현재 주소: 영국 옥스퍼드셔주 디에트코트, 하웰 과학혁신공원, 다이아몬드 빌딩, OX11 0DE, Diamond Light Source Co., Ltd., 전자생물영상센터.
반응 중심 광합성 복합체 1(RC-LH1)은 자주색 광합성 세균의 핵심 광합성 구성 요소입니다. 본 연구에서는 Rhodopseudomonas palustris 유래 RC-LH1 복합체의 두 가지 극저온 전자 현미경 구조를 제시합니다. 2.65Å 해상도의 RC-LH114-W 복합체 구조는 단백질 W에 의해 분리된 14개의 LH1 소단위 루프가 RC를 둘러싸고 있는 형태이며, 단백질 W가 없는 복합체는 16개의 LH1 소단위로 이루어진 닫힌 루프가 RC에 둘러싸인 완전한 RC 구성 구조를 나타냅니다. 이 두 구조의 비교를 통해 RC-LH1 복합체 내 퀴논의 동역학, 특히 RC QB 부위에 퀴논이 결합할 때 발생하는 이전에 알려지지 않았던 구조적 변화와 퀴논을 RC로 전달하는 데 도움을 주는 보조 퀴논 결합 부위의 위치를 ​​파악할 수 있었습니다. W 단백질의 독특한 구조는 LH1 루프의 폐쇄를 방지하여 퀴논/퀴놀론 교환 속도를 높이는 통로를 만듭니다.
광합성이 제공하는 에너지는 지구상의 거의 모든 생명체를 유지할 수 있으며, 태양 에너지 생명공학에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 자색 광합성 세균은 지구 전체의 광합성을 촉진하는 동시에 다양한 에너지 모드와 대사 능력을 보여줍니다. 이들은 광합성을 거치지 않고 암흑 환경에서 종속영양 세균으로 생장할 수 있으며, 질소와 이산화탄소를 고정하고, 수소를 생산하며, 방향족 화합물을 분해할 수 있습니다(1-3). 이러한 과정에 필요한 에너지를 공급하기 위해서는 빛이 빠르고 효율적으로 화학 에너지로 전환되어야 합니다. 이 과정은 광 포획 안테나 복합체가 빛을 흡수하고 포획된 에너지를 반응 중심(RC)으로 전달하여 전하 분리를 시작함으로써 시작됩니다(4-7). 자색 광합성 세균의 광합성 기본 단위는 광수확 복합체 1(LH1)로 둘러싸인 2형 반응 중심(RC)으로 구성된 RC-LH1 코어 복합체입니다. LH1은 곡선형 αβ 이종이량체 배열로 이루어져 있으며, 각 이종이량체는 두 개의 세균 엽록소(BChl) α 분자와 하나 또는 두 개의 카로티노이드를 결합합니다(8-12). 가장 단순한 LH1 안테나는 폐쇄 루프에서 RC(9-13)를 둘러싸는 16개 또는 17개의 αβ 이종이량체로 구성되지만, 다른 핵심 복합체에서는 막횡단 펩타이드가 주변 LH1의 연속성을 차단하여 RC와 시토크롬 bc1 복합체 사이의 퀴놀/퀴논 확산을 촉진합니다(11, 13-15). 자주색 광합성 식물인 로도프세우도모나스(Rhodopseudomonas palustris)는 광합성을 뒷받침하는 에너지 및 전자 전달을 이해할 수 있는 모델 생물입니다. Rps. palustris RC-LH1 복합체의 첫 번째 결정 구조 모델은 15개의 이종이량체 LH1 루프로 둘러싸인 RC이며, 이 루프들은 "단백질 W"라고 불리는 알려지지 않은 단백질에 의해 차단됩니다(14). 단백질 W는 이후 RPA4402로 확인되었으며, 이는 세 개의 예측된 막횡단 나선(TMH)을 가진 특성이 규명되지 않은 10.5kDa 단백질입니다(16). 본 연구에서는 단백질 W를 코딩하는 rpa4402 유전자를 RC-L, M(pufL, pufM) 및 LH1α, β(pufA, pufB) 소단위를 코딩하는 유전자 명명법과 일관성을 유지하기 위해 pufW로 개명할 것을 제안합니다. 흥미롭게도 단백질 W는 RC-LH1의 약 10%에서만 발견되는데, 이는 Rps. palustris가 두 가지 다른 RC-LH1 복합체를 생성함을 시사합니다. 본 연구에서는 단백질 W와 14개의 αβ 이종이량체를 포함하는 복합체와 단백질 W가 없고 16개의 이종이량체로 이루어진 닫힌 LH1 루프를 포함하는 복합체, 이렇게 두 가지 핵심 복합체의 고해상도 극저온 전자현미경(cryo-EM) 구조를 보고합니다. 본 연구 결과는 Rps. palustris의 RC-LH1 복합체에 대한 이해에 획기적인 변화를 가져올 것입니다. 각 변이체의 균일한 집단을 분석하고, 각 펩타이드와 결합된 색소, 관련 지질 및 퀴논을 명확하게 구분할 수 있는 충분한 해상도를 확보했기 때문입니다. 이러한 구조들을 비교한 결과, 지금까지 다른 어떤 RC-LH1 복합체에서도 발견되지 않았던 세 개의 TMH 단백질-W가 퀴논/퀴놀론 교환을 촉진하는 퀴논 채널을 생성하는 것으로 나타났습니다. 여러 개의 보존된 지질 및 퀴논 결합 부위를 확인했으며, 퀴논과 RC가 결합한 후 발생하는 새로운 구조적 변화를 밝혀냈는데, 이는 산소가 공급되는 광합성 생물의 광합성계 II(PSII) RC에 적합할 수 있습니다. 본 연구 결과는 자색 광합성 세균의 RC-LH1 핵심 복합체에서 퀴논/퀴놀론 결합 및 교환의 동역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
Rps. palustris에서 발견되는 두 복합체에 대한 상세한 연구를 용이하게 하기 위해, 우리는 생화학적 방법을 이용하여 각 RC-LH1을 분리했습니다. 단백질 W 결핍 복합체(이하 ΔpufW)는 pufW 유전자가 결핍된 균주(16)에서 정제되었으며, 하나의 RC-LH1 복합체만 생성될 수 있습니다. 단백질 W 함유 복합체는 다른 균주에서 생성됩니다. 이 균주의 단백질 W는 C-말단에 10x His 태그로 변형되어 있어, 단백질 W 함유 복합체가 금속 고정화를 통해 대부분의 단백질 W 결핍 복합체와 효과적으로 결합될 수 있습니다. 이 복합체는 친화 크로마토그래피(IMAC)를 통해 효과적으로 분리됩니다(16).
그림 1에서 볼 수 있듯이, 두 복합체 모두 LH1 안테나로 둘러싸인 3개의 소단위체 RC(RC-L, RC-M 및 RC-H)를 포함한다. 단백질-W가 없는 복합체의 2.80Å 구조는 16개의 αβ 이종이량체가 RC를 완전히 둘러싸는 폐쇄형 LH1 루프를 형성하는 것을 보여주며, 이를 RC-LH116 복합체라고 한다. 단백질-W를 포함하는 복합체의 2.65Å 구조는 단백질-W에 의해 끊어진 14개의 이종이량체 LH1을 가지고 있으며, 이를 RC-LH114-W라고 한다.
(A 및 B) 화합물의 표면 표현. (C 및 D) 막대 모양으로 표현된 결합 색소. (E 및 F) 세포질 표면에서 관찰된 복합체는 카툰으로 표현된 펩타이드와 LH1 소단위를 가지며, 단백질-W 간극에서 시계 방향으로 번호가 매겨져 있다[Rba 번호 매기기와 일치. sphaeroides 복합체(13)]. LH1-α의 경우 단백질 소단위의 색상은 노란색이고, LH1-β의 경우 단백질 소단위의 색상은 파란색이며, 단백질-W는 빨간색, RC-H는 청록색, RC-L은 주황색, RC-M은 자홍색이다. 보조 인자는 막대 모양으로 표현되며, 녹색은 BChl 및 BPh a 분자를, 보라색은 카로티노이드를, 노란색은 UQ10 분자를 나타낸다. (G 및 H) RC-LH114-W 복합체(G)와 RC-LH116 복합체(H)의 동일 영역에서 단백질-W 간극을 확대한 그림입니다. 보조인자는 공간 채움 형태로 표시되었으며, 킬레이트화된 퀴논은 파란색으로 표시되었습니다. (G)에서 단백질-W 간극은 파란색 점선으로, (H)에서 퀴논/퀴놀롤이 LH116 고리 위로 확산되는 작은 구멍은 검은색 점선으로 표시되어 있습니다.
