahQ는 나프탈렌 대사에 관여하는 것으로 보고되었으며, 일반적으로 nahC와 nahE 사이에 위치하지만, 그 실제 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 마찬가지로, 나프탈렌에 민감한 화학주성을 담당하는 nahY 유전자는 일부 종에서 nah 오페론의 말단에 위치한 것으로 확인되었다. Ralstonia sp.에서는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(gsh)를 코딩하는 U2 유전자가 nahAa와 nahAb 사이에 위치하지만 나프탈렌 이용 특성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Zylstra et al., 1997).
그림 5. 나프탈렌 분해 과정에서 관찰된 세균 종들의 유전적 구성 및 다양성; (A) 상부 나프탈렌 경로: 나프탈렌이 살리실산으로 대사되는 과정; (B) 하부 나프탈렌 경로: 살리실산이 카테콜을 거쳐 중심 탄소 경로로 이동하는 과정; (C) 살리실산이 젠티세이트를 거쳐 중심 탄소 경로로 이동하는 과정.
“하위 경로”(sal 오페론)는 일반적으로 nahGTHINLMOKJ로 구성되며 카테콜 메타링 분해 경로를 통해 살리실산을 피루브산과 아세트알데히드로 전환합니다. 살리실산 수산화효소를 암호화하는 nahG 유전자는 오페론의 근위 말단에 보존되어 있는 것으로 확인되었습니다(그림 5B). 다른 나프탈렌 분해 균주와 비교했을 때, P. putida CSV86에서는 nah 및 sal 오페론이 직렬로 연결되어 있으며 매우 밀접하게 관련되어 있습니다(약 7.5kb). Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 및 P. putida AK5와 같은 일부 그람 음성 세균에서는 나프탈렌이 젠티산 경로(sgp/nag 오페론 형태)를 통해 중심 탄소 대사산물로 대사됩니다. 유전자 카세트는 일반적으로 nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI 형태로 표현되며, nagR(LysR형 조절자를 인코딩함)은 상단에 위치합니다(그림 5C).
카바릴은 1-나프톨, 1,2-디히드록시나프탈렌, 살리실산 및 겐티신산의 대사를 통해 중심 탄소 순환에 들어갑니다(그림 3). 유전학적 및 대사적 연구를 바탕으로 이 경로를 "상류"(카바릴이 살리실산으로 전환되는 단계), "중간"(살리실산이 겐티신산으로 전환되는 단계) 및 "하류"(겐티신산이 중심 탄소 순환 경로 중간체로 전환되는 단계)로 나누는 것이 제안되었습니다(Singh et al., 2013). C5pp(슈퍼컨티그 A, 76.3kb)의 게놈 분석 결과, mcbACBDEF 유전자는 카바릴을 살리실산으로 전환하는 데 관여하고, 이어서 mcbIJKL은 살리실산을 겐티신산으로 전환하는 데 관여하며, mcbOQP는 겐티신산을 중심 탄소 중간체(푸마르산 및 피루브산, Trivedi et al., 2016)로 전환하는 데 관여하는 것으로 나타났다(그림 6).