그림 1(A 및 B)은 개방형 또는 폐쇄형 배열의 LH1αβ 헤테로다이머로 둘러싸인 RC를 보여줍니다. 각 헤테로다이머는 두 개의 BChl과 하나의 카로티노이드를 결합합니다(그림 1, C 및 D). 이전 연구에서는 Rps가 LH1 복합체임을 보여주었습니다. 스피룰리나 크산틴의 생합성 경로에서 이들 종은 다양한 카로티노이드를 포함하고 있습니다(17). 그러나 스피로피록산틴이 주요 카로티노이드이며 그 밀도가 만족스럽습니다. 따라서 우리는 모든 LH1 결합 부위에 스피록산틴을 모델링하기로 했습니다. 알파 및 베타 폴리펩타이드는 짧은 막 외측 영역을 가진 단일 TMH입니다(그림 1, A, B, E 및 F). C-말단의 17개 잔기의 밀도는 관찰되지 않았지만, 알파 폴리펩타이드는 두 복합체 모두에서 Met1부터 Ala46까지 절단되었습니다. β 폴리펩타이드는 RC-LH116에서 Gly4부터 Tyr52까지, RC-LH114-W에서는 Ser5부터 Tyr52까지 감소되었습니다. 3개 또는 4개의 N-말단 잔기나 13개의 C-말단 잔기의 밀도는 관찰되지 않았습니다(그림 S1). 야생형 균주에서 제조한 혼합 RC-LH1 복합체의 질량 분석 결과, 결손된 영역은 이들 펩타이드의 이종 절단으로 인한 것임을 보여주었습니다(그림 S1 및 S2). α-Met1의 N-말단 포르밀화도 관찰되었습니다(f). 분석 결과, α-펩타이드는 fMet1부터 Asp42/Ala46/Ala47/Ala50까지의 잔기로 구성되고, β-펩타이드는 Ser2부터 Ala53까지의 잔기로 구성되며, 이는 저온 전자현미경 밀도 지도와 잘 일치합니다.
α-His29와 β-His36의 배위 결합으로 BChl들이 서로 마주 보게 되며, 각 αβ 이종이량체는 이웃과 결합하여 RC를 중심으로 열린 루프(RC-LH114-W) 또는 닫힌 루프(RC-LH116)를 형성합니다. 이는 엑시톤 결합 색소 배열을 나타냅니다(그림 1, C 및 D). RC-LH114-W의 877 nm 밴드와 비교했을 때, RC-LH116의 880 nm 흡수 적색 편이는 3 nm입니다(그림 2A). 그러나 원형 이색성 스펙트럼은 거의 동일하여(그림 2B), 열린 루프와 닫힌 루프 사이에 분명한 차이가 있음에도 불구하고 BChl의 국소 환경은 매우 유사함을 나타냅니다. 이러한 흡수 적색 편이는 닫힌 루프에서의 열 운동 감소 및 안정성 증가(18, 19), 닫힌 루프로 인한 색소 결합 변화(20, 21), 또는 이 두 가지 효과의 조합(11)의 결과일 수 있습니다.
(A) 자외선/가시광선/근적외선 흡수 스펙트럼. 각 피크는 해당 색소로 표시되었으며 775 nm에서의 BPh 피크를 기준으로 정규화되었습니다. (B) 805 nm에서의 BChl 흡광도를 기준으로 정규화된 원형 이색성 스펙트럼. (C 및 D) RC-LH114-W 복합체(C)와 RC-LH116 복합체(D)의 시간 분해 흡수 스펙트럼에서 선택된 ΔA 스펙트럼. 비교를 용이하게 하기 위해 모든 스펙트럼은 0.2 ps에서의 ΔA를 -A로 정규화했습니다. (E) 다양한 농도의 UQ2 존재 하에서 조사 후 시토크롬 c2 산화 속도(원시 데이터는 그림 S8 참조). (F) 저강도, 중강도 또는 고강도 광(각각 10, 30 또는 300μMm⁻²s⁻¹) 하에서 배양된 세포에서 정제된 복합체의 단백질 W 및 RC-L 소단위체와 분리된 막의 비율. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역분석법을 이용하여 단백질 수준을 측정하였다(원시 데이터는 그림 S9 참조). 정제된 RC-LH114-W 복합체에 대한 상대적인 비율을 결정하였다. 복합체의 RC-L과 단백질-W의 화학량론적 비율은 1:1이다.
RC-LH114-W의 변형된 αβ14 루프의 1번 위치에 있는 BChl은(그림 1, A, C, E) RC-LH116의 해당 BChl보다 RC 1차 전자 공여체(P)에 6.8Å 더 가깝습니다(그림 1, B, D, F 및 그림 S3). 그러나 두 복합체의 과도 흡수 동역학을 분석한 결과, RC-LH114-W와 RC-LH116에서 LH1에서 RC로의 여기 에너지 전달 시간 상수는 각각 40±4ps와 44±3ps인 것으로 나타났습니다(그림 2, C, D, 그림 S4 및 표 S2). RC 내부의 전자 전달에도 유의미한 차이가 없습니다(그림 S5 및 관련 보충 자료). LH1과 RC-P 사이의 에너지 전달 시간이 유사한 이유는 두 LH1 루프에 있는 대부분의 BChl의 거리, 각도 및 위치 에너지가 비슷하기 때문인 것으로 추측됩니다. 최소 거리에 도달하기 위해 LH1 에너지 패턴을 탐색하는 것이 차선 위치에서 RC로 직접 에너지를 전달하는 것보다 빠르지 않은 것으로 보입니다. RC-LH114-W의 개방형 LH1 루프는 구조 분석을 위한 저온 조건에서 미미한 열 운동을 겪을 수 있으며, RC 1 위치에서 βBChl의 색소 침착 거리로부터 상온에서 더 긴 αβ14 고리 형태를 나타냅니다.
RC-LH116 복합체는 32개의 BChl과 16개의 카로티노이드를 포함하며, 전체적인 배열은 Thermochromatium (Tch.) pidpidum [단백질 데이터 뱅크(PDB) ID 5Y5S](9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 균주(PDB ID 7C9R)(12) 및 녹조류(Blc.viridis)(PDB ID 6ET5)(10)에서 얻은 것과 동일합니다. 정렬 후, 특히 1-5, 15, 16번 위치에서 αβ 이종이량체의 위치에 약간의 차이만 관찰되었습니다(그림 S6). 단백질-W의 존재는 LH1의 구조에 상당한 영향을 미칩니다. 세 개의 막관통 도메인(TMH)은 짧은 루프로 연결되어 있으며, N-말단은 복합체의 내강 쪽에, C-말단은 세포질 쪽에 위치합니다(그림 1A 및 3, A~D). 단백질-W는 대부분 소수성이며(그림 3B), TMH2와 TMH3는 LH1αβ-14와 상호작용하여 막관통 표면을 형성합니다(그림 3, B 및 E~G). 이 계면은 주로 막관통 영역의 페닐알라닌(Phe), 류신(Leu), 발린(Val) 잔기로 구성됩니다. 이 잔기들은 소수성 아미노산 및 αβ-14 색소와 함께 쌓여 있습니다. 일부 극성 잔기들도 상호작용에 기여하는데, 복합체 공동 표면의 W-Thr68과 β-Trp42 사이의 수소 결합이 그 예입니다(그림 3, F 및 G). 세포질 표면에서 글루타민34는 αβ-14 카로티노이드의 케토기와 인접해 있습니다. 또한, n-도데실 β-d-말토사이드(β-DDM) 분자가 관찰되었으며, 그 소수성 꼬리는 단백질-W와 αβ-14 사이의 계면까지 뻗어 있고, 지질 꼬리는 세포체 내부에 위치할 가능성이 있습니다. 또한, 단백질 W와 RCH의 C-말단 분해 영역이 매우 가깝지만, 특정한 상호작용을 형성할 범위에는 미치지 못한다는 것을 확인했습니다(그림 1, A 및 E). 그러나 이 두 단백질의 분해되지 않은 C-말단 아미노산에서 상호작용이 발생할 수 있으며, 이는 RC-LH114-W 복합체 형성 과정에서 단백질 W를 모집하는 메커니즘을 제공할 수 있습니다.
(A) LH1αβ14와의 접합면을 마주보고 있는 단백질-W를 만화 형태로 나타낸 그림으로, 정전기 전위도(등고선 레벨 0.13의 투명한 회색 표면)의 일부에 막대 모양의 측쇄(빨간색)가 표시되어 있다. (B) 소수성 영역으로 표현된 단백질-W. 극성 및 대전 영역은 청록색, 소수성 영역은 흰색, 강한 소수성 영역은 주황색으로 표시되어 있다. (C 및 D) (A)와 (C)와 동일한 방향으로 표현된 단백질-W와 180° 회전된 (D) 단백질-W를 만화 형태로 나타낸 그림이다. 서열 내 위치에 따라 구별 가능한 잔기들은 무지개색으로 표시되었으며, N-말단은 파란색, C-말단은 빨간색이다. (E) (A)와 동일한 시점에서 본 단백질-W이며, 단백질-W와 LH1 접합면의 잔기들은 표시된 막대로 나타내었다. (F) 단백질-W는 (E) 및 LH1αβ14에 대해 카툰 표현에서, 그리고 막대 표현에서 계면 잔기에 대해 90° 회전되어 있습니다. 베타 폴리펩타이드에서 돌출된 잔기들이 표시되어 있습니다. 보조인자는 그림 1과 같은 색상의 막대로, 분해된 β-DDM은 회색으로, 산소는 빨간색으로 표시되어 있습니다. (G) (F)의 그림을 180° 회전시킨 것으로, 알파 폴리펩타이드의 주요 잔기들이 표시되어 있습니다.