방향족 탄화수소(나프탈렌 및 살리실산 포함) 분해에 관여하는 효소는 해당 화합물에 의해 유도되고 포도당이나 유기산과 같은 단순 탄소원에 의해 억제될 수 있다고 보고되었습니다(Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). 나프탈렌 및 그 유도체의 다양한 대사 경로 중 나프탈렌과 카바릴의 조절 특성은 어느 정도 연구되어 왔습니다. 나프탈렌의 경우, 상류 및 하류 경로의 유전자들은 LysR형 전사 조절인자인 NahR에 의해 조절됩니다. NahR은 살리실산에 의한 nah 유전자 유도 및 그에 따른 고수준 발현에 필수적입니다(Yen and Gunsalus, 1982). 또한, 연구에 따르면 통합 숙주 인자(IHF)와 XylR(시그마 54 의존성 전사 조절자) 역시 나프탈렌 대사 관련 유전자의 전사 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다(Ramos et al., 1997). 카테콜 메타 고리 개방 경로 효소, 즉 카테콜 2,3-디옥시게나아제는 나프탈렌 및/또는 살리실산 존재 하에서 유도되는 것으로 밝혀졌습니다(Basu et al., 2006). 또한, 카테콜 오르토 고리 개방 경로 효소, 즉 카테콜 1,2-디옥시게나아제는 벤조산 및 시스,시스-무콘산 존재 하에서 유도되는 것으로 나타났습니다(Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
C5pp 균주에서 mcbG, mcbH, mcbN, mcbR, mcbS의 다섯 유전자는 카바릴 분해를 조절하는 LysR/TetR 계열의 전사 조절인자를 암호화합니다. 상동 유전자 mcbG는 Burkholderia RP00725에서 페난트렌 대사에 관여하는 LysR형 조절인자 PhnS(아미노산 서열 일치율 58%)와 가장 유사한 것으로 밝혀졌습니다(Trivedi et al., 2016). mcbH 유전자는 중간 경로(살리실산이 겐티신산으로 전환되는 경로)에 관여하며, Pseudomonas와 Burkholderia에서 발견되는 LysR형 전사 조절인자 NagR/DntR/NahR 계열에 속합니다. 이 계열의 구성원들은 살리실산을 분해 유전자 발현 유도를 위한 특이적 효과 분자로 인식하는 것으로 보고되었습니다. 한편, LysR 및 TetR 유형의 전사 조절자에 속하는 mcbN, mcbR 및 mcbS의 세 가지 유전자가 하위 경로(젠티세이트-중앙 탄소 경로 대사산물)에서 확인되었습니다.
원핵생물에서 플라스미드, 트랜스포손, 프로파지, 게놈 아일랜드 및 통합 접합 요소(ICE)를 통한 수평적 유전자 전달 과정(획득, 교환 또는 전달)은 세균 게놈의 가소성의 주요 원인이며, 특정 기능/형질의 획득 또는 소실로 이어집니다. 이는 세균이 다양한 환경 조건에 빠르게 적응할 수 있도록 하며, 방향족 화합물 분해와 같은 숙주에게 잠재적인 적응적 대사적 이점을 제공합니다. 대사 변화는 종종 분해 오페론, 조절 메커니즘 및 효소 특이성의 미세 조정을 통해 이루어지며, 이는 더 넓은 범위의 방향족 화합물 분해를 촉진합니다(Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). 나프탈렌 분해 유전자 카세트는 플라스미드(접합성 및 비접합성), 트랜스포손, 게놈, ICE 및 다양한 세균 종의 조합과 같은 다양한 이동성 요소에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 5). Pseudomonas G7에서 플라스미드 NAH7의 nah 및 sal 오페론은 동일한 방향으로 전사되며, 이동에 트랜스포사제 Tn4653이 필요한 결함 있는 트랜스포존의 일부입니다(Sota et al., 2006). Pseudomonas NCIB9816-4 균주에서는 이 유전자가 접합 플라스미드 pDTG1에서 약 15kb 떨어진 두 개의 오페론으로 발견되었으며, 이들은 서로 반대 방향으로 전사되었습니다(Dennis and Zylstra, 2004). Pseudomonas putida AK5 균주에서는 비접합 플라스미드 pAK5가 젠티세이트 경로를 통해 나프탈렌 분해를 담당하는 효소를 암호화합니다(Izmalkova et al., 2013). Pseudomonas PMD-1 균주에서는 nah 오페론이 염색체에 위치하고, sal 오페론은 접합 플라스미드 pMWD-1에 위치한다(Zuniga et al., 1981). 그러나 Pseudomonas stutzeri AN10에서는 모든 나프탈렌 분해 유전자(nah 및 sal 오페론)가 염색체에 위치하며, 전이, 재조합 및 재배열 과정을 통해 도입된 것으로 추정된다(Bosch et al., 2000). Pseudomonas sp. CSV86에서는 nah 및 sal 오페론이 ICE(ICECSV86) 형태로 게놈에 존재한다. 이 구조는 tRNAGly와 재조합/부착 부위(attR 및 attL)를 나타내는 직접 반복 서열, 그리고 tRNAGly의 양쪽 끝에 위치한 파지 유사 인테그라제에 의해 보호되며, 따라서 ICEclc 요소(Pseudomonas knackmusii의 클로로카테콜 분해 ICEclcB13)와 구조적으로 유사합니다. ICE 상의 유전자는 극히 낮은 전달 빈도(10⁻⁸)로 접합을 통해 전달될 수 있으며, 이를 통해 분해 특성이 수용체로 전달된다고 보고되었습니다(Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
카바릴 분해에 관여하는 유전자 대부분은 플라스미드에 위치한다. Arthrobacter sp. RC100은 세 개의 플라스미드(pRC1, pRC2, pRC300)를 가지고 있는데, 이 중 접합성 플라스미드인 pRC1과 pRC2는 카바릴을 젠티세이트로 전환하는 효소를 암호화한다. 반면, 젠티세이트를 중심 탄소 대사산물로 전환하는 데 관여하는 효소는 염색체에 위치한다(Hayaatsu et al., 1999). 리조비움(Rhizobium) 속의 AC100 균주는 카바릴을 1-나프톨로 전환하는 데 사용되었는데, 이 균주는 삽입 요소 유사 서열(istA 및 istB)로 둘러싸인 Tnceh 전이인자의 일부로 CH를 암호화하는 cehA 유전자를 포함하는 플라스미드 pAC200을 가지고 있다(Hashimoto et al., 2002). 스핑고모나스(Sphingomonas) 균주 CF06에서 카바릴 분해 유전자는 pCF01, pCF02, pCF03, pCF04, pCF05의 다섯 개의 플라스미드에 존재하는 것으로 추정된다. 이들 플라스미드의 DNA 상동성이 높다는 것은 유전자 복제 사건이 발생했음을 시사한다(Feng et al., 1997). 두 종의 슈도모나스(Pseudomonas)로 구성된 카바릴 분해 공생체에서, 균주 50581은 mcd 카바릴 가수분해효소 유전자를 암호화하는 접합 플라스미드 pCD1(50kb)을 포함하고 있으며, 균주 50552의 접합 플라스미드는 1-나프톨 분해효소를 암호화한다(Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). 아크로모박터(Achromobacter) 균주 WM111에서, mcd 푸라단 가수분해효소 유전자는 100kb 플라스미드(pPDL11)에 위치한다. 이 유전자는 서로 다른 지리적 지역의 다양한 박테리아에서 서로 다른 플라스미드(100, 105, 115 또는 124kb)에 존재하는 것으로 나타났습니다(Parekh et al., 1995). Pseudomonas sp. C5pp에서는 카바릴 분해에 관여하는 모든 유전자가 76.3kb의 염기서열에 걸쳐 있는 게놈 내에 위치합니다(Trivedi et al., 2016). 게놈 분석(6.15Mb) 결과 42개의 이동성 유전 요소(MGE)와 36개의 유전자 삽입체(GEI)가 존재하며, 이 중 17개의 MGE는 평균 비대칭 G+C 함량(54~60mol%)을 갖는 슈퍼컨티그 A(76.3kb)에 위치하여 수평적 유전자 전달 가능성을 시사합니다(Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1은 카바릴 분해 유전자의 유사한 배열을 나타내지만, 이 유전자들은 플라스미드에 위치하고 있다(Zhu et al., 2019).
미생물은 생화학적 및 유전체 수준에서의 대사 효율 외에도 화학주성, 세포 표면 변형 특성, 구획화, 우선적 이용, 생물계면활성제 생산 등과 같은 다른 특성이나 반응을 나타내며, 이는 오염된 환경에서 방향족 오염 물질을 보다 효율적으로 대사하는 데 도움이 됩니다(그림 7).
그림 7. 외래 오염물질의 효율적인 생분해를 위한 이상적인 방향족 탄화수소 분해 박테리아의 다양한 세포 반응 전략.