단백질-W는 αβ 이종이량체(그림 1F의 15번째)를 대체하여 루프 폐쇄를 방지하고 처음 세 개의 αβ 이종이량체를 기울입니다. 필름 법선에 대한 첫 번째 αβ-1 이종이량체의 최대 경사각은 25°~29°인 것으로 관찰되었으며(그림 1, A 및 E), 이는 RC A sharp contrast-LH116에서 αβ-1의 2°~8° 경사에 의해 형성됩니다(그림 1, B 및 F). 두 번째와 세 번째 이종이량체는 각각 12°~22°와 5°~10°로 기울어져 있습니다. RC의 입체적 장애로 인해 αβ-1의 기울기는 두 번째 αβ 쌍(그림 1F의 16번째 αβ에 해당)을 포함하지 않아 LH1 고리에 명확한 틈이 형성됩니다(그림 1, A 및 E). 두 개의 αβ 헤테로다이머가 부족하고 4개의 BChl과 2개의 카로티노이드가 손실됨에 따라, 어떤 카로티노이드도 뒤틀린 αβ-1 소단위에 결합하지 않아 13개의 카로티노이드(Vegetarian)와 28개의 BChl을 포함하는 LH114-W 고리가 생성됩니다. αβ1~7 영역에서 두 복합체의 국소 해상도 추정치는 LH1 루프의 나머지 부분보다 낮으며, 이는 RC QB 부위에 인접한 LH1 소단위의 고유한 유연성을 반영하는 것일 수 있습니다(그림 4).
RC-LH114-W(A 및 B)와 RC-LH116(C 및 D)의 사진은 그림 1의 동일한 상단/측면도(A 및 B), (A 및 C) 및 공동 표면(B 및 D)에서 촬영한 것이다. 색상 범례는 오른쪽에 표시되어 있다.
1:14의 화학양론적 비율을 갖는 유일한 다른 특징적인 코어 복합체는 Rhodococcus sphaeroides(Rba.) RC-LH1-PufX 이량체(13)입니다. 그러나 단백질 W와 PufX는 명확한 상동성이 없으며 각각의 LH1 구조에 상당한 영향을 미칩니다. PufX는 Rps. palustris LH116αβ-16에 해당하는 위치에서 RC-H 소단위체의 세포질 측과 상호작용하는 N-말단 세포질 도메인을 가진 단일 TMH입니다(13). PufX는 RC-LH1과 시토크롬 bcl 복합체 사이의 퀴논/퀴놀론 교환을 위한 채널을 생성하며 모든 Rba. sphaeroides 코어 복합체에 존재합니다(13). 단량체-단량체 인터페이스는 Rba. sphaeroides RC-LH1-PufX 이합체는 RC-LH114-W에서 단백질 W의 결합 위치에 있으며, PufX와 단백질 W에 의해 유도된 틈은 동일한 위치에 있다(그림 S7A). RC-LH114-W의 틈은 단백질 W나 PufX와 관련이 없는 펩타이드로 형성된 Pseudomonas rosea LH1의 가상 퀴논 채널(8)과도 정렬되어 있다(그림 S7B). 또한, 하나의 γ 소단위(7)를 제외하여 형성된 Blc.emerald green LH1의 퀴논 채널도 유사한 위치에 있다(그림 S7C). 서로 다른 단백질에 의해 매개되지만, RC-LH1 복합체의 공통 위치에 이러한 퀴논/퀴놀롤 채널이 나타나는 것은 수렴 진화의 한 예로 보이며, 단백질 W에 의해 생성된 틈이 퀴논 채널 역할을 할 수 있음을 시사한다.
LH114-W 루프의 틈은 단백질에서처럼 단백질 기공을 통해 두 도메인을 연결하는 대신, RC-LH114-W 복합체의 내부 공간과 벌크 막 사이에 연속적인 막 영역을 형성할 수 있게 합니다(그림 1G). RC-LH116 복합체는 닫힌 Tch. 바늘 모양 복합체(22)와 유사합니다(그림 1H). 막을 통한 퀴논의 확산은 좁은 단백질 채널을 통한 확산보다 빠르기 때문에, 열린 LH114-W 루프는 닫힌 LH116 루프보다 더 빠른 RC 회전을 허용할 수 있으며, RC로의 퀴논 확산은 더 제한될 수 있습니다. 단백질 W가 RC를 통한 퀴논 전환에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 특정 농도의 유비퀴논 2(UQ2)(더 짧은 이소프렌 꼬리를 가진 천연 UQ10의 유사체)에 대해 시토크롬 산화 분석을 수행했습니다(그림 2E). 킬레이트화된 퀴논의 존재로 인해 겉보기 미카엘리스 상수(RC-LH114-W 및 RC-LH116은 각각 0.2±0.1μM 및 0.5±0.2μM에 적합함)의 정확한 측정이 어렵지만, RC-LH114-W의 최대 반응 속도(4.6±0.2 e-RC-1 s-1)는 RC-LH116(3.6±0.1 e-RC-1 s-1)보다 28±5% 더 크다.
우리는 처음에 단백질-W가 코어 복합체의 약 10%에 존재한다고 추정했습니다(16). 여기서 저조도, 중조도 및 고조도 성장 세포의 점유율은 각각 15±0.6%, 11±1% 및 0.9±0.5%입니다(그림 2F). 질량 분석을 통한 정량적 비교 결과, 히스티딘 태그를 추가해도 야생형 균주에 비해 단백질-W의 상대적 존재량이 감소하지 않았으므로(P = 0.59), 이러한 수준은 변형된 단백질-W의 인공적인 결과가 아닙니다(그림 S10). 그러나 RC-LH1 복합체에서 단백질-W의 낮은 점유율은 일부 RC가 가속화된 속도로 전환되도록 하여 RC-LH116 복합체에서 느린 퀴논/퀴놀론 교환을 완화할 수 있습니다. 우리는 높은 광점유율이 최근 전사체 데이터와 일치하지 않는다는 것을 알아차렸는데, 이는 강한 빛 아래에서 pufW 유전자 발현이 증가함을 나타냅니다(그림 S11)(23). pufW 전사와 RC-LH1 복합체에 단백질-W가 통합되는 것 사이의 차이는 혼란스럽고 단백질의 복잡한 조절을 반영할 수 있습니다.
RC-LH114-W에는 6개의 카르디올리핀(CDL), 7개의 포스파티딜콜린(POPC), 1개의 포스파티딜글리세롤(POPG) 및 29개의 β-DDM 분자가 존재하며, 이 중 6개는 CDL, 24개는 POPC, 2개는 POPG, 12개는 β-DDM으로 구성되어 있습니다(그림 5, A 및 B). 이 두 구조에서 CDL은 복합체의 세포질 쪽에 주로 위치하는 반면, POPC, POPG 및 β-DDM은 대부분 내강 쪽에 위치합니다. RC-LH114-W 복합체의 αβ-1에서 αβ-6 영역에서는 각각 2개의 지질 및 세제 분자가 분리되었고(그림 5A), RC-LH116의 동일한 영역에서는 5개의 분자가 분리되었습니다(그림 5B). 복합체의 반대쪽에서 더 많은 지질, 주로 CDL이 RC와 αβ-7~αβ-13 사이에 축적된 것이 발견되었습니다(그림 5, A 및 B). 구조적으로 규명된 다른 지질과 세제는 LH1 고리 바깥쪽에 위치하며, 잘 규명된 아실 사슬은 LH1 소단위체 사이에 뻗어 있는데, 이는 RC-LH114-W에서는 β-DDM으로, RC-LH116에서는 β-DDM과 POPC-LH116의 혼합물로 잠정적으로 명명되었습니다. 우리 구조에서 킬레이트화 지질과 세제의 유사한 위치는 이들이 생리적으로 관련된 결합 부위임을 시사합니다(그림 S12A). Tch에서 동일한 분자의 위치 또한 일관성이 높습니다. Gentle 및 Trv. 970번 균주 RC-LH1s(그림 S12, B~E)(9, 12)와 지질 머리 그룹의 수소 결합 잔기는 서열 정렬에서 상당히 좋은 보존성을 보였으며(그림 S13), 이는 RC에 결합하는 보존된 CDL(24)이 RC-LH1 복합체에서 보존될 수 있음을 나타냅니다.
(A 및 B) RC-LH114-W(A) 및 RC-LH116(B) 펩타이드는 카툰으로, 색소는 막대로 표현되었으며, 색상 구성은 그림 1을 따랐습니다. 지질은 빨간색으로, 세제는 회색으로 표시했습니다. RC QA 및 QB 부위에 결합된 UQ는 노란색이고, 분리된 UQ는 파란색입니다. (C 및 D) (A) 및 (B)와 동일한 그림에서 지질을 생략했습니다. (E~G) RC-LH116의 Q1(E), Q2(F), Q3(G)를 확대한 그림으로, 서로 영향을 미치는 측쇄를 보여줍니다. 수소 결합은 검은색 점선으로 표시했습니다.
RC-LH116에서는 전하 분리 과정에서 전자 전달에 참여하는 RC QA와 QB UQ가 결합 부위에서 분해됩니다. 그러나 RC-LH114-W에서는 QB 퀴논이 분해되지 않았으며, 이에 대해서는 아래에서 자세히 논의할 것입니다. QA와 QB 퀴논 외에도, RC-LH114-W 구조에서는 잘 분해된 머리 부분(각각 Q1과 Q2에 위치)을 기준으로 두 개의 킬레이트화된 UQ 분자(RC와 LH1 고리 사이에 위치)가 할당됩니다(그림 5C). 두 개의 이소프렌 단위가 Q1에 할당되었고, 밀도 맵은 Q2의 10개 이소프렌 꼬리 전체를 분해합니다. RC-LH116 구조에서는 세 개의 킬레이트화된 UQ10 분자(Q1~Q3, 그림 5D)가 분해되었으며, 모든 분자는 꼬리 전체에 걸쳐 명확한 밀도를 나타냅니다(그림 5, D~G). 두 구조에서 Q1과 Q2의 퀴논 헤드 그룹의 위치는 매우 일관성이 있으며(그림 S12F), RC와만 상호작용합니다. Q1은 RC-LH114-W의 W 갭 입구에 위치하고(그림 1G 및 5, C, D, E), Q2는 QB 결합 부위 근처에 위치합니다(그림 5, C, D 및 F). 보존된 L-Trp143 및 L-Trp269 잔기는 Q1 및 Q2와 매우 가깝고 잠재적인 π-스태킹 상호작용을 제공합니다(그림 5, E 및 F, 그리고 그림 S12). Q1의 원위 산소로부터 3.0 Å 떨어진 L-Gln88은 강한 수소 결합을 제공합니다(그림 5E). 이 잔기는 가장 멀리 떨어진 관계를 제외한 모든 RC에서 보존되어 있습니다(그림 S13). L-Ser91은 다른 대부분의 RC에서 Thr을 대체하는 보존적 치환체이며(그림 S13), Q1의 메틸 산소로부터 3.8 옹스트롬 떨어져 있고 약한 수소 결합을 제공할 수 있습니다(그림 5E). Q3는 특정한 상호작용을 하는 것으로 보이지는 않지만, RC-M 소단위와 LH1-α 소단위 5~6 사이의 소수성 영역에 위치합니다(그림 5, D 및 G). Q1, Q2 및 Q3 또는 인근의 킬레이트화된 퀴논은 Tch. Gentle, Trv. Strain 970 및 Blc. The iris 구조(9, 10, 12)에서도 확인되었으며, 이는 RC-LH1 복합체에서 보존된 보조 퀴논 결합 부위를 가리킵니다(그림 S12G). RC-LH116에 있는 5개의 분해된 UQ는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정한 각 복합체의 5.8±0.7 값과 잘 일치하는 반면, RC-LH114-W에 있는 3개의 분해된 UQ는 측정값인 6.2±0.3(그림 S14)보다 낮아 구조 내에 미분해된 UQ 분자가 존재함을 나타냅니다.
유사대칭적인 L 및 M 폴리펩타이드는 각각 5개의 TMH를 포함하며, 하나의 BChl 이량체, 두 개의 BChl 단량체, 두 개의 박테리오파지(BPh) 단량체, 하나의 비헴 철 및 하나 또는 두 개의 UQ10 분자가 결합된 이종이량체를 형성합니다. 말단 케톤기의 수소 결합 존재와 Rps에서의 축적 특성으로 인해 카로티노이드는 M 소단위에 통합되며, 이를 cis-3,4-데하이드로오로도핀이라고 명명합니다(25). RC-H의 외막 도메인은 단일 TMH에 의해 막에 고정됩니다. 전체 RC 구조는 관련 종(예: Rba sphaeroides)의 3개 소단위 RC와 유사합니다(PDB ID: 3I4D). BChl과 BPh의 거대 고리, 카로티노이드 골격 및 비헴 철은 이러한 구조의 해상도 범위 내에서 겹치며, QA 부위의 UQ10 헤드 그룹과 RC-LH116의 QB 퀴논도 마찬가지입니다(그림 S15).
서로 다른 QB 부위 점유율을 갖는 두 개의 RC 구조의 사용 가능성은 QB 퀴논 결합에 수반되는 일관된 형태 변화를 조사할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. RC-LH116 복합체에서 QB 퀴논은 완전히 결합된 "근위" 위치(26)에 위치하지만, RC-LH114-W 분리체에는 QB 퀴논이 없습니다. RC-LH114-W에는 QB 퀴논이 없는데, 이는 구조적으로 규명된 QB 퀴논을 갖는 RC-LH116 복합체보다 이 복합체가 더 활성적이라는 점을 고려할 때 놀라운 일입니다. 두 개의 LH1 고리는 약 6개의 퀴논을 킬레이트화하지만, 닫힌 RC-LH116 고리에서는 5개가 구조적으로 규명된 반면, 열린 RC-LH114-W 고리에서는 3개만 구조적으로 제한됩니다. 이러한 구조적 무질서의 증가는 RC-LH114-W QB 부위의 더 빠른 교체, 복합체 내 퀴논 반응 속도의 증가, 그리고 LH1 루프를 통과할 가능성의 증가를 반영하는 것일 수 있습니다. 우리는 RC-LH114-W의 RC QB 부위에 UQ가 부족한 것이 더 복잡하고 활성이 높은 복합체의 결과일 수 있으며, RC-LH114-W의 QB 부위는 UQ 회전 과정에서 즉시 고정되었다고 제안합니다. 특정 단계(QB 부위 입구가 닫힘)는 이러한 활성의 형태를 반영합니다.
QB가 없을 경우, L-Phe217이 UQ10 결합에 적합하지 않은 위치로 회전하게 되는데, 이는 꼬리의 첫 번째 이소프렌 단위와 공간적으로 충돌하기 때문입니다(그림 6A). 또한, 주요 구조적 변화가 뚜렷하게 나타나는데, 특히 L-Phe217이 QB 결합 포켓으로 이동하고 L-Tyr223이 회전하여 M-Asp45 골격과의 수소 결합을 끊고 QB 결합 부위 입구를 닫는 현상이 관찰됩니다(그림 6A, 6B). 헬릭스 de는 기저부를 중심으로 회전하며, L-Ser209의 Cα는 0.33Å만큼 이동하고, L-Val221의 Cα는 3.52Å만큼 이동합니다. TMH D와 E는 두 구조 모두에서 겹쳐지므로 눈에 띄는 변화가 없습니다(그림 6A). 우리가 아는 한, 이는 천연 RC에서 QB 부위를 닫는 최초의 구조입니다. 완전한 (QB 결합) 구조와의 비교를 통해 퀴논이 환원되기 전에 퀴논에 들어가기 위해서는 구조적 변화가 필요하다는 것을 알 수 있습니다. L-Phe217은 회전하여 퀴논 헤드 그룹과 π-스태킹 상호작용을 형성하고, 나선 구조는 바깥쪽으로 이동하여 L-Gly222의 골격과 L-Tyr223의 측쇄가 안정적인 수소 결합 구조를 갖는 수소 결합 네트워크를 형성할 수 있게 됩니다(그림 6, A 및 C).
(A) 홀로그램(L 사슬, 주황색/M 사슬, 자홍색)과 아포(회색) 구조의 중첩된 만화로, 주요 잔기는 막대 모양으로 표시됩니다. UQ10은 노란색 막대로 표시됩니다. 점선은 전체 구조에서 형성된 수소 결합을 나타냅니다. (B 및 C) 아포리포단백질과 전체 고리 구조의 표면 표현으로, L-Phe217의 측쇄 산소는 파란색으로, L-Tyr223은 빨간색으로 각각 강조 표시됩니다. L 소단위는 주황색이고, M 및 H 소단위는 색칠되지 않았습니다. (D 및 E) 아포리포단백질(D) 및 전체(E) RC QB 부위[각각 (A)에 따라 색칠]와 Thermophilus thermophilus PSII(녹색, 플라스틱 퀴논이 있는 파란색; PDB ID: 3WU2) 정렬(58).