화학주성 반응은 불균일하게 오염된 생태계에서 유기 오염물질의 분해를 촉진하는 요인으로 여겨집니다. (2002) 연구에서는 Pseudomonas sp. G7의 나프탈렌에 대한 화학주성이 수생 시스템에서 나프탈렌 분해 속도를 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 야생형 G7 균주는 화학주성 결핍 돌연변이 균주보다 나프탈렌을 훨씬 빠르게 분해했습니다. NahY 단백질(막 구조를 가진 538개의 아미노산)은 NAH7 플라스미드에서 메타분해 경로 유전자와 함께 전사되는 것으로 밝혀졌으며, 화학주성 신호전달체와 마찬가지로 이 단백질은 나프탈렌 분해에 대한 화학수용체 역할을 하는 것으로 보입니다(Grimm and Harwood 1997). Hansel et al. (2009)의 또 다른 연구에서는 이 단백질이 화학주성을 가지지만 분해 속도가 빠르다는 것을 보여주었습니다. (2011)은 슈도모나스(P. putida)가 기체 나프탈렌에 대해 화학주성 반응을 보인다는 것을 입증했는데, 기체상 확산으로 인해 세포로 나프탈렌이 꾸준히 유입되어 세포의 화학주성 반응을 조절한다는 것입니다. 연구자들은 이러한 화학주성 행동을 이용하여 분해 속도를 향상시키는 미생물을 개발했습니다. 연구에 따르면 화학감각 경로는 세포 분열, 세포 주기 조절, 바이오필름 형성 등 다른 세포 기능도 조절하여 분해 속도를 제어하는 ​​데 도움을 줍니다. 그러나 이러한 특성(화학주성)을 효율적인 분해에 활용하는 데에는 몇 가지 어려움이 있습니다. 주요 장애물은 다음과 같습니다. (a) 서로 다른 상동 수용체가 동일한 화합물/리간드를 인식하는 경우; (b) 대체 수용체, 즉 에너지 친화성이 존재하는 경우; (c) 동일한 수용체 계열의 감각 도메인에 상당한 서열 차이가 있는 경우. (d) 주요 세균 센서 단백질에 대한 정보 부족(Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). 때때로 방향족 탄화수소의 생분해는 여러 대사산물/중간체를 생성하는데, 이는 특정 세균 집단에는 화학주성 물질로 작용하지만 다른 집단에는 반발 물질로 작용하여 과정을 더욱 복잡하게 만든다. 리간드(방향족 탄화수소)와 화학 수용체 간의 상호작용을 규명하기 위해, 우리는 방향족 산, TCA 회로 중간체, 나프탈렌 수용체를 각각 표적으로 하는 Pseudomonas putida와 Escherichia coli의 센서 및 신호 전달 도메인을 융합하여 하이브리드 센서 단백질(PcaY, McfR, NahY)을 제작하였다(Luu et al., 2019).
나프탈렌 및 기타 다환 방향족 탄화수소(PAH)의 영향으로 세균막 구조와 미생물의 완전성은 상당한 변화를 겪습니다. 연구에 따르면 나프탈렌은 소수성 상호작용을 통해 아실 사슬의 상호작용을 방해하여 막의 팽창과 유동성을 증가시킵니다(Sikkema et al., 1995). 이러한 유해한 영향에 대응하기 위해 세균은 이소/안테이소 분지 사슬 지방산의 비율과 지방산 조성을 변화시키고 시스 불포화 지방산을 해당 트랜스 이성체로 이성질화함으로써 막 유동성을 조절합니다(Heipieper and de Bont, 1994). 나프탈렌 처리 조건에서 배양된 Pseudomonas stutzeri에서는 포화지방산 대 불포화지방산 비율이 1.1에서 2.1로 증가했으며, Pseudomonas JS150에서는 이 비율이 7.5에서 12.0으로 증가했습니다(Mrozik et al., 2004). 나프탈렌을 기질로 사용했을 때, 아크로모박터 KAs 3-5 세포는 나프탈렌 결정 주변에 세포 응집 현상을 보였고, 세포 표면 전하가 -22.5mV에서 -2.5mV로 감소했으며, 세포질 응축 및 액포 형성이 동반되어 세포 구조 및 세포 표면 특성의 변화를 나타냈다(Mohapatra et al., 2019). 세포/표면 변화는 방향족 오염물질의 흡수율 향상과 직접적으로 관련되지만, 관련 생명공학적 전략은 아직 충분히 최적화되지 않았다. 세포 형태 조작은 생물학적 과정 최적화에 거의 사용되지 않았다(Volke and Nikel, 2018). 세포 분열에 영향을 미치는 유전자를 삭제하면 세포 형태가 변화한다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 세포 격막 단백질 SepF는 격막 형성에 관여하고 세포 분열의 후속 단계에 필요하지만 필수 유전자는 아니다. 바실러스 서브틸리스에서 펩타이드 글리칸 가수분해효소를 암호화하는 유전자를 삭제하면 세포 길이가 길어지고, 특정 성장 속도가 증가하며, 효소 생산 능력이 향상됩니다(Cui et al., 2018).