예상치 못하게, LH1이 없는 QB 결핍 RC의 여러 구조가 알려져 있음에도 불구하고, 본 연구에서 관찰된 구조적 변화는 이전에 보고된 바 없습니다. 여기에는 Blc. viridis(PDB ID: 3PRC)(27), Tch. tepidum(PDB ID: 1EYS)(28), Rba. sphaeroides(PDB ID: 1OGV)(29)의 QB 결핍 구조가 포함되는데, 이들 모두 전체 QB 구조와 거의 동일합니다. 3PRC를 자세히 살펴보면 LDAO(라우릴 디메틸 아민 옥사이드) 세제 분자가 QB 위치 입구에 결합하여 닫힌 구조로의 재배열을 방해하는 것으로 나타났습니다. LDAO는 1EYS 또는 1OGV에서는 동일한 위치에서 분해되지 않지만, 이들 RC는 동일한 세제를 사용하여 제조되었으므로 동일한 효과를 나타낼 수 있습니다. Rba.의 결정 구조는 다음과 같습니다. 사이토크롬 c2와 함께 공결정화된 Sphaeroides RC(PDB ID: 1L9B) 또한 닫힌 QB 부위를 갖는 것으로 보인다. 그러나 이 경우, Q 헬릭스의 Tyr 잔기의 수소 결합을 통해 QB 결합 부위와 상호작용하는 RC-M 폴리펩타이드의 N-말단 영역은 비정상적인 형태를 취하고 있으며, QB의 형태 변화에 대해서는 더 이상 연구되지 않았다(30). 다행스러운 점은 RC-LH116 RC의 N-말단 영역과 거의 동일한 RC-LH114-W 구조에서는 이러한 M 폴리펩타이드의 변형이 관찰되지 않았다는 것이다. 또한 세제 기반 LH1 안테나를 제거한 후 PDB의 아포리포단백질 RC가 분해되었으며, 이로 인해 RC와 주변 LH1 고리의 내부 표면 사이의 간격에 있는 내부 퀴논 풀과 지질이 제거되었다는 점도 주목해야 한다(31, 32). RC는 분해되기 쉬운 QB 퀴논을 제외한 모든 보조 인자를 유지하기 때문에 기능성을 유지합니다. QB 퀴논은 안정성이 떨어지고 제조 과정에서 종종 손실됩니다(33). 또한, RC에서 LH1과 천연 고리형 지질을 제거하면 전하 분리된 P+QB 상태의 수명 단축과 같은 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것이 알려져 있습니다(31, 34, 35). 따라서 RC를 둘러싸고 있는 국소 LH1 고리의 존재가 "닫힌" QB 부위를 유지하여 QB 주변의 국소 환경을 보존할 수 있다고 추측합니다.
아폴리포단백질(QB 퀴논 제외)과 완전한 구조는 일련의 사건이 아니라 QB 부위 회전의 두 가지 스냅샷만을 나타내지만, 하이드로퀴논에 의한 재결합을 방지하여 기질 억제를 억제하기 위해 결합이 조절될 수 있다는 징후가 있습니다. 아폴리포단백질의 QB 부위 근처에서 퀴놀롤과 퀴논의 상호작용은 다를 수 있으며, 이는 RC에 의한 거부로 이어집니다. 퀴논의 결합 및 환원에는 구조적 변화가 중요한 역할을 한다는 가설은 오랫동안 제기되어 왔습니다. 암적응 후 동결된 RC의 퀴논 환원 능력은 손상됩니다(36). X선 결정학 연구에 따르면 이러한 손상은 QB 퀴논이 활성 근위 위치에서 약 4.5Å 떨어진 "원위" 구조에 갇히기 때문입니다(26, 37). 우리는 이러한 원거리 결합 형태가 아포리포단백질과 완전한 고리 구조 사이의 중간 상태를 나타내는 스냅샷이며, 이는 퀴논과의 초기 상호작용 및 QB 부위의 개방 이후에 나타난다고 제안합니다.
특정 광합성 세균, 남세균, 조류 및 식물의 PSII 복합체에서 발견되는 II형 RC는 구조적 및 기능적 보존성을 가지고 있다(38). 그림 6(D 및 E)에 나타낸 구조적 정렬은 PSII RC와 세균 RC 복합체의 QB 부위 사이의 유사성을 강조한다. 이러한 비교는 퀴논 결합 및 환원의 밀접하게 관련된 시스템을 연구하는 데 오랫동안 모델로 사용되어 왔다. 이전 연구에서는 PSII에 의한 퀴논 환원이 구조적 변화를 동반한다고 제안했다(39, 40). 따라서 RC의 진화적 보존성을 고려할 때, 이전에 관찰되지 않았던 이 결합 메커니즘은 산소가 공급되는 광합성 식물의 PSII RC의 QB 부위에도 적용될 수 있다.
Rps ΔpufW(표지되지 않은 pufW 결손) 및 PufW-His(자연적인 pufW 유전자좌에서 발현되는 C-말단 10x His-태그 단백질-W) 균주. palustris CGA009는 이전 연구(16)에서 설명되었습니다. 이들 균주와 동형 야생형 모균주는 PYE 한천(각 5g/L)(LB 배지에 -80°C에서 보관, 50%(w/v) 글리세롤, 단백질, 효모 추출물 및 숙신산염 함유) [1.5%(w/v)] 플레이트에 소량의 세포를 도말하여 냉동고에서 꺼냈습니다. 플레이트는 실온에서 혐기성 조건으로 하룻밤 동안 암실에서 배양한 후, OSRAM 116W 할로겐 전구(RS Components, UK)에서 제공하는 백색광(~50 μmolm⁻² s⁻¹)으로 3~5일 동안 조사하여 단일 콜로니가 나타날 때까지 배양했습니다. 단일 콜로니를 사용하여 0.1%(w/v) 카사미노산이 첨가된 M22+ 배지(41) 10ml(이하 M22)에 접종했습니다. 배양액은 34°C의 암실에서 저산소 조건으로 180rpm으로 48시간 동안 진탕 배양한 후, 배양액 70ml를 동일한 조건에서 24시간 동안 접종했습니다. 1ml의 반호기성 배양액을 30ml 범용 스크류 캡 투명 유리병에 담긴 M22 배지 30ml에 접종하고 멸균 자석 교반봉을 사용하여 48시간 동안 진탕(~50μmolm-2 s-1)했습니다. 이후, 동일한 조건에서 배양액 약 1리터를 30ml의 배양액에 접종하고, 이를 다시 약 9리터의 배양액에 접종하여 약 200μmolm⁻²s⁻¹의 광량으로 72시간 동안 배양하였다. 세포는 7132 RCF에서 30분간 원심분리하여 수확하고, 약 10ml의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0) 용액에 재현탁시킨 후, 필요할 때까지 -20°C에서 보관하였다.
해동 후, 재현탁된 세포에 데옥시리보뉴클레아제 I(Merck, UK) 결정, 리소자임(Merck, UK) 및 Roche 홀로효소 프로테아제 억제제 정제 2정(Merck, UK)을 첨가합니다. 20,000 psi 프렌치 압력 셀(Aminco, USA)에서 세포를 8~12회 파쇄합니다. 4°C에서 15분 동안 18,500 RCF로 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포와 불용성 잔해를 제거한 후, 43,000°C에서 2시간 동안 113,000 RCF로 원심분리하여 색소가 있는 용해액으로부터 막을 침전시킵니다. 가용성 분획을 버리고, 착색된 막을 100~200 ml의 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 재현탁하고 눈에 보이는 응집체가 없을 때까지 균질화합니다. 현탁된 막을 2% (w/v) β-DDM을 함유한 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0)(Anatrace, USA) 용액에 넣고 4°C에서 어두운 곳에 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 그런 다음 70°C에서 원심분리하여 4°C에서 1시간 동안 150,000 RCF를 용해시켜 잔류 불용성 물질을 제거하였다.