슈도모나스 C5pp 및 C7 균주의 효율적인 분해를 위해서는 카바릴 분해 경로의 구획화가 제안되었습니다(Kamini et al., 2018). 카바릴은 외막 격막 및/또는 확산성 포린을 통해 세포질막과 외막 사이 공간(페리플라즘)으로 수송되는 것으로 추정됩니다. CH는 페리플라즘에 존재하는 효소로, 카바릴을 1-나프톨로 가수분해하는 반응을 촉매합니다. 1-나프톨은 카바릴보다 안정적이고 소수성이 강하며 독성이 더 높습니다. CH는 페리플라즘에 존재하며 카바릴에 대한 친화도가 낮아 1-나프톨 생성을 조절함으로써 세포 내 축적을 방지하고 세포 독성을 감소시킵니다(Kamini et al., 2018). 생성된 1-나프톨은 분할 및/또는 확산을 통해 내막을 가로질러 세포질로 운반된 후, 고친화성 효소인 1NH에 의해 1,2-디히드록시나프탈렌으로 수산화되어 중심 탄소 경로에서 추가적인 대사 과정을 거친다.
미생물은 외래 탄소원을 분해할 수 있는 유전적 및 대사적 능력을 가지고 있지만, 탄소원 이용의 계층적 구조(즉, 복합 탄소원보다 단순 탄소원을 우선적으로 이용)는 생분해에 있어 주요 장애물입니다. 단순 탄소원의 존재 및 이용은 PAH와 같은 복합/비선호 탄소원을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 억제합니다. 잘 알려진 예로, 대장균(Escherichia coli)에 포도당과 유당을 함께 공급했을 때 포도당이 유당보다 더 효율적으로 이용됩니다(Jacob and Monod, 1965). 슈도모나스(Pseudomonas)는 다양한 PAH와 외래 화합물을 탄소원으로 분해하는 것으로 보고되었습니다. 슈도모나스의 탄소원 이용 계층은 유기산 > 포도당 > 방향족 화합물입니다(Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). 그러나 예외가 있습니다. 흥미롭게도, Pseudomonas sp. CSV86은 포도당보다 방향족 탄화수소(벤조산, 나프탈렌 등)를 우선적으로 이용하고 유기산과 함께 방향족 탄화수소를 공대사하는 독특한 계층 구조를 나타낸다(Basu et al., 2006). 이 세균에서는 포도당이나 유기산과 같은 다른 탄소원이 존재하더라도 방향족 탄화수소의 분해 및 수송 관련 유전자의 발현이 억제되지 않는다. 포도당과 방향족 탄화수소가 함께 존재하는 배지에서 배양했을 때, 포도당 수송 및 대사 관련 유전자의 발현이 억제되고, 대수 성장기 초기에 방향족 탄화수소가 이용되며, 대수 성장기 중기에는 포도당이 이용되는 것이 관찰되었다(Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). 반면, 유기산의 존재는 방향족 탄화수소 대사 발현에 영향을 미치지 않으므로, 이 세균은 생분해 연구에 적합한 후보 균주로 기대된다(Phale et al., 2020).