ΔpufW 균주의 가용화 막을 50 ml DEAE Sepharose 이온 교환 컬럼에 적용하고, 결합 완충액[0.03%(w/v) β-DDM을 함유하는 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0)]을 3 컬럼 부피(CV)만큼 넣었다. 컬럼을 결합 완충액 2 CV로 세척한 후, 50 mM NaCl을 함유하는 결합 완충액 2 CV로 다시 세척했다. RC-LH116 복합체는 1.75 CV의 컬럼 부피에서 150~300 mM NaCl(결합 완충액 내)의 선형 농도 구배로 용출시켰고, 나머지 결합 복합체는 0.5 CV의 컬럼 부피에서 300 mM NaCl을 함유하는 결합 완충액으로 용출시켰다. 250~1000 nm 범위의 흡수 스펙트럼을 수집하고, 880~280 nm에서 흡광도비(A880/A280)가 1보다 큰 분획을 유지한 후, 결합 완충액으로 2배 희석하고, 동일한 절차를 DEAE 컬럼에서 다시 수행하여 정제한다. A880/A280 비율이 1.7보다 크고 A880/A805 비율이 3.0보다 큰 분획을 희석하고, 3차 이온 교환을 수행한 후, A880/A280 비율이 2.2보다 크고 A880/A805 비율이 5.0보다 큰 분획을 최종적으로 얻는다. 부분 정제된 복합체를 Amicon 100,000 분자량 차단(MWCO) 원심분리 필터(Merck, UK)를 사용하여 약 2 ml로 농축한 후, 200 mM NaCl 완충액이 들어 있는 Superdex 200 16/600 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(GE Healthcare, US)에 로딩하고, 동일한 완충액으로 1.5 CV의 유속으로 용출했습니다. 크기 배제 크로마토그래피 분획의 흡수 스펙트럼을 수집하고, A880/A280 비율이 2.4 이상이고 A880/A805 비율이 5.8 이상인 흡수 스펙트럼을 100 A880까지 농축하여 즉시 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 그리드 준비에 사용하거나 보관합니다. 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
PufW-His 균주의 용해성 막을 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 컬럼(20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 200 mM NaCl 및 0.03%(w/w) 히스티딘 함유, IMAC 버퍼(GE Healthcare))에 적용하였다. 컬럼을 IMAC 버퍼 5회 부피 분율(CV)로 세척한 후, 10 mM 히스티딘을 함유한 IMAC 버퍼 5회 부피 분율로 세척하였다. 코어 복합체는 100 mM 히스티딘을 함유한 IMAC 버퍼 5회 부피 분율로 컬럼에서 용출하였다. RC-LH114-W 복합체를 포함하는 분획을 Amicon 100,000 MWCO 필터(Merck, UK)가 장착된 교반 탱크에서 약 10 ml로 농축하고, 결합 완충액으로 20배 희석한 다음, DEAE Sepharose 컬럼에 25 ml를 첨가합니다. 이때 완충액에 결합된 4개의 CV를 미리 사용합니다. 컬럼을 4개의 CV 결합 완충액으로 세척한 다음, 0~100 mM NaCl(결합 완충액 내)의 선형 기울기에서 8개의 CV에 걸쳐 복합체를 용출하고, 나머지 4개의 CV에는 100 mM 결합 완충액을 포함시켰습니다. 염화나트륨과 A880/A280 비율이 2.4보다 높고 A880/A805 비율이 4.6보다 높은 분획에서 용출된 잔류 복합체를 Amicon 100,000 MWCO 원심분리 필터에서 약 2 ml로 농축하고, 미리 완충액으로 평형화된 Superdex 200 16/600 크기 배제 IMAC 컬럼에 1.5 CV를 채운 후, 동일한 완충액으로 1.5 CV에 걸쳐 용출했습니다. 크기 배제 크로마토그래피 분획의 흡수 스펙트럼을 수집하고, A880/A280 비율이 2.1 이상이고 A880/A805 비율이 4.6 이상인 흡수 스펙트럼을 100 A880으로 농축하여 즉시 냉동 TEM 그리드 준비에 사용하거나 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
라이카 EM GP 침지 냉동기를 사용하여 저온 TEM 그리드를 제작했습니다. 복합체를 IMAC 버퍼에 희석하여 흡광도(A880)를 50으로 맞춘 후, 5μl를 새로 글로우 방전 처리한 QUANTIFOIL 1.2/1.3 탄소 코팅 구리 메쉬(Agar Scientific, UK)에 로딩했습니다. 그리드를 20°C, 상대 습도 60%에서 30초간 배양한 후, 3초간 블로팅하여 건조시키고 -176°C의 액체 에탄에 담가 급랭시켰습니다.
RC-LH114-W 복합체의 데이터는 가속 전압 300kV, 공칭 배율 130,000배, 에너지 간격 20eV의 Titan Krios 현미경을 사용하여 eBIC(Electronic Bioimaging Center, British Diamond Light Source)에서 기록되었습니다. 데이터 수집을 위해 K2 피크 검출기가 장착된 Gatan 968 GIF Quantum을 계수 모드로 사용하여 이미지를 기록했습니다. 보정된 픽셀 크기는 1.048Å이고, 선량률은 3.83 e-Å⁻²s⁻¹입니다. 11초 동안 촬영한 영상을 40개 부분으로 나누었습니다. 탄소 코팅 영역을 이용하여 현미경 초점을 다시 맞춘 후, 각 부분당 3개의 영상을 촬영했습니다. 총 3130개의 영상을 수집했으며, 초점 이탈 값은 -1μm에서 -3μm 사이였습니다.
RC-LH116 복합체의 데이터는 영국 리즈 대학교 아스터베리 생물구조 연구소(Asterbury Biostructure Laboratory)의 동일한 현미경을 사용하여 수집되었습니다. 데이터는 130k 배율의 계수 모드에서 수집되었으며, 픽셀 크기는 1.065Å, 조사량은 4.6eÅ⁻²s⁻¹로 보정되었습니다. 동영상은 12초 동안 녹화되었고 48개 부분으로 나누어졌습니다. 총 3359개의 영상이 수집되었으며, 초점 이탈 값은 -1μm에서 -3μm 사이였습니다.
모든 데이터 처리는 Relion 3.0 파이프라인(42)에서 수행됩니다. Motioncorr 2(43)를 사용하여 선량 가중치로 빔 움직임을 보정하고, CTFFIND 4.1(44)을 사용하여 CTF(대비 전달 함수) 매개변수를 결정합니다. 이러한 초기 처리 단계 후의 일반적인 현미경 사진은 그림 2. S16에 나와 있습니다. 자동 선택 템플릿은 250픽셀 프레임에서 1000개의 입자 중 약 250픽셀을 수동으로 선택하고 참조 2차원(2D) 분류를 사용하지 않아 샘플 오염이 있거나 식별 가능한 특징이 없는 분류를 제외하여 생성됩니다. 그런 다음 모든 현미경 사진에 대해 자동 선택을 수행한 결과, RC-LH114-W는 849,359개의 입자, RC-LH116 복합체는 476,547개의 입자가 선택되었습니다. 선택된 모든 입자는 두 차례의 비참조 2D 분류를 거쳤으며, 각 실행 후 탄소 영역, 시료 오염, 명확한 특징 부재 또는 강하게 중첩된 입자 등의 조건을 만족하는 입자는 제거되었습니다. 그 결과, 각각 772,033개(90.9%)와 359,678개(75.5%)의 입자가 RC-LH114-W와 RC-LH116의 3D 분류에 사용되었습니다. 초기 3D 참조 모델은 확률적 경사 하강법을 사용하여 생성되었습니다. 이 초기 모델을 참조하여 선택된 입자를 3D에서 네 가지 범주로 분류했습니다. 각 범주의 모델을 참조하여 가장 큰 범주에 속하는 입자에 대해 3D 정제를 수행한 후, 초기 15Å 저역 통과 필터를 사용하여 용매 영역을 제거하고, 6픽셀의 소프트 에지를 추가한 다음, 상단 검출기의 Gatan K2 피크 변조 전달 함수를 보정하는 후처리를 수행했습니다. RC-LH114-W 데이터셋의 경우, 초기 모델에서 마스크 가장자리의 강한 밀도 영역(UCSF Chimera에서 코어 복합체 밀도와 분리된 부분)을 제거하여 모델을 수정했습니다. 이렇게 얻은 모델(RC-LH114-W와 RC-LH116의 해상도는 각각 3.91Å와 4.16Å)을 2차 3D 분류의 참조 모델로 사용했습니다. 사용된 입자들은 초기 3D 클래스로 그룹화되었으며, 주변 영역과의 강한 상관관계, 겹침 또는 명확한 구조적 특징의 부족을 포함하지 않습니다. 2차 3D 분류 후, 가장 높은 해상도를 가진 범주를 선택했습니다. [RC-LH114-W의 경우, 하나의 범주에 377,703개의 입자(44.5%)가 포함되었고, RC-LH116의 경우, 두 개의 범주에 총 260,752개의 입자(54.7%)가 포함되었습니다. 이 두 범주는 초기 회전 후 정렬했을 때 약간의 차이가 있지만 동일한 것으로 나타났습니다.] 선택된 입자들은 400픽셀 박스 내에서 재추출되고 3D 정제를 통해 정밀화됩니다. 용매 마스크는 초기 15Å 저역 통과 필터, 3픽셀 맵 확장 및 3픽셀 소프트 마스크를 사용하여 생성됩니다. 입자별 CTF 정제, 입자별 모션 보정 및 두 번째 입자별 CTF 정제, 3D 정제, 용매 마스킹 및 후처리 과정을 각 단계 후에 수행하여 결과 텍스처를 더욱 정밀화합니다. FSC(푸리에 셸 상관 계수) 차단값 0.143을 사용하여 RC-LH114-W 및 RC-LH116의 최종 모델 해상도는 각각 2.65Å 및 2.80Å입니다. 최종 모델의 FSC 곡선은 그림 2. S17에 나타나 있습니다.
모든 단백질 서열은 UniProtKB에서 다운로드되었습니다: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL(45)을 사용하여 RC-L, RC-M 및 RC-H의 단백질 서열을 포함하는 RC의 상동성 모델을 구축했으며, Rba. sphaeroides RC의 결정 구조를 템플릿으로 사용했습니다(PDB ID: 5LSE)(46). UCSF Chimera의 "fit map" 도구를 사용하여 생성된 모델을 맵에 맞추고(47), 단백질 구조를 개선하고, 보조인자[4×BChl a(모노머 라이브러리 잔기 이름 = BCL), 2×BPh a(BPH), 한두 종류의 UQ10(U10), 비헴철(Fe) 1개 및 3,4-디하이드로헥사카르보닐콜린(QAK) 1개]를 Coot(48)를 사용하여 추가합니다. QAK는 모노머 라이브러리에서 사용할 수 없으므로 PHENIX(49)의 eLBOW 도구를 사용하여 매개변수화했습니다.