탄화수소 생물변환은 미생물에서 산화 스트레스를 유발하고 항산화 효소의 발현을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있습니다. 정지기 세포에서나 독성 화합물이 존재하는 환경에서 나프탈렌의 비효율적인 생분해는 활성산소종(ROS)의 생성을 초래합니다(Kang et al., 2006). 나프탈렌 분해 효소는 철-황 클러스터를 포함하고 있기 때문에, 산화 스트레스 하에서 헴과 철-황 단백질의 철이 산화되어 단백질 불활성화를 유발합니다. 페레독신-NADP+ 환원효소(Fpr)는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 함께 NADP+/NADPH와 두 분자의 페레독신 또는 플라보독신 사이의 가역적인 산화환원 반응을 매개하여 ROS를 제거하고 산화 스트레스 하에서 철-황 중심을 복원합니다(Li et al., 2006). 슈도모나스(Pseudomonas)에서 Fpr과 SodA(SOD)는 산화 스트레스에 의해 유도될 수 있으며, 나프탈렌이 첨가된 조건에서 성장하는 네 가지 슈도모나스 균주(O1, W1, As1, G1)에서 SOD와 카탈라아제 활성이 증가하는 것이 관찰되었다는 보고가 있다(Kang et al., 2006). 아스코르브산이나 2가 철(Fe2+)과 같은 항산화제를 첨가하면 나프탈렌에 의한 성장 속도가 증가한다는 연구 결과도 있다. 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)가 나프탈렌 배지에서 성장할 때, sodA(Fe/Mn superoxide dismutase), sodC(Cu/Zn superoxide dismutase), recA를 포함한 산화 스트레스 관련 시토크롬 P450 유전자의 전사량이 증가했다(Sazykin et al., 2019). 나프탈렌에서 배양한 슈도모나스 세포에 대한 비교 정량 단백질체 분석 결과, 산화 스트레스 반응과 관련된 다양한 단백질의 상향 조절이 스트레스 대처 전략이라는 것이 밝혀졌다(Herbst et al., 2013).
미생물은 소수성 탄소원의 작용으로 생물계면활성제를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 계면활성제는 친수성, 양수성, 양친매성 특성을 지닌 표면 활성 화합물로, 기름-물 또는 공기-물 계면에서 응집체를 형성할 수 있습니다. 이는 유사 용해를 촉진하고 방향족 탄화수소의 흡착을 용이하게 하여 효율적인 생분해를 유도합니다(Rahman et al., 2002). 이러한 특성 때문에 생물계면활성제는 다양한 산업 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 화학 계면활성제 또는 생물계면활성제를 세균 배양액에 첨가하면 탄화수소 분해 효율과 속도를 향상시킬 수 있습니다. 생물계면활성제 중에서도 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)이 생산하는 람노리피드는 광범위하게 연구되고 특성이 규명되었습니다(Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). 또한, 다른 유형의 생물계면활성제로는 리포펩타이드(슈도모나스 플루오레센스 유래 뮤신), 유화제 378(슈도모나스 플루오레센스 유래)(Rosenberg and Ron, 1999), 로도코커스 유래 트레할로스 이당류 지질(Ramdahl, 1985), 바실러스 유래 리케닌(Saraswathy and Hallberg, 2002), 바실러스 서브틸리스 유래 계면활성제(Siegmund and Wagner, 1991) 및 바실러스 아밀로리크레파시엔스 유래 계면활성제(Zhi et al., 2017) 등이 있습니다. 이러한 강력한 계면활성제는 표면 장력을 72 dynes/cm에서 30 dynes/cm 미만으로 감소시켜 탄화수소 흡착을 향상시키는 것으로 나타났습니다. Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia 및 기타 세균 종들이 나프탈렌 및 메틸나프탈렌 배지에서 배양될 때 다양한 람노리피드 및 글리코리피드 기반 생물계면활성제를 생산할 수 있다는 보고가 있다(Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89는 나프토산과 같은 방향족 화합물을 배지로 사용하여 배양될 때 세포외 생물계면활성제인 Biosur-Pm을 생산할 수 있다(Phale et al., 1995). Biosur-Pm 생성 속도 연구 결과, 그 합성은 성장 및 pH에 의존하는 과정인 것으로 나타났다. 중성 pH에서 배양된 세포가 생산하는 Biosur-Pm의 양은 pH 8.5에서 배양된 세포보다 더 많았으며, pH 8.5에서 배양된 세포는 pH 7.0에서 배양된 세포보다 소수성이 더 강하고 방향족 및 지방족 화합물에 대한 친화도가 더 높았다. Rhodococcus spp.의 경우에도 마찬가지였다. N6, 높은 탄소 대 질소(C:N) 비율, 그리고 철 제한은 세포외 생물계면활성제 생산에 최적의 조건이다(Mutalik et al., 2008). 균주 및 발효 최적화를 통해 생물계면활성제(서팩틴)의 생합성을 향상시키려는 시도가 이루어졌지만, 배양액 내 계면활성제 농도가 낮아(1.0 g/L) 대규모 생산에 어려움이 있다(Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). 따라서 유전 공학적 방법을 이용하여 생합성을 개선하려는 노력이 진행되어 왔다. 그러나 오페론의 크기가 크고(약 25 kb) 쿼럼 센싱 시스템의 생합성 조절이 복잡하기 때문에 유전 공학적 변형이 어렵다(Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). 바실러스 박테리아에서는 주로 프로모터(srfA 오페론)를 교체하거나, 서팩틴 수출 단백질 YerP 및 조절 인자 ComX와 PhrC를 과발현시켜 서팩틴 생산량을 증가시키는 등 다양한 유전자 공학적 변형이 수행되었다(Jiao et al., 2017). 그러나 이러한 유전자 공학적 방법들은 한두 가지 유전자 변형만을 달성했을 뿐, 아직 상업적 생산 단계에는 이르지 못했다. 따라서 지식 기반 최적화 방법에 대한 추가 연구가 필요하다.
다환방향족탄화수소(PAH) 생분해 연구는 주로 표준 실험실 조건에서 수행됩니다. 그러나 오염된 부지나 환경에서는 온도, pH, 산소, 영양분 가용성, 기질 생체이용률, 기타 외래물질, 최종 생성물 저해 등 다양한 비생물적 및 생물적 요인이 미생물의 분해 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
온도는 PAH 생분해에 상당한 영향을 미칩니다. 온도가 상승하면 용존 산소 농도가 감소하는데, 이는 호기성 미생물의 대사에 영향을 미칩니다. 호기성 미생물은 수산화 반응이나 고리 절단 반응을 수행하는 산소화효소의 기질 중 하나로 분자 산소를 필요로 하기 때문입니다. 고온은 PAH를 더욱 독성이 강한 화합물로 변환시켜 생분해를 저해하는 것으로 알려져 있습니다(Muller et al., 1998).
PAH로 오염된 많은 지역은 산성 광산 배수 오염 지역(pH 1~4)이나 알칼리성 침출수로 오염된 천연가스/석탄 가스화 지역(pH 8~12)과 같이 극단적인 pH 값을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 조건은 생분해 과정에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 생물정화를 위해 미생물을 사용하기 전에, 알칼리성 토양에는 황산암모늄이나 질산암모늄과 같이 산화환원전위가 중간에서 매우 낮은 적절한 화학물질을 첨가하여 pH를 조절하고, 산성 지역에는 탄산칼슘이나 탄산마그네슘을 첨가하여 석회화하는 것이 좋습니다(Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
오염 지역에 대한 산소 공급은 PAH 생분해의 속도 제한 요인입니다. 환경의 산화환원 조건으로 인해 현장 생물정화 공정은 일반적으로 외부 공급원(경작, 공기 주입, 화학물질 첨가)으로부터 산소를 공급해야 합니다(Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al.(1996)은 오염된 대수층에 과산화마그네슘(산소 방출 화합물)을 첨가하면 BTEX 화합물을 효과적으로 생물정화할 수 있음을 입증했습니다. 또 다른 연구에서는 질산나트륨을 주입하고 추출정을 건설하여 오염된 대수층에서 페놀과 BTEX의 현장 분해를 통해 효과적인 생물정화를 달성했습니다(Bewley and Webb, 2001).