다음으로 LH1 소단위체를 구성했습니다. 먼저 PHENIX(49)의 자동 구성 도구를 사용하여 지도와 LH1-α 및 LH1-β 단백질 서열을 입력으로 사용하여 LH1 서열의 일부를 자동으로 구성했습니다. 가장 완전한 LH1 소단위체를 선택하고 추출하여 Coot에 로드한 다음, 누락된 서열을 수동으로 추가하고 두 개의 BCl(BCL)과 스피릴록산틴(CRT)을 추가하기 전에 전체 구조를 수동으로 정제했습니다[관련 Rps LH1 복합체 밀도 및 알려진 카로티노이드 함량 종(17)에 따름]. 완전한 LH1 소단위체를 복사하고 UCSF Chimera의 "도킹 맵 도구"를 사용하여 LH1 밀도의 인접한 비모델 영역에 도킹한 다음 Coot에서 정제합니다. 모든 LH1 소단위체가 모델링될 때까지 이 과정을 반복합니다. RC-LH114-W 구조의 경우, Coot에서 할당되지 않은 밀도를 추출하여 USCF Chimera 맵에서 나머지 비단백질 구성 요소로부터 단백질을 분할하고 Autobuild 도구를 사용하여 초기 모델을 구축한 다음, 나머지 소단위(단백질-W) 모델링을 PHENIX(49)에서 수행합니다. Coot(48)에서 결과 모델에 누락된 서열을 추가한 다음 전체 소단위를 수동으로 정제합니다. 나머지 할당되지 않은 밀도는 지질(PDB 단량체 라이브러리 ID: CDL = CDL, POPC = 6PL, POPG = PGT), β-DDM 세제(LMT) 및 UQ10 분자(U10)의 조합에 적합합니다. PHENIX 최적화(49)와 Coot(48)에서의 수동 최적화를 사용하여 모델 통계 및 적합도의 시각적 품질이 더 이상 개선될 수 없을 때까지 완전한 초기 모델을 완성합니다. 마지막으로 LocScale(50)을 사용하여 로컬 맵을 선명하게 만든 다음 할당되지 않은 밀도 모델링과 자동 및 수동 최적화를 여러 번 반복합니다.
각각의 펩타이드, 보조인자, 기타 지질 및 퀴논이 해당 밀도 내에 도킹된 모습은 그림 1과 2, 그리고 그림 S18~S23에 나타나 있습니다. 최종 모델의 통계 정보는 표 S1에 제시되어 있습니다.
별도로 명시되지 않은 경우, UV/Vis/NIR 흡수 스펙트럼은 Cary60 분광광도계(Agilent, USA)를 사용하여 250 nm에서 1000 nm까지 1 nm 간격으로, 적분 시간 0.1초로 측정하였다.
시료를 광경로 2mm의 석영 큐벳에 넣고 A880이 1이 되도록 희석한 후, 400~1000nm 범위에서 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 원형 이색성 스펙트럼은 Jasco 810 분광편광계(Jasco, 일본)를 사용하여 400nm~950nm 범위에서 1nm 간격으로, 20nm/min의 스캔 속도로 측정하였다.
몰 흡광 계수는 코어 복합체를 A880이 약 50이 되도록 희석하여 결정합니다. 10μl 부피를 990μl 결합 완충액 또는 메탄올에 희석하고, BChl 분해를 최소화하기 위해 즉시 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 각 메탄올 샘플의 BChl 함량은 771nm에서의 흡광 계수 54.8mM⁻¹cm⁻¹를 이용하여 계산하고, 흡광 계수를 결정합니다(51). 측정된 BChl 농도를 32(RC-LH114-W) 또는 36(RC-LH116)으로 나누어 코어 복합체 농도를 구하고, 이를 이용하여 완충액에서 수집한 동일 샘플의 흡수 스펙트럼을 측정하여 흡광 계수를 계산합니다. 각 샘플에 대해 3회 반복 측정하고, BChl Qy 최대값의 평균 흡광도를 계산에 사용합니다. 878 nm에서 측정한 RC-LH114-W의 소광계수는 3280±140 mM⁻¹cm⁻¹이고, 880 nm에서 측정한 RC-LH116의 소광계수는 3800±30 mM⁻¹cm⁻¹이다.
UQ10은 (52)의 방법에 따라 정량화되었습니다. 간단히 말하면, Agilent 1200 HPLC 시스템을 사용하여 역상 HPLC(RP-HPLC)를 수행했습니다. 약 0.02 nmol의 RC-LH116 또는 RC-LH114-W를 0.02%(w/v) 염화제2철을 함유하는 50μl의 50:50 메탄올:클로로포름에 용해시키고, 미리 평형화된 Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm 컬럼(×25 cm)에 HPLC 용매(80:20 메탄올:2-프로판올)에서 40°C에서 1 ml-1 min-1의 유속으로 주입했습니다. HPLC 용매에서 등용매 용출을 수행하여 275 nm(UQ10), 450 nm(카로티노이드) 및 780 nm(BChl)에서 1시간 동안 흡광도를 모니터링했습니다. 275 nm 크로마토그램에서 25.5분에 나타나는 피크를 적분하였으며, 이 피크에는 다른 검출 가능한 화합물이 포함되어 있지 않았습니다. 적분된 면적을 이용하여 0~5.8 nmol 범위의 순수 표준물질을 주입하여 계산한 검량곡선을 기준으로 추출된 UQ10의 몰량을 계산하였습니다(그림 S14). 각 시료는 3회 반복 분석하였으며, 보고된 오차는 평균값의 표준편차입니다.
최대 Qy 흡수도가 0.1인 RC-LH1 복합체를 포함하는 용액을 30 μM 환원형 말 심장 시토크롬 c2(Merck, UK)와 0~50 μM UQ2(Merck, UK)를 사용하여 제조했습니다. 각 UQ2 농도별로 1 ml 샘플 3개를 준비하고 측정 전 암조건에 완전히 적응시키기 위해 4°C에서 하룻밤 동안 암실에 보관했습니다. 이 용액을 300 nm 화염/500 라인 회절 격자, 1.24 mm 입구, 0.12 mm 중간 및 0.6 mm 출구 슬릿이 장착된 OLIS RSM1000 모듈형 분광광도계에 넣었습니다. 여기광을 차단하기 위해 샘플 광전관과 기준 광증폭관 입구에 600 nm 장파장 필터를 설치했습니다. 흡광도는 550 nm에서 0.15초의 적분 시간으로 측정했습니다. 여기광은 880 nm M880F2 LED(발광 다이오드)(Thorlabs Ltd., 영국)에서 방출되어 광섬유 케이블을 통해 DC2200 컨트롤러(Thorlabs Ltd., 영국)를 거쳐 90% 강도로 광원에 90° 각도로 조사됩니다. 측정 빔은 거울에 반대 방향으로 조사되어 시료에 흡수되지 않은 빛을 반사합니다. 조명 시작 10초 전인 50초 동안 흡광도를 측정합니다. 그런 다음, 퀴놀롤이 시토크롬 c23+를 자발적으로 환원시키는 정도를 평가하기 위해 암실에서 60초 동안 흡광도를 추가로 측정합니다(원시 데이터는 그림 S8 참조).
데이터는 0.5~10초(UQ2 농도에 따라 다름) 범위에서 선형 초기 반응 속도를 적용하여 처리하고, 각 UQ2 농도에서 세 가지 샘플의 반응 속도를 평균화했습니다. 해당 소광 계수를 이용하여 계산한 RC-LH1 농도를 반응 속도에서 촉매 효율로 변환하고, Origin Pro 2019(OriginLab, USA)를 사용하여 그래프를 그린 후, Michaelis-Menten 모델에 적용하여 겉보기 Km 및 Kcat 값을 결정했습니다.
일시적 흡수 측정을 위해 RC-LH1 샘플을 50 mM 아스코르브산나트륨(Merck, USA)과 0.4 mM 테르부틴(Merck, USA)을 함유한 IMAC 완충액에 약 2 μM 농도로 희석했습니다. 아스코르브산은 희생 전자 공여체로, 테르부타클로펜은 QB 억제제로 사용하여 측정 과정 전반에 걸쳐 주요 RC 공여체가 환원된 상태(즉, 광산화되지 않은 상태)를 유지하도록 했습니다. 약 3 ml의 샘플을 광경로 길이가 2 mm인 맞춤형 회전 셀(직경 약 0.1 μm, 회전 속도 350 RPM)에 넣어 레이저 경로 내 샘플이 여기 펄스 사이에 충분한 암적응 시간을 갖도록 했습니다. 약 100 fs의 레이저 펄스를 사용하여 Ti:Sapphire 레이저 시스템(Spectra Physics, USA)을 증폭시켜 880 nm 파장의 레이저로 시료를 1 kHz의 반복률로 여기시킵니다(NIR의 경우 20 nJ, 가시광선의 경우 100 nJ). 데이터 수집 전에 시료를 약 30분 동안 여기광에 노출시키십시오. 이 과정에서 QA가 비활성화될 수 있습니다(QA 활성이 한두 번 감소할 수 있음). 하지만 이 과정은 가역적이며, 장시간 암적응 후 RC는 서서히 QA 활성을 회복합니다. Helios 분광기(Ultrafast Systems, USA)를 사용하여 -10~7000 ps의 지연 시간으로 과도 스펙트럼을 측정했습니다. Surface Xplorer 소프트웨어(Ultrafast Systems, USA)를 사용하여 데이터 세트를 그룹 해제한 다음 병합하고 표준화하십시오. CarpetView 소프트웨어 패키지(Light Conversion Ltd., 리투아니아)를 사용하여 결합된 데이터 세트를 활용해 감쇠와 관련된 차분 스펙트럼을 얻거나, Origin(OriginLab, 미국)에서 여러 지수를 기기 응답과 합성하는 함수를 사용하여 단일 파장 스펙트럼 변화에 맞출 수 있습니다.
위에서 언급한 바와 같이(53), RC와 주변 LH2 안테나가 모두 결여된 LH1 복합체를 포함하는 광합성 필름을 준비했습니다. 멤브레인을 20 mM 트리스(pH 8.0)에 희석한 다음 광경로가 2 mm인 석영 큐벳에 넣었습니다. 30 nJ 레이저 펄스를 사용하여 -10~7000 ps의 지연 시간으로 540 nm에서 샘플을 여기시켰습니다. Rps.pal 샘플에 대해 설명한 대로 데이터 세트를 처리했습니다.
막은 4°C에서 2시간 동안 150,000 RCF로 원심분리하여 침전시킨 후, 880 nm에서의 흡광도를 측정하고 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 200 mM NaCl 용액에 재현탁시켰다. 막을 4°C에서 어두운 곳에 1시간 동안 2%(w/v) β-DDM 용액에 넣고 천천히 저어주면서 용해시켰다. 시료를 100 mM 트리에틸암모늄 카보네이트(pH 8.0)(TEAB; Merck, UK) 용액에 희석하여 단백질 농도를 2.5 mg ml⁻¹(Bio-Rad 분석)로 맞추었다. 이후 과정은 이전에 발표된 방법(54)을 따랐으며, 50 μg의 단백질을 1%(w/v) 라우르산나트륨(Merck, UK)을 함유한 총 50 μl의 TEAB 용액에 희석하는 것으로 시작했다. 60초간 초음파 처리 후, 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(Merck, UK)을 첨가하여 37°C에서 30분간 환원시켰다. S-알킬화의 경우, 200 mM 이소프로판올 스톡 용액에 10 mM 메틸 S-메틸티오메탄설포네이트(Merck, UK)를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 단백질 분해는 2 μg의 트립신/엔도프로테이나제 Lys-C 혼합물(Promega, UK)을 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 반응시켜 수행하였다. 라우르산계 계면활성제는 50 μl의 에틸 아세테이트와 10 μl의 10% (v/v) LC 등급 트라이플루오로아세트산(TFA; Thermo Fisher Scientific, UK)을 첨가하고 60초간 와류시켜 추출하였다. 상 분리는 15,700 RCF에서 5분간 원심분리하여 촉진하였다. 제조사 프로토콜에 따라 C18 스핀 컬럼(Thermo Fisher Scientific, UK)을 사용하여 펩타이드를 함유하는 하층부를 조심스럽게 흡입 및 탈염 처리했습니다. 진공 원심분리를 통해 건조시킨 후, 시료를 0.5% TFA와 3% 아세토니트릴에 용해시키고, 앞서 설명한 시스템 매개변수를 사용하여 500 ng을 나노플로우 역상 크로마토그래피-질량 분석법으로 분석했습니다.
Rps. palustris 프로테옴 데이터베이스(www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)를 검색하기 위해 단백질 식별 및 정량화를 위해 MaxQuant v.1.5.3.30(56)을 사용합니다. 질량 분석 프로테오믹스 데이터는 PRIDE 파트너 저장소(http://proteomecentral.proteomexchange.org)를 통해 ProteomeXchange Alliance에 데이터셋 식별자 PXD020402로 저장되었습니다.
전기분무 이온화 질량 분석기가 결합된 RPLC 분석을 위해 야생형 Rps로부터 RC-LH1 복합체를 준비했습니다. 이전에 발표된 방법(16)을 사용하여, palustris 세포에서 생성된 단백질 농도는 20 mM Hepes(pH 7.8), 100 mM NaCl 및 0.03%(w/v) β-DDM 용액에서 2 mg ml-1였습니다. (Bio-Rad 분석) 제조사 프로토콜에 따라 2D 정제 키트(GE Healthcare, USA)를 사용하여 침전법으로 10 μg의 단백질을 추출하고, 침전물을 20 μl의 60%(v/v) 포름산(FA), 20%(v/v) 아세토니트릴 및 20%(v/v) 물에 용해시켰습니다. 5 μl를 질량 분석기(Maxis UHR-TOF, Bruker)가 결합된 RPLC(Dionex RSLC)로 분석했습니다. MabPac 1.2×100 mm 컬럼(Thermo Fisher Scientific, UK)을 사용하여 60°C, 100μl/min의 유속으로 분리하고, 85%(v/v) 용매 A[0.1%(v/v) 포름산(FA) 및 0.02%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA) 수용액]에서 85%(v/v) 용매 B[0.1%(v/v) 포름산 및 0.02%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)을 90%(v/v) 아세토니트릴에 용해한 용액]까지의 그라디언트를 적용합니다. 표준 전기분무 이온화 소스와 기본 매개변수를 사용하여 60분 이상 분석하면 질량 분석기에서 100~2750 m/z(질량 대 전하비) 범위의 피크를 얻습니다. ExPASy 생물정보학 리소스 포털의 FindPept 도구(https://web.expasy.org/findpept/)를 이용하여 질량 스펙트럼을 복합체의 소단위에 매핑합니다.
세포는 100ml NF-low(10μMm-2 s-1), medium(30μMm-2 s-1) 또는 high(300μMm-2 s-1) 광 조건에서 72시간 동안 배양되었습니다. M22 배지(황산암모늄을 제외하고 숙신산나트륨을 아세트산나트륨으로 대체한 M22 배지)가 담긴 100ml 스크류 캡 병(23)에서 배양되었습니다. 0.1 마이크론 유리 비드를 1:1의 부피비로 30초씩 5회에 걸쳐 세포에 첨가하여 세포를 용해시키고 5분 동안 얼음 위에서 냉각시켰습니다. 불용성 물질, 파괴되지 않은 세포 및 유리 비드는 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 16,000 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 제거했습니다. 막은 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 용액에서 40/15%(w/w) 수크로스 농도 구배를 사용하여 10시간 동안 100,000 RCF의 Ti 70.1 로터에서 분리되었습니다.
이전 연구에서 설명한 바와 같이, PufW의 His 태그에 대한 면역 검출(16)을 수행했습니다. 간단히 말하면, 정제된 코어 복합체(11.8 nM) 또는 동일한 농도의 RC를 포함하는 막(산화에서 환원 차이 스펙트럼을 빼고 염색된 겔의 로딩과 비교하여 결정)을 2배 희석한 2x SDS 로딩 버퍼(Merck, UK)에 넣었습니다. 단백질은 복제 12% 비스-트리스 NuPage 겔(Thermo Fisher Scientific, UK)에서 분리했습니다. 겔은 Coomassie Brilliant Blue(Bio-Rad, UK)로 염색하여 RC-L 소단위를 로딩하고 시각화했습니다. 두 번째 겔의 단백질은 면역 분석을 위해 메탄올 활성화 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Thermo Fisher Scientific, UK)으로 옮겼습니다. PVDF 멤브레인을 50 mM 트리스-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2%(v/v) Tween-20 및 5%(w/v) 탈지분유 용액에서 차단시킨 후, 항-His 1차 항체(항체 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl 및 0.05%(v/v) Tween-20]을 1:1000으로 희석한 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA)와 함께 4시간 동안 배양하였다. 항체 완충액으로 5분씩 3회 세척한 후, 막을 서양고추냉이 과산화효소(Sigma-Aldrich, UK)가 첨가된 항마우스 2차 항체(항체 완충액에 1:10,000으로 희석)와 혼합하였다. WESTAR ETA C 2.0 화학발광 기질(Cyanagen, Italy)과 Amersham Imager 600(GE Healthcare, UK)을 사용하여 검출하였다(항체 완충액으로 3회 세척 후 5분).
각 염색된 겔 또는 면역분석 레인의 강도 분포를 그리고 피크 아래 영역을 통합하고 ImageJ(57)에서 RC-L(염색된 겔)과 Protein-W(면역분석)의 강도 비율을 계산하여 이미지를 처리했습니다. 이러한 비율은 순수 RC-LH114-W 샘플에서 RC-L과 Protein-W의 비율이 1:1이라고 가정하고 전체 데이터 세트를 그에 따라 정규화하여 몰 비율로 변환했습니다.
본 논문의 추가 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 에서 확인하실 수 있습니다.
